N-乙酰半胱氨酸治疗 D-氨基半乳糖诱导猪急性肝衰.doc

精品论文大集合n-乙酰半胱氨酸治疗 d-氨基半乳糖诱导猪急性肝衰竭对血氨、内毒素和细胞炎症因子的影响研究1任锋 1，2，丁美 1，赵军 1，张晶 1，陈煜 1，武志明 2，段钟平 11 首都医科大学附属北京佑安医院人工肝治疗和培训中心，北京（100069）2 北京市卫生局肝炎研究所，北京（100069）email：摘要：目的探讨 n-乙酰半胱氨酸治疗 d-氨基半乳糖诱导猪急性肝衰竭对肝脏功能和炎症因子的影响； 方法 随机将 14 只雌性中国实验小型猪分为急性肝衰竭组（6 只）和药物 治疗组（8 只）；急性肝衰竭组和药物治疗组分别应用 d-氨基半乳糖（1.2g/kg）静脉滴注制 备药物性急性肝衰竭动物模型；药物治疗组给予 n-乙酰半胱氨酸治疗，急性肝衰竭组同期 给予相同剂量的生理盐水；分别采用测定动物血氨、血浆内毒素以及血清中肿瘤坏死因子-、 白介素-1 含量。结果药物治疗组和急性肝衰竭组相比，血氨和炎症细胞因子 tnf-、il-1 水平在 24 和 48 时间有明显改善， 在 12 和 60 小时没有显著性差异；内毒素水平在 12 小时 有明显改善，但 12 小时后没有显著性差别。结论 nac 可改善 d-氨基半乳糖诱导的猪急性 肝衰竭肝脏功能，使血氨血症和内毒素血症得到一定改善，可抑制炎症反应的快速发展，稳 定机体的内环境。关键词：n-乙酰半胱氨酸；肝衰竭；血氨；内毒素；细胞炎症因子肝脏功能衰竭（liver failure，lf）是临床上十分常见的由各种原因（病毒、酒精、药物 及许多代谢性疾病）所致的临床综合征，欧美国家以药物（如对乙酰氨基酚）为主，我国则 以病毒（主要是乙型肝炎病毒）为主。n-乙酰半胱氨酸（n-acetylcysteine, nac）是细胞内 还原型谷胱甘肽（gsh）的前体，具有广泛的生物学效应。目前在我国不同原因引起的急性 肝功能衰竭均可见到，因此根据乙酰半胱氨酸在抗氧化、解毒、改善微循环、免疫调节等方 面的作用，我们采取与人类各项生理、生化指标比较接近的大型动物猪为研究对象，应用 nac 治疗以 d-氨基半乳糖诱导建立的急性肝衰竭动物模型1，以观察 nac 治疗非对乙酰氨 基酚引起的急性肝衰竭的效果以及药物作用机制。本文在前期研究结果2的基础上进一步谈 讨 n-乙酰半胱氨酸治疗猪药物性肝衰竭对血氨、内毒素和细胞炎症因子的影响。1. 材料和方法1.1实验材料中国实验小型猪（五指山小型猪系近交系）14 只，雌性，78 月龄，体重在 1825 公斤之间，购自中国农业科学院畜牧研究所，饲养于首都医科大学动物中心的标准实验环境 中。nac 由杭州民生药业集团有限公司提供。1.2急性肝衰竭动物模型的建立动物采用盐酸氯胺酮 10mg/kg，安定 10mg 肌肉注射实施基础麻醉并以 10%丙泊酚缓慢 静点维持麻醉状态，经右侧颈外静脉插入大口径双腔中心静脉导管。静脉注射 d-氨基半乳 糖（给药剂量为 1.2g/kg），于 10 分钟内快速输入动物体内。1 本课题得到北京市教育委员会科技发展计划项目(km200610025030)的资助。- 3 -1.3动物分组和治疗给药方法中国实验小型猪 14 只动物随机分为 2 组：急性肝衰竭组（6 只）和药物治疗组（8 只）； 药物治疗组于静脉导管滴注 d-氨基半乳糖后 6 小时，24 小时，48 小时分别给予 nac 150 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg 进行治疗；急性肝衰竭组同期给予相同剂量的生理盐水；1.4观察指标1.4.1肝脏功能指标 alt、ast、tbil 的检测以 d-氨基半乳糖给药前为 0 小时、给药后 12 小时、24 小时、48 小时、60 小时，采血5ml 进行生化常规指标检测，检测的肝功指标主要有谷草转氨酶（alt）、谷丙转氨酶（ast）、 总胆红素（tbil）。1.4.2血氨和内毒素的检测两组研究对象于 d-氨基半乳糖给药前为 0 小时、给药后 12 小时、24 小时、48 小时、60 小时，分别留取 2 ml 静脉血进行血氨和内毒素的检测。将全血置于专用瓶内摇匀后测定 其血氨浓度，具体操作按照试剂说明步骤进行；血氨分析试剂盒名称为 ammonia test kit ，仪器及试剂盒购自日本 arkray factory inc。血浆中的内毒素测定应用内毒素鲎试 验试剂盒，采用鲎试剂的合成基质偶氮显色法原理，操作过程中使用的试剂和器材和操作步 骤严格遵照试剂盒说明书要求进行。1.4.3细胞因子 tnf-、il-1 的检测以 d-氨基半乳糖给药前为 0 小时、给药后 12 小时、24 小时、48 小时、60 小时，留取 静脉血标本 2000 转/min 离心 10 分钟后，提取血清用于检测细胞因子 tnf-、il-1。