[精品论文]DLL4 siRNA 对缺氧血管内皮祖细胞和脉络.doc

精品论文dll4 sirna 对缺氧血管内皮祖细胞和脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管管 腔形成的影响5何花，李斌（华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，武汉 430030） 摘要：【目的】 delta 样配体 4 (dll4)是 notch 信号通路血管内皮特异性配体，在调节生理 及病理性血管形成中起重要作用。有研究表明 dll4-notch 信号通路受缺氧调节，可通过抑 制血管分支形成促进血管成熟抑制过度血管化。脉络膜新生血管(cnv) 是一种病理性新生10血管，已知缺氧在其形成中起着重要作用。本实验旨在研究 dll4 在脉络膜新生血管形成中 的作用和机制。【方法】 用 200 mol/l cocl2 造成体外细胞化学性缺氧，以探究 dll4 对 缺氧条件下 cnv 形成过程中的主要参与细胞血管内皮祖细胞（epc）和脉络膜-视网膜内 皮细胞 (rf/6a 细胞) 生物学功能的影响。dll4 sirna 转染细胞后, 利用 rt-pcr, real-time pcr 和蛋白印迹技术研究缺氧条件下 rf/6a 细胞中 dll4 和其下游主要基因 hes1，hey115的 mrna 和蛋白表达变化。并进一步研究 dll4 sirna 对缺氧下 epc 和 rf/6a 细胞参与新 生血管形成的生物学功能（包括细胞增殖，移行以及管腔形成）的影响。实验设立三组对照：分别为无转染的空白对照、转染试剂对照及 scrambled 阴性对照。【结果】缺氧导致体外 rf/6a 细胞中 dll4 表达上调。转染 dll4sirna-duplex 1 后，dll4 mrna 的表达水平较 scrambled 阴性对照组下降 91.4% ，其蛋白表达亦相应减少，而三个对照组间 dll4 表达无20明显差异。 此外，缺氧条件下转染 sirna-duplex 1 后，rf/6a 细胞中 dll4-notch 信号通 路下游的 hes1 和 hey1 基因的 mrna 表达较 scrambled 阴性对照组分别下降 75.1% 和86.3%。进一步研究发现, dll4 低表达可促进缺氧下 rf/6a 细胞增殖，导致进入细胞周期 s期。dll4 sirna 可促进缺氧下 epc 和 rf/6a 细胞移行及血管管腔形成(p 0.05)。【结论】dll4 是新生血管分支形成及血管出芽的负向调节因子。缺氧条件下 dll4 信号途径在血管25内皮祖细胞和脉络膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管管腔形成中发挥着重要作用，dll4 可能成为脉络膜新生血管疾病治疗的新靶点。 关键词：dll4；sirna；脉络膜新生血管；血管内皮祖细胞；脉络膜-视网膜内皮细胞；缺 氧；30effect of dll4 sirna on proliferation,migration and tube formation of endothelial precursor cells and choroid-retinalendothelial cells under hypoxic conditionshe hua, li bin(department of ophthalmology,tongji hospital affiliated to tongji medical college,huazhong35university of science and technology, wuhan 430030)abstract:【objective】dll4 (delta-like 4) is an endothelium specific notch ligand and has beenshown to function as a regulating factor during physiological and pathological angiogenesis. choroidal neovascularization (cnv) is a pathological form of angiogenesis in which hypoxia is thought to play an important role. however, the role of dll4 in the development of cnv is still40poorly understood. 【methods】 the study utilized chemical hypoxia induced by 200m cocl2 toobserve the expression of dll4 in endothelial precursor cells and choroid-retinal endothelial cells(rf/6a cells) which are the primary cells involved in cnv. after transfection of a dll4 sirna, mrna and protein expression of dll4 and key downstream genes, including hes1 and hey1, in hypoxic rf/6a cells were investigated by rt-pcr, real-time pcr, and western blot analysis.