血浆循环MicroRNA提取检测及其在冠心病的表达.ppt

,血浆循环MicroRNA提取检测及其在冠心病的表达,郑志伟 劳海燕 余细勇 林秋雄 朱杰宁 王玲 孙硕 陈纪言 钟诗龙 广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所,讲述目录,简述血浆循环miRNA提取检测的方法,采用前述建立的方法，在25例冠心病患者和30例健康对照中检测miRNA的表达情况。,在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制,研究背景,MicroRNA是生物体内长度约为2023个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。 最近研究发现血液循环中也存在miRNA，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。,Solexa Whole Genome Sequencing,miRNAs (21-23nt) were most abundant sequences in serum RNAs,Chen et al. 2008 Cell Res.,血浆循环miRNA的表达 预测?生物标记物？,我们的设想,我们的研究工作,研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检测的方法，并且检测血浆miRNA在冠心病人中的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后的生物标记物。,血浆miRNA提取检测基本流程,血浆循环miRNA提取方法,血浆miRNA 的提取,第四步,晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓度，保存,第一步,ProteinK 消化，Trizol LS和氯仿对血浆进行提取,第三步,离心，取得RNA沉淀，70%乙醇洗涤,第二步,异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉淀,血浆循环miRNA的检测原理,二、miRNA提取方法学的考察（一）,1、采用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率：,2、has-miR-16的累加实验 采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比较提取方法的有效性。,二、miRNA提取方法学的考察（二）,三、检测miRNA在两组人群中的表达差异,Coronary artery heart disease （CHD） 25例,Healthy contron 30例,3.1、研究的一般资料年龄,3.2、研究的一般资料性别,3.3、血浆循环has-miR-126的表达量,3.4、血浆循环has-miR-16的表达量,四、进一步的机制探讨,1、培养人心肌细胞AC16，进行miR-126 inhibitor 的转染，Q-PCR检测miR-126和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。 2、Tunel 检测心肌细胞凋 亡情况。,四、Q-PCR检测VEGF的表达结果,VEGF有促进血管生成的作用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一步的研究。,三、TUNEL凋亡结果分析（一）,图 1 AC16 细胞-正常 A：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）； D：B 和 C 的重叠图,三、TUNEL凋亡结果分析（二）,图 3 AC16 细胞转染 mir-126 inhibitor A：细胞形态； B：Tunel； C:DAPI 染色（核定位）； D：B 和 C 的重叠图,四、本文结论：,结论：采用Trizol LS提取血浆总RNA的方法可行，miRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsa-miR-126表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体