应用 酶联免疫吸附实验方法（elisa）进行检测，酶联板包被的分别为猪的特异性 tnf-、il-1 单克隆抗体。elisa 方法具体步骤按照说明书操作步骤进行。1.5 统计学方法各检测指标的数据均采用均数标准差表示，采用 spss11.5 统计学软件进行数据处理， 两组之间各个时间点治疗前后的比较应用独立样本比较的秩和检验，p 0.05 为有统计学意 义。2. 结 果2.1nac 治疗对 alt，ast 和 tbil 的影响急性肝衰竭组和药物治疗组动物给予 d-氨基半乳糖后肝功能损伤均呈现进行性加重， 但治疗组与对照组相比，治疗组动物在给予 nac 治疗后，血清谷丙转氨酶，谷草转氨酶、 总胆红素下降，在 12，24 和 48 小时大部分时间点差异有统计学意义，但 60 小时时间点则 很少有差异统计学意义（如表 1 所示）。表 1 急性肝衰竭组和药物治疗组不同时间点 alt, ast 和 tbil 测定值组别时间谷丙转氨酶（u/l）谷草转氨酶（u/l）总胆红素（umol/l）急性 肝衰竭组药物 治疗组12 小时89.523.5247.337.913.12.524 小时242.630.5900.748 小时1217.368.42061.9101.586.210.560 小时1826101.22573.0120.8197.823.412 小时77.218.5*304.3*24 小时211.134.4*1349.6120.3*32.55.948 小时1069.148.71517.354.8*79.710.7*60 小时168154.11754.149.1*172.535.1注：* 治疗组与对照组治疗前后各时间点比较具有显著性差别（p0.05）；2.2nac 治疗对血氨和内毒素的影响研究结果表明，急性肝衰竭组和药物治疗组给予 d-氨基半乳糖后血氨和内毒素水平明 显升高；药物治疗组给予 nac 治疗后与急性肝衰竭组相比能有效降低血氨和内毒素水平： 血氨在 24 小时和 48 小时有显著性差异（p0.05），内毒素在 12 小时和 24 小时有显著性差 异（p0.05），如图 1 所示。图 1 急性肝衰竭组和药物治疗组学血氨和血浆内毒素水平动态变化趋势；a 血氨水平动态变化；b 血浆 内毒素水平动态变化2.3nac 治疗对 tnf-, il-1 影响给予 d-氨基半乳糖后，急性肝衰竭组和药物治疗组随着时间延长，细胞因子 tnf-， il-1 均呈升高趋势。药物治疗组 tnf- 水平在 12，24，48 时间观察点与急性肝衰竭组相 比均有下降， 并且差异均有显著性意义（p0.05）；药物治疗组 il-1 水平在 12，24，48，60 时间观察点与急性肝衰竭相比均有下降， 12 小时和 24 小时 il-1 水平差异具有显著性 意义（p0.05）（如图 2 所示）。图 2 急性肝衰竭组和药物治疗组学血清肿瘤坏死因子-和白介素-1 水平动态变化趋势；a 血清 tnf-水平动态变化；b 血清 il-1 水平动态变化；3. 讨 论乙酰半胱氨酸( acetylcysteine，nac)是一种巯醇化合物，其化学式为 c5h9no3s，分子 量为 163.2。nac 是细胞内谷胱甘肽（gsh）的前体，具有广泛的生物学效应：nac 可 提高机体内谷胱甘肽（gsh）含量，半胱氨酸上的巯基是谷胱甘肽活性基团，gsh 具有解 毒、抗氧化等多种重要功能。nac 作为小分子物质，易于进入细胞，脱乙酰基后成为 gsh 合成的前体，促进 gsh 的合成，提高组织内 gsh 含量，增强组织的抗自由基及抗药物、毒 物损伤的能力；nac 的抗生物氧化作用 nac 分子中含有活性巯基（sh），可对抗不同 原因所致的组织氧化损伤。对体内氧自由基（超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等）具有明 显的拮抗作用；由于 nac 易进入细胞内，对能透过细胞膜与多种细胞成分（如蛋白质、dna、 氨基酸等）反应、导致肝细胞损伤坏死的氧自由基（(h202、-oh）具有抑制、清除作用。 nac 在体内能作为一氧化氮分子载体并增加 no 的生物利用度，发挥 no 生理效应，促进 收缩的微循环血管扩张，有效增加血液对组织氧输送和释放，纠正组织缺氧，防止细胞进一 步坏死，降低多器官功能衰竭的发生率，从而提高器官衰竭的存活率。除此以外，nac 具 有预防 dna 损伤、调整基因的表达和信号转导的功能，还具有抗细胞凋亡、抗血管生成、 抑制恶性肿瘤发展等作用35。由于我国重型肝炎最常见的病因是由肝炎病毒引起，其中 80以上是由 hbv 感染引起， 而在慢性肝炎或肝硬化基础上发生慢性重型肝炎相当常见。关于 nac 在慢性重型肝炎中的 应用国内外已有初步研究，结果显示该药物对重型肝炎的治疗有一定的疗效68。