SNT 2102.3-2008 食源性病原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备要求.pdf

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 食源性病原体? ? ?检测技术规范 第?部分? 定性检测方法样品制备要求 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 书书书 前?言 ? ? ? ? ? 食源性病原体? ? ?检测技术规范? 共分为四个部分? ? ? ?第?部分? 通用要求和定义? ? ? ?第?部分? ? ? ?仪性能试验要求? ? ? ?第?部分? 定性检测方法样品制备要求? ? ? ?第?部分? 定性检测方法扩增和检测要求? 本部分为? ? ? ? ?的第?部分? 本部分等同采用? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 食品与动物饲料微生物学?食源性病原体? ? ?检测?定性检 测方法样品制备要求? ? 并做了如下编辑性修改? ? ? ?对? 前言? 和? 引言? 进行了修改? ? ? ?对? 规范性引用文件? 的描述按照? ? ?的要求进行了修改? ? ? ?将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代? 如? ? ? ? ? ? ?代替? ? ? ? ? ? ? ? ? ?将附录? ? ? ? ?中的试剂浓度改写为适用于中文的表达方式? ? ? ?将? 警告? 改为? 安全要求? ? 并放置到标准的末尾段? ? ? ?在表 ? ? ?中加入了相应的国家标准? ? ? ?删除了文后的参考文献部分? 本部分的附录 ? 和附录?为资料性附录? 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口? 本部分由中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局? 中华人民共和国山西出入境检验检疫局? 中华 人民共和国天津出入境检验检疫局? 中华人民共和国福建出入境检验检疫局负责起草? 本部分主要起草人? 王海艳? 李卫华? 高旗利? 黄晓蓉? 姚霞? 刘宏? 赵林立? 本部分系首次发布的出入镜检验检疫行业标准? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 引?言 使用? ? ?技术检测食源性病原体常包括以下步骤? ? ? ?样品的均质? ? ? ?增菌和样品处理? ? ? ?核酸的提取? ? ? ?目标核酸扩增? ? ? ?扩增产物检测? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?由欧洲标准委员会? ? ? 食品分析?水平方法技术委员会? ? ? ? ? ? 与食物 产品技术委员会? ? ? ? ? ? 微生物小组委员会? ? 依照? ? ?和? ? ?技术合作协议联合制定? 本部分等同采用? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 为? 食源性病原体? ? ?检测技术规范? 的第?部分? 规定了以获 得质和量均适合定性? ? ?检测的样品或核酸为目的的样品制备要求?附录?列出了食品样品中细菌 增菌的标准方法?附录?通过实例介绍了特定样品的制备过程? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 食源性病原体? ? ?检测技术规范 第?部分? 定性检测方法样品制备要求 ?范围 ? ? ? ? ?的本部分规定了? ? ?样品制备的要求? 用以获得质和量均适合定性 ? ? ?检测的样品 或核酸? 本部分适用于食品中病原体的? ? ?检测? 必要时也可用于饲料? 农产品?环境样品的? ? ?检测? ?规范性引用文件 下列文件中的条款通过? ? ? ? ?的本部分的引用而成为本部分的条款?凡是注日期的引用文 件? 其随后所有的修改单? 不包括勘误的内容? 或修订版均不适用于本部分? 然而? 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本?凡是不注日期的引用文件? 其最新版本适用于本 部分? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?食源性病原体? ? ?检测技术规范?第?部分? 通用要求和定义 ?原则 ? ? ?概要 样品制备方法的目的是获得质和量均适合? ? ?检测的样品或核酸?核酸的质量取决于所提取核 酸的化学纯度? 分子平均长度以及结构完整性?增菌和样品处理结果应以检测到少量的目标微生物并 减少? ? ?抑制物质为目的?采用对核酸完整性破坏程度最低的物理? 化学或生化操作? 以获得适合 ? ? ?扩增的样品或核酸溶液? ? ?增菌和样品处理 可以对不经增菌培养的样品直接进行样品处理? 