《代谢工程》PPT课件.ppt

第六章 代谢工程,分子和基因技术发展促成的，提供了全新的合成方法,代谢工程概述,细胞的生命活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化系统构成。 对人类的应用而言，活细胞自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为了积累大量的某种代谢产物，就必须要打破并重建细胞的代谢平衡。,代谢工程是指在全面了解细胞代谢网络及其调控机制的基础上，采用基因工程手段改变细胞代谢系统的关键途径或引入新的反应，从而定向改进产物的生成或者是合成新产品。 代谢工程建立在多学科基础之上，也需要不同角度的结合研究。,代谢工程的组成：一是研究生物代谢途径的控制策略；二是通过生物加工技术在生物体上实现代谢设计策略。 在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种。,改变代谢途径,改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。 改变代谢途径有多种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等。,实例,最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构建，头孢霉素C的合成途径。 青霉素N是头孢霉素合成的中间体。当用顶头孢发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并导入顶头孢中，所得转化子的头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。,头孢霉素C的代谢工程菌的构建,克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF,限速步骤,所得转化子头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。,改变分支代谢途径流向,改变分支代谢途径流向是指提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，亦可提高目的末端代谢产物的的产量。 如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。而为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,高丝氨酸脱氢酶基因,赖氨酸产生菌棒状杆菌,产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L， 苏氨酸产量增加到52g/L， 赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,扩展代谢途径,定义：指在引入外援基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。,转移或构建新的代谢途径,指将催化一系列反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力； 或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞原有无关的两条代谢途径联结起来，形成新的途径，产生新的代谢产物； 或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一位生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。,代谢工程基本过程,代谢工程的应用,提高微生物转化的目标产物得率、产率或生产强度 通过基因改造合成原细胞无法得到的新产物 药物合成 细胞信号传导途径的研究,如何实现代谢工程？,代谢网络理论,代谢网络理论把细胞的生化反应以网络整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又彼此互相协调。 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互作用、相互转化、相互制约的一套完整、统一、灵敏的调节系统。,节点,柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。 弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。 柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象,如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在会给代谢工程的实施带来很大的困难。 如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网络为独立型网络。 一般认为，只有少数分支点处的通量分配比实际影响着产品得率。,代谢通量分析,1 黑箱模型 黑箱模型就是将胞内反应看成是单一反应或者是整个细胞生物基质的变化，并采用物料衡算原理保证细胞内外各元素之间的平衡。在此模型中涉及的元素包括底物、代谢产物和生物基质的元素组成及其一系列进出细胞的流量。,细胞,2 代谢流平衡模型 在黑箱模型的基础上结合代谢网络图，便提出了代谢流平衡模型。根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布。 要得到正确的通量分布，必须清楚地了解细胞内代谢途径，尤其是各个分支点。缺少某一重要的分支或增加某一根本不存在的分支，都可能使求得的通量分布有很大变化。 计算代谢物质量平衡的化学计量方程为：,代谢通量分析的应用,确定胞内代谢途径中各支路的通量分布，确定途径分支点上的通量分配比，判断胞内物质的代谢流向。 识别胞内是否存在某条代谢途径 预测未测量的胞外通量 计算最大理论得率,代谢通量测量技术,测量方法的核心是利用同位素标记 根据代谢物标记强度直接确定 物流平衡与同位素标记代谢物相结合 碳平衡分析结合同位素标记实验,实例,甘油代谢途径最大理论得率计算 厌氧发酵 微氧发酵,甘油,1,3-丙二醇,代谢控制分析,目的在于将代谢系统的变量同其参数联系起来，可以确定代谢通量对酶活性的敏感性。 通量控制系数 浓度控制系数 弹性系数,代谢调控机理,通过调节酶、底物、代谢物等的浓度或活性可以对代谢途径进行调控，该行为可以发生在多个水平。 代谢调控最普遍的形式是酶活性的调节 代谢工程是要通过改变分支点的通量分配来提高产率,通量控制系数的确定方法,直接法 间接法 通过瞬变代谢物的测量 根据动力学模型直接计算 根据大偏差理论计算,代谢网络的控制分析,组控制系数,不同溶解氧条件下代谢网络模型对谷氨酸浓度的预测性能,实线：在线推定的结果,利用代谢网络模型的在线状态预测和控制,利用基因组学和蛋白组学