国外临 床研究证明静脉应用乙酰半胱氨酸不仅是治疗醋氨酚过量引起的肝衰竭，对其他病因引起的 肝衰竭也显示良好疗效。因此根据乙酰半胱氨酸的解毒、抗氧化、改善微循环等作用，研究 其对非醋氨酚引起肝衰竭的治疗作用。本次研究结果表明，急性肝衰竭组动物血清 alt、 ast 和 tbil 水平明显升高, 病理学也同时证实有严重肝损伤表现2。研究结果显示 nac 对 衰竭的肝脏功能恢复起到一定的作用：药物治疗组在给予 nac 后，与急性肝衰竭组相比， 肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素在 12，24，48 小时明显下降。在急性肝衰竭的致病机理中，细胞因子发挥着重要的作用。tnf- 是一种具有广谱生 理和病理效应的细胞因子，主要由单核和巨噬细胞分泌；低水平的 tnf- 是肝细胞生长分- 3 -化与再生所必需的调节因子，高水平的 tnf- 可以与细胞膜上 tnf 受体结合，激活caspase-3，诱发肝细胞凋亡，引起炎症细胞浸润及肝组织坏死，是肝衰竭的重要病理机制； 因此 tnf- 是造成肝细胞损伤的主要因子，是机体炎症反应和一系列病理生理过程的重要 介质，与肝细胞炎症、坏死及病情发展密切相关9,10。il-1 是一种来源广泛的多功能细胞 因子, 参与多种炎症反应, 促进组织损伤；il-1 能诱导其他炎症细胞因子、趋化因子、黏附 分子等的合成，是局部和全身炎症反应中起重要作用的促炎因子之一；除直接作用外，il-1 还可通过与其他促炎症因子的共同作用，导致所谓“炎症级联效应”的产生11,12。研究结果表 明，急性肝衰竭动物的血清 tnf-、il-1 水平显著升高。药物治疗组经 nac 治疗后 tnf-、 il-1 水平在每个时间观察点与对照实验组相比均有下降，治疗前后细胞因子水平差异显著， 但在整个观察时间内，无论是对照实验组和治疗实验组，细胞因子都是逐渐升高。该结果说 明 nac 治疗可以减少体内 tnf-、il-1 炎症细胞因子的生成，抑制炎症反应的快速发展， 稳定机体的内环境，减轻肝脏损伤，为肝细胞的再生、修复提供条件。在这里需要指出的是，从急性肝衰竭组和药物治疗组之间的肝功能指标、血氨、内毒 素以及炎症细胞因子进行比较时发现，在 24 小时和 48 小时观察点时治疗组和对照组的差别 一般具有显著的统计学意义，这种现象提示 48 小时以后，实验对象的肝脏功能随着肝衰竭 的进展发生了急剧的变化，这也提示我们在治疗临床急性肝衰竭患者时，应早发现，早治疗， 以保证达到良好的治疗效果。综上所述，nac 作为细胞内谷胱甘肽的前体，一种含有巯基的抗氧化剂，对非醋氨酚 引起的急性肝功衰竭同样具有一定的疗效：改善肝脏的一般状况和机能，并且可以抑制炎症 细胞因子的生成，抑制炎症反应的快速发展，在一定程度上为肝脏功能的恢复提供有益的帮 助。参考文献1李亚明,张晶,赵军等. 急性肝功能衰竭动物模型的建立. 肝脏,2006,11(3):175-177.2乔玲,任锋,张培豪等. n- 乙酰半胱氨酸治疗猪急性肝衰竭的作用. 传染病信息,2007,20(3): 155-157.3demols a,van laethem j l,quertinmont e,et al. n-acetylcysteine decreases severity of acute pancreatitis in mice. pancreas, 2000, 20 (2): 161-169.4zhang h, spapen h, nguyen dn, benlabed m, buurman wa, vincent jl: protective effects ofn-acetyl-l-cysteine in endotoxemia. am j physiol, 1994, 266(8): 1746-1754.5aruoma o,halliwell b,hoey b m,et a1.the antioxidant action of n-acetylcysteine:its reaction with hydrogenperoxide,hydroxylradical,superoxide,andhypochlorousacid.freeradicbiol med,1989,6(6):593-597.6harrison p, wendon j, williams r. evidence of increased guanylate cyclase activation by acetylcysteine in fulminant hepatic failure. hepatology, 1996, 23 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