《发酵工程3上》PPT课件.ppt

第三章 菌种选育与培养,第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求 第二节 工业微生物菌种的选育 第三节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 第四节 种子的扩大培养,第一节 重要工业微生物的分离及菌种要求,微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。,一、工业生产常用的微生物,细菌（bacteria） 酵母菌（yeast） 霉菌（mould） 放线菌（actinomycetes） 担子菌（basidiomycetes） 藻类（algae）,枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等， 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等,单细胞真核生物，常用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等， 用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等,根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等,能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等,通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发,用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻； 可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能,二、微生物工业对菌种的要求,原料廉价、生产迅速、目的产物产量高。 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。 抗杂菌和噬菌体的能力强。 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。,目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：,三、重要工业微生物的分离,分离 是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。,有时可以设计出一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法；也可用特定的分离方法先进行分离，随后再去识别所需的生产菌株。,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,工业微生物分离的程序：,A 采样对象,以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,1、采样,从自然界筛选,以温度适中，雨量不多的秋初为好。 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,B 采样季节,C采样方式,2、增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（1）施加选择压力的分离方法,富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。,3、培养分离,固体培养基的使用 该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。,抗生素产生菌的筛选 抗生素可作为分离步骤中的选择压力,（2）随机分离方法,生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。,多糖产生菌的筛选 可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,4、筛选,采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得到适合于工业生产用菌种。,5、毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,第二节 工业微生物菌种的选育,用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种，因此必须进行菌种选育工作 菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展 通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍 菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等方面也发挥了重大作用 菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求,一、自然选育,在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。 引起自发突变的原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应。 自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。,自然选育的方法与第一节介绍的微生物的分离方法相近，不同之处在于分离和筛选是同步进行的。,宇宙空间的各种短波辐射、自然界普遍存在的一些低浓度诱变物质、微生物自身代谢活动中产生的诱变物质。,四种碱基的酮基（酮式或烯醇式）和氨基（氨基式或亚氨基式）的互变异构。,1. 从自然界分离获得菌株,一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。,2. 从自发突变体中获得菌株,变异是育种的基础。 自然突变是指自然条件下出现的基因变化。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株诱变育种。,二、诱变选育,使用诱变剂进行人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。 诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。 诱变育种的主要环节：,以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高； 用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。,出发菌株的选择,工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent strain）。 一般有三种：,从自然界分离得到的野生型菌株； 通过生产选育，已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变可能性较大； 已经诱变过的菌株，负突变可能性较大。,菌悬液的制备,前培养,诱变,变异菌株的分离和筛选,1、诱变选育的程序,2、诱变育种方案设计,诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。,这些环节是相互联系，缺一不可的。,（1）出发菌株的选择,选择单倍体纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。 不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。 选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。,（2）诱变剂的种类和选择,A、诱变剂,各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、射线、射线、射线和超声波等,直接与DNA发生化学反应：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、氮芥、亚硝酸等 碱基类似物：5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶的类似物 引起移码突变：吖啶类染料,要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。 对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理； 对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。,嘧啶的 5位上溴原子代替甲基后可较多地出现烯醇式的嘧啶。 酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T碱基对变为A:BU，在下一次DNA复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤G配对而出现G:BU碱基对，最后在又一次复制中G和C配对而终于出现G:C碱基对，完成了碱基的置换。,合适的剂量：能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量。 剂量的选择和诱变因素的使用随菌种的不同而异，因此需从工作中总结、摸索来确定。,诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多出现于偏高剂量中。 对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。 因此，目前处理剂量已从以前采用的死亡率9099减低为7080。,各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间,B、影响诱变效果的因素,出发菌株的遗传特性； 诱变剂； 菌种的生理状态； 被处理菌株的预培养条件； 诱变处理时的外界条件等。,微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、融合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子,细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率；对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。,诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养2060min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。,（3）突变的诱发,A、诱变剂接触DNA分子 B、DNA损伤的修复 C、从前突变到突变 D、从突变到突变型,光复活作用 切补修复 重组修复 SOS修复系统 DNA多聚酶的校正作用,（表型延迟：诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上，只有当经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落。）,（4）筛选的方法,A、营养缺陷型(auxotroph)的筛选方法,营养缺陷型菌株的工业应用价值：在直链式合成途径中，营养缺陷型突变株可积累中间产物；分支代谢途径中，可通过解除协同反馈调节而使另一分支末端产物积累。,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,筛选方法,一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。,淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。,（1）抗生素法： 细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。 酵母菌和霉菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。,CM或SM培养基培养过夜，克服表型延迟,（2）菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔34h过滤一次，重复34次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。 （3）差别杀菌法 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。,营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。,二,B、 抗性突变株的筛选,包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性突变株筛选，这些突变型常用来提高某些代谢产物的产量。筛选常用梯度平板法（gradient plate）。,抗药性突变株的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,（5）突变基因的表型,菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。 突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。 在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，使高产基因能在生产规模下得以表达。,三、常规的杂交育种,遗传标记 异核体形成 杂合二倍体的形成 染色体交换和单倍体,四、原生质体融合,1. 标记菌株的筛选,供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。 采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。,2. 原生质体的制备,在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。,影响原生质体制备的因素：,菌体的预处理 菌体的培养时间 酶浓度 酶解温度 酶解时间 渗透压稳定剂,用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。,一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。,一般控制在2040。,充足的酶解时间,对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。,3. 原生质体的融合和再生,融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。 原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。,影响原生质体融合的因素： 菌体的前处理； 菌体的培养时间； 融合剂的浓度； 融合剂作用的时间； 阳离子的浓度； 融合的温度； 融合体系的pH值等。,影响原生质体再生的因素： 菌种自身的再生性能； 原生质体制备的条件； 再生培养基成分； 再生培养条件等。,将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A； 将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：,用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B； 用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。,4. 融合子的选择,融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。 在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。 在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。,5. 灭活原生质体融合技术在育种中的应用,灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。,该方法可以不用遗传标记,五、DNA