疫组织化学染色sp技术.ppt

武汉大学病理教研室,免疫组织化学技术的定义,免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。,武汉大学病理教研室,免疫组织化学的应用,IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。,武汉大学病理教研室,实验名称,链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法) 检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达,武汉大学病理教研室,S-P法原理示意图,过氧化物酶,链酶亲和素,生物素,生物素化二抗,特异性一抗,待测抗原,武汉大学病理教研室,免疫组织化学基本实验流程,武汉大学病理教研室,具体步骤如下： 1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 2所有组织均采用微波修复抗原； 3室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 4滴加50l过氧化物酶阻断液（试剂A），37湿盒孵育 10min； 50.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 6滴加非免疫性动物血清（试剂B），37湿盒孵育 10min；,武汉大学病理教研室,7甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 8滴加生物素标记的二抗（试剂C），37湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 9滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37湿盒孵育 15min，甩去多余液体； 10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染； 11常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。,武汉大学病理教研室,实验流程中的注意事项,内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染,武汉大学病理教研室,染色前处理 取材、脱水、浸蜡,组织及时固定 固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛 常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm,武汉大学病理教研室,染色前处理 预防脱片,常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度,武汉大学病理教研室,染色前处理 包埋与切片,包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62 切片：厚度 3-4m 烤片：温度60，时间1小时；或602小时（迈新）；或60过夜,武汉大学病理教研室,染色前处理 切片保存,切片不宜长时间在常温下保存,武汉大学病理教研室,染色前处理 脱腊,原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开,武汉大学病理教研室,实验操作中的应用,抗原修复 实验操作中的注意事项,武汉大学病理教研室,抗原修复,影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1）酶消化法 2）加热法（高压法水煮法微波法） 抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）,武汉大学病理教研室,内源性过氧化物酶的灭活,存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞 消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟,武汉大学病理教研室,血清封闭,目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用,武汉大学病理教研室,冲 洗,一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20,武汉大学病理教研室,一抗孵育时间及抗体选择,应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37 1-2 小时或 4 冰箱过夜,武汉大学病理教研室,检测及显色系统,一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。如SP、LSABC、ABC等 显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测,武汉大学病理教研室,显色系统,常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT-蓝紫色,武汉大学病理教研室,复 染,原则：注意两者之间对比，突出阳性信号,武汉大学病理教研室,实验对照设计,原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照,武汉大学病理教研室,结果分析,1.特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。 2.染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，