也可以根据附录?中所列标准或其他适宜标准在 对样品进行增菌培养后再进行处理? ? ?核酸提取 核酸提取的基本原理包括释放细菌中的 ? ? 以及同时或随后去除 ? ? ?抑制物质?附录 ?中给 出了一种? ?提取?纯化方法的示例?本方法仅作为示例? 使用者可以进一步改进以满足不同实验室 的需要? ?通用实验室要求 应按照? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中? ?的规定? 在独立工作区或工作间内对样品进行处理? ?试剂? 仪器和设备 参见本标准附录 ? 和附录?及? ? ? ? ? ? ? ?操作程序 ? ?细菌的增菌和样品处理 ? ? ?增菌 应按照适宜标准中推荐的培养基对食品样品进行增菌培养?也可以使用其他更适合的增菌培养 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 基? 但这些培养基的增菌效果至少不应低于表 ? ?国际?国家标准中培养基的增菌效果?推荐使用表 ? ?中国际标准中的增菌培养基? 这些培养基中含有较少的 ? ? ?抑制物?当无法获得国际标准时? 也 可使用表 ? ?国家标准中的培养基或其他类似产品? 但应尽量避免使用抑制剂含量高的增菌培养基? 对于特殊产品? 应注意抑制竞争性背景微生物的生长? 如? 加入选择性化学物质或抗生素? ? ? ? ?细菌的处理 可以尝试采用最低破坏程度的方法? 如简单的稀释? 离心? 蛋白消化? 过滤? 密度离心? 免疫磁性分离 等?如上述方法无法提取到细菌 ? ? 可使用煮沸? 加入螯合剂或烈性化学试剂? 如? 三氯甲烷和乙醇? 等更为剧烈的方法或使用相应的试剂盒提取?可使用简单的物理方法降低高脂样品中的脂肪成分?可 使用螯合剂降低奶制品中有抑制作用的高钙成分? ? ?核酸提取 ? ? ? ? ?提取 ? ? ? ? ? ?的释放和纯化 可以将几个? ?提取原理结合起来使用?例如? 可以采用下列步骤进行提取? ?用蛋白酶? 如? 蛋白酶? 降解细胞提取物中的蛋白质? 用核糖核酸酶降解? ? ?用有机溶剂? 如? 苯酚和三氯甲烷混合物? 沉淀所产生的肽类物质? 将? ?留在水相? ?在单价阳离子存在的情况下? 用乙醇进一步浓缩纯化? ?溶液? ?通过离心收集沉淀的? ? ? ?经乙醇清洗后? 重新悬于缓冲液中? 如? ? ? ? ? ? ? ?缓冲液或? ? ? ?缓冲液? ? 为了提高? ?的回收率? 在沉淀步骤中可以使用肝糖原? 聚乙二醇? ? ? 或转运? ? ? ? ? 等? ?协同沉淀物?只有不含任何核酸酶活性? ? ?抑制?竞争物质以及任何与被检? ? ?目标片段 同源序列物的 ? ? 协同沉淀物才可以用于? ? ? ?注?使用真空冷冻干燥器对沉淀后获得的? ?沉淀物进行干燥可能造成交叉污染? 可使用细胞热处理方法? 如? 煮沸? ? ? ? 释放 ? ?将样品煮沸后? 冷却? 离心? 取上清液用于 ? ? ?煮沸前进行酶处理? 如? 溶菌酶? 变溶菌素可用于革兰氏阳性菌? ? 再加入蛋白酶进行温育消化? 可 促进细胞裂解?对于具有坚韧细胞壁的细菌? 如? 分枝杆菌属的细菌? ? 需要使用其他方法? 如加入磁珠 剧烈摇动?包括试剂盒在内的其他方法? 当其核酸提取效果不亚于上述方法时? 也可以用于核酸提取? ? ? ? ? ? ?的质和量 ?当检测物中存在足够数量的? ?时? 采用指定方法从指定检测物中提取的用于? ? ?反应的 ? ? 的质和量应具有重复性和再现性?所用方法提取的 ? ? 片段的平均长度应该大于或 等于被测? ? ?产物? ?可通过荧光法或凝胶电泳法评估提取 ? ? 的浓度和纯度?分光光度法可对纯化的 ? ? 进 行定量? ?琼脂糖凝胶电泳并经溴化乙锭染色后根据紫外灯下凝胶中的荧光能快速评估 ? ? 质和量? ?煮沸等核酸制备方法得到的核酸不稳定? 制备后应立即使用? ?应避免对核酸溶液反复冻融? ?应使用适宜的塑料器皿储存低拷贝的核酸? 注?一些试管材料可能吸附核酸? ? ?质控对照 应依据? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中? ?和表?的规定使用质控对照? ?安全要求 本部分在使用过程中可能接触到试剂? 操作和仪器所带来的危害? 文中不再对其使用过程中的所有 安全问题进行陈述? 使用者最好建立安全和健康规定? 并在使用本部分前确定适当的安全限制? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 附?录? ? 资料性附录? 与微生物? 细菌? 增菌有关的标准 表? ?一些微生物? 细菌? 的专用标准 细?菌国际标准?国家标准 沙门氏菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 金黄色葡萄球菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 蜡样芽胞杆菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 产气荚膜梭菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 弯曲杆菌属? