GDNF-RET双基因脑神经系统修复痪临床实验研究

北京高科医院GDNF-RET双基因脑神经系统修复痪临床实验研究本文作者：孙玉莲 徐庆怀 武玉华 （本文作者单位系中国科学医学院生物神经实验室、解放军第四军医大学神经系、首都医科大学脑科研究院）项目编号：国家星火计划课题攻关DJ201346号关键词: 胶质神经因子(GDNF) 胶质神经因子受体(RET) 多巴胺(DA) 脑性瘫痪 脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)是自受孕开始至婴儿期非进行性脑损伤和发育缺陷所导致的综合症，主要表现为运动障碍及姿势异常，以中脑多巴胺(DA)能神经元变性缺失为主要病理特征。外源性神经细胞因子GDNF和胶质神经细胞衍生营养因子受体RET对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用,可维持交感神经和感觉神经的生存,促进神经细胞的分化,决定轴突的伸展方向，对大脑发育、神经系统生长和功能恢复具有决定性作用，两个基因联合应用成为脑性瘫痪治疗的发展趋势。本实验拟将GDNF、RET基因构建在同一个大鼠脑多巴胺(DA)能神经元载体上, 通过免疫细胞化学荧光染色和免疫组织化学染色技术分别检测双基因在体外培养大鼠质细胞(BMSCs)和大鼠脑中的表达，希望将研究成果转移到人类脑性瘫痪临床治疗。一、实验1.1、材料 ：雌性大鼠10只, 体重200 250 g；鼠抗DA多克隆抗体、兔抗GDNF多克隆抗体、生物素化山羊抗鼠IgM、HT1080细胞检测病毒滴、Promega试剂、HEK29细胞X-gal染色体、RT-PCR检测仪、美国LA-MA显微镜等。1. 2、方法：通过克隆GDNF-RET质粒多克隆位点上GDNF基因的下游，构建一个GDNF-RET双基因真核于大鼠脑多巴胺(DA)神经元表达载体，显微镜下观察酶切反应和DNA测序进行鉴定DA能量变化情况。3、步骤3.1、利用HT1080细胞检测病毒滴度，用病毒上清液直接感染体外培养的骨髓基质细胞，根据SwansonLW的大鼠脑图谱确定皮质与纹状体注射位点坐标，将成年SD大鼠麻醉(6%水合氯醛腹腔注射, 5 mL/kg体重)，注射到纹状体和皮质左右坐标点内, 按1L/min的速度推进, 注射完后留针5 min,灌杀取脑, 做冰冻切片, 进行免疫组织化学染色。3.2、注射病毒上清一侧, GDNF阳性细胞数为438.57 69.12, 对侧为327.36 2.03;注射病毒上清一侧DA阳性细胞数为8.20 4.02, 对侧为0.00 0.00(P0.01)。3.3、Trizol法提取包装后HEK293细胞总RNA, 用于Promega试剂反转录反应, 取1L反转录产物进行PCR扩增。扩增条件为:96 预变性3 min;94 变性30 s, 55 退火55 s, 72 延伸55 s, 共35个循环，最后72 延伸5 min。3.4、反应完毕后取5 L反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对左侧纹状体注射病毒上清、右侧注射PBS的脑切片进行GDNF与DA免疫组织化学染色后,镜下观察到注射病毒上清的纹状体部位GDNF与DA染色均明显强于注射PBS的对侧。3.5、皮质注射的大鼠每只任意取10张染色后脑切片,200X和400X高倍镜下分别计数两侧皮质DA阳性细胞数和GDNF阳性细胞总数并进行t检验, 统计学分析。3.6、HEK29细胞X-gal染色和RT-PCR检测:包装对照病毒的HEK29细胞固定后进行Xgal染色, 显微镜下观察包装效率。3.7、细胞免疫荧光双标染色:细胞经4%多聚甲醛固定, 山羊血清封闭非特异性抗原后, 加入小鼠抗DA多克隆抗体(110000)和兔抗GDNF克隆抗体(1200)11混合液, 4 孵育过夜，激发波长荧光显微镜下观察照相。3.8、找出胶质神经因子(GDNF)、胶质神经因子受体(RET)、多巴胺(DA)之间的相关性，调控增进释放、生长细胞的能力，促进DA的合成，补充脑内DA不足，测试神经细胞功能表达。二、实验结果：通过免疫细胞化学荧光染色和免疫组织化学染色技术分别检测胶质神经因子(GDNF)、胶质神经因子受体(RET)双基因在体外培养大鼠脑多巴胺(DA)和大鼠脑中的表达，结果在HEK293包装细胞和BMSCs中分别同时检测到了GDNF和多巴胺能(DA)和多巴胺(DA)的表达，无论是GDNF、RET还是DA的表达都显著增加。本实验表明，转GDNF或者RET基因都各有局限性, 不能防治兼顾，但在基因GDNF和基因RET同时构建于同一个鼠脑多巴胺(DA)神经元载体上后，三者体内体外都能够同时表达, 此结果为脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)的治疗提供了新的依据。三、前景分析实验结果显示，免疫系统的树突状细胞是免疫系统的守护者, 对于活化免疫反应以辨识及再生多巴胺(DA)细胞中扮演极重要的角色。RET与分子Rap1GAP入胞化的囊泡进入神经细胞核内，入胞后，GDNF因子受体嵌在囊泡中，在胞体内，这些被激活的神经因子受体快速促进机体神经元的营养、存活及神经突触功能，对异常受损神经元、神经组织进行修复激活，促使其达到正常传导功能，提高神经发育值，可以有效改善脑性瘫痪患者的运动障碍、语言障碍、感知障碍等。GDNF、RET双基因在体内体外都可以有效转录与表达，把二者结合起来,则能保护DA多巴胺能神经元, 可防止其进一步退变，同时作用于脑受损神经组织修