《基因工程抗体》PPT课件.ppt

基因工程抗体,（genetic engineering antibody）,随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。,优点,是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构（如Fc片段），从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷（如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果，Fc片段的无效性和副作用）,基因工程抗体的制备过程,首先是获得抗体基因片段，可从B细胞DNA库中筛选；用探针从杂交瘤细胞、免疫脾细胞的DNA库或cDNA库中筛选；或以PCR法直接扩增等。 然后将抗体基因片段导入真核细胞（如杂交瘤细胞）或原核细胞（如大肠杆菌），使之表达具有免疫活性的抗体片段。,目前基因工程抗体有,嵌合抗体（chimeric antibody） 重构抗体（reshaping antibody） 单链抗体（single-chain antibody） Ig相关分子 噬菌体抗体（phage antibody） 全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基因库,（一）嵌合抗体（chimeric antibody）,嵌合抗体是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。 迄今构建的嵌合抗体多为“鼠人”类型，也就是抗体的Fab或F(ab)2来源于鼠类，而Fc片段来源于人类。,嵌合抗体制备过程简介,将小鼠杂交瘤细胞的免疫球蛋白(Ig)VH基因与人Ig的CH基因连接 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 筛选分泌鼠人嵌合抗体的骨髓瘤细胞,所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分泌的抗体特异性和亲和力相同，但减少了抗体中的鼠源性成分,（二）重构抗体（reshaping antibody）,目的：为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量 改造：将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。,本质：实际上也就是在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列，通过这种置换为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。,（三）单链抗体（single-chain antibody）,又称FV分子。 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体蛋白。 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。,优点,这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围的微循环等优点。,（四）Ig相关分子,原理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如毒素），就可创造出一些Ig相关分子,可将有治疗作用的毒素或化疗药物取代抗体的Fc片段，通过高变区结合特异性抗原，连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面，起“生物导弹”的作用。 Byrn构建的“CD4免疫粘附素”即是这一类抗体分子，他是将CD4基因与IgG1 C区在体外重组而表达出的Ig相关分子，它可封闭人HIV gp120蛋白与CD4 T细胞的结合，在治疗人的爱滋病上具有潜在价值。,应用事例,（五）噬菌体抗体（phage antibody）,噬菌体表面展示技术（phage display technology）。 是将已知特异性的抗体分子的所有V区基因在噬菌体中构建成基因库，用噬菌体感染细菌，模拟免疫选择过程，具有相应特异性的重链和轻链可变区即可在噬菌体表面呈现出来。,展望,基因工程抗体由于将抗体基因置于人的操作之下，抗体分子的大小、亲和力的高低、对细胞毒性的强弱，以及是否接上其它有用的分子等都可根据治疗和诊断的要求进行设计，这是杂交瘤技术所不及的，因此有着强大的生命力。 从构建的人和动物抗体基因总文库中筛选和表达针对任一抗原的抗体基因，将结束仅依靠免疫获得抗体的状况。,催化抗体（catalytic antibody）,催化抗体也叫抗体酶（abzyme），是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性 1986年Lerner和Schultz两个研究小组各自独立发表了他们关于抗体酶的第一篇报告以来，抗体酶的研究已取得了相当广泛的成功。,催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。,（二）催化抗体的制备,催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。,在亲和性和结合特异性方面，抗体抗原的相互作用与酶-底物的相互作用相似。,抗体与处于稳定、低能构型的抗原作用，而酶与处于不稳定、高能的过渡态底物结合。酶结合能量帮助打开底物分子的化学键。 抗体酶的结构应该与底物过渡态互补。但这种过渡态往往只存在短时间，所以研究者必须先制备底物过渡态的稳定低能类似物，然后制备抗体酶。,目前制备催化抗体有以下四种方法：,1细胞融合法 2抗体结合位点化学修饰法 3引入辅助因子法 4基因工程抗体技术,1细胞融合法,首先通过化学反应合成反应物的过渡态类似物，这类类似物通常是半抗原，经与载体蛋白偶联，研制针对该过渡态类似物的特异单抗，亦即抗体酶。 这种单抗与反应物的过渡态结合降低了反应的活化能，从而加速该反应的进行。如催化碳酸脂水解的抗体MOPC167即以此法制备。,2抗体结合位点化学修饰法,对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。 游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。,3引入辅助因子法,很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。 用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键。且通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达6104。,4基因工程抗体技术,该技术在抗体酶制备中具有诱人的前景。应用噬菌体抗体展示技术或全套抗体基因库，并辅以计算机模拟，为筛选特定目的高效催化抗体提供了丰富的资源和技术支撑。,（三）催化抗体的应用,用病毒特异蛋白质片段的过渡态模拟物免疫动物，产生能特异水解病毒蛋白质