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 小肠结肠炎耶尔森氏菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 单核细胞增生李斯特氏菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 大肠杆菌? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 志贺氏菌属? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 附?录? ? 资料性附录? 革兰氏阴性细菌 ? ? ?提取方法 ? ?适用性 本方法适用于用裂解或煮沸方法从革兰氏阴性菌中提取 ? ? ? ?概况 本方法已得到了广泛应用? 并在检测奶粉中的沙门氏菌和碎肉中产? ? ? ?细胞毒素大肠杆菌 ? ? ? 进行的实验室间的协同研究实验中证明了方法的有效性? ? ?原理 方法步骤包括? 离心获得细菌细胞?将细菌细胞洗涤后于? ? ? ?裂解? 离心使细胞壁碎片? 多聚糖和蛋白质沉淀? 获得核酸提取物?通常要先用增菌肉汤对细菌进行增菌? ? ?试剂 ? ? ?洗涤缓冲液 生理盐 水 溶 液 ? ? ? ? 或 磷 酸 盐 缓 冲 液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?仪器设备 除常规实验室设备? 还应具备以下特殊仪器设备? ? ? ? ?微量移液器 ? ? ? ?台式离心机 配有可容纳? ? ? ?微量反应管的转子? 加速度可调至? ? ? ? ? ? ?水浴或加热块 适用于微量反应管? 能够加热到? ? ? ? ? ?振荡器 可使用涡旋混匀器及类似仪器? ? ?操作步骤 ? ? ?概要 增菌之后? 按照? ? ?所述方法提取细菌 ? ? ? ? ?提取步骤 ?取? ?细菌增菌肉汤加入反应管? 于? ? ? ?离心? ? ? ? ? ? ? 弃去上清液? ?将沉淀物重新悬于? ?洗涤缓冲液? ? ? 或水中? 再于? ? ? ?离心? ? ? ? ? ? ? 弃 去上清液? ? 用? ? ? ? ? ?水重新悬沉淀物?于? ? ? ? ? ? 沙门氏菌? 或? ? ? ? ? ? ? 产志贺 氏毒素大肠杆菌? ? ? ? ? 对细菌细胞进行热消化? ?将反应管移至冰浴中使其迅速冷却? ?用力混合裂解物? 如? 使用振荡器? ? ? ? ? ? ?在? ? ? ? ?条件下? 于? ? ? ?离心? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 ? 沙门氏菌? 或? ? ? ?离心? ? ? ? ? ? ?将上清液移入新的微量反应管? 当对照实验表明核酸提取物中存在? ? ?抑制物质? 应在用于 ? ? ? 反应之前对其进行纯化?也可 以选用市售的核酸提取纯化试剂盒并按试剂盒使用说明书进行操作? 以此替代热处理和纯化步骤? ? ? ?方法确认 本方法已经得到广泛应用? 是分子生物学的基本方法?而且本方法已经在协同实验中得到了确认? ? ? ? ?年? 德国标准化机构? ? ? ? 食源性微生物? ? ?检测? 工作组组织了一次实验室间比对测试? ? ?个实验室参与了测试? 每个实验室收到? ?个样品?样品材料为低脂奶粉?对部分奶粉样品人工接 种了? ? ? ? ? ?的沙门氏菌?在提取? ?前? 实验室对样品进行了以下处理? 将? ?样品加入到 ? ? ? ?非选择性增菌液中? ? ? ? ?黄绿? ? ?培养? ?取? ?该增菌液进行核酸提取?用? ? ? 方法对提取核酸进行检测?总共分析了? ? ?个样品? 发现?个样品为假阴性?个样品为假阳性? ?个 样品存在? ? ?抑制情况? ? ? ?年? 德国联邦消费者保护和兽医卫生学会? ? ? ? 食源性微生物的 ? ? ?检测? 工作组遵照德国联邦食品法第? ?条的规定组织了一次协同研究? 对本方法进行了确认? ? ?个实验室参与了研究?每个实验室均收到了由两种基质制备的? ?份碎肉样品?在每个实验室的样 品中? 有?份样品接种了已知的? ? ? ? ?菌株? 接种量为? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?碎肉?其他杂 菌数量在? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?之间? 有时更高一些? 由于运输的缘故? ?样品?由同一种基质制备? 另外?个样品自然带有? ? ? ?菌株?所有实验室对这些样品的检出率均为? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 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