基金项目：教育部新教师基金项目（基金编号 20090142120068）作者简介：何花，女，副教授，副主任医师，研究方向：眼脉络膜新生血管的基础研究. e-mail:- 15 -45the effects of the dll4 sirna on the biological function of hypoxic endothelial precursor cells and rf/6a cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and, tube formation,were investigated. 【results】 the results in vitro showed that hypoxic conditions lead toupregulation of dll4 expression in rf/6a cells. after transfection, sirna-duplex1 targetingdll4 depleted the dll4 mrna levels by as much as 91.4 compared with the scrambled50sirna control, and dll4 protein expression was similarly effected. in addition, after transfection of hypoxic rf/6a cells with the dll4 sirna-duplex1, the mrna levels of hes1 and hey1,which function downstream of dll4-notch signaling, were lowered by 75.1 and 86.3,respectively, compared with the scrambled sirna control. furthermore, knockdown of dll4 expression significantly promoted the proliferation of hypoxic rf/6a cells and led to their arrest55in the s phase of the cell cycle. migration and tube formation of hypoxic endothelial precursor cells and rf/6a cells were significantly induced by the dll4 sirna, compared with thescrambled sirna (p 0.05). 【conclusion】dll4 functions as a negative regulator of angiogenicbranching and sprouting. based on our results, dll4 signaling appears to play an essential role in the biological behavior of endothelial precursor cells and choroid vascular endothelial cells under60hypoxia. as such, dll4 may represent a novel target for cnv therapy in the future.keywords: dll4; sirna; choroidal neovascularization; endothelial precursor cells; choroid- retinal endothelial cells; hypoxia0引言65血管新生是指在生理或病理条件下从已有的血管发展而形成新的血管，此过程包含了内 皮细胞和内皮祖细胞的增殖，移行以及血管管腔形成等重要环节。脉络膜新生血管合并年龄 相关黄斑变性是发达国家 60 岁以上人群视力不可逆性丧失的主要原因。其主要特征为脉络 膜新生血管通过 bruch 膜侵及视网膜色素上皮或视网膜下1,2。脉络膜新生血管发病受多种因素控制，机制复杂。目前研究表明缺血缺氧在其形成过70程中起重要作用。而 hif-1 和血管内皮生长因子 vegf 是缺氧条件下 cnv 的主要因子3-7。 过去的几十年里，cnv 治疗重点为抑制 vegf 信号通路，但其疗效有限，很少有新生血管 永久退化，往往数月后新生血管重新生成8。这就提示临床抗新生血管治疗亟需新的靶点或 方法。delta 样配体 4 是生理及病理血管过程中 notch 信号通路的特异性配体。与 hif-1 和75vegf 相似，亦是缺氧调节基因。目前研究表明 dll4-notch 信号通路是新生血管出芽的重 要途径9-11。dll4 的表达可抑制在血管生成中活跃的顶细胞，dll4-notch 信号通路通过抑 制血管分支形成，促进血管成熟来抑制新生血管过度形成12-17 。更有趣的是，在体阻滞 dll4-notch 信号通路可促进过度但无功能新生血管形成以达到阻止肿瘤生长的目的。因此， dll4-notch 信号通路提供了有别于目前治疗方案的血管靶向分子路径18,1980在 cnv 动物模型中, rbp-j-介导的 dll4-notch 信号通路在血管新生中起重要作用 20。尽管 dll4 是肿瘤生长过程中调节血管新生的靶点，但是其对 cnv 抑制作用尚不清楚， 尤其是对脉络膜微血管内皮细胞的生物学功能知之甚少。为了解 cnv 形成中 dll4 的表达及作用，我们体外用血管内皮祖细胞和猴脉络膜-视网 膜内皮细胞(rf/6a 细胞)来研究缺氧条件下其 dll4 表达变化。更进一步用 dll4 sirna 沉85默 dll4 表达来研究 dll4 对缺氧下血管内皮祖细胞和 rf/6a 细胞增殖，迁移以及管腔形 成的影响。1研究方法1.1 细胞培养及缺氧方案取 200ml 人外周血，用 ficoll 液分离人 pbmnc，用 ebm-2+1%fbs 约 20ml 重悬，分90别加入 4 块预包被纤维连接蛋白（fn，5ug/cm）的 100mm 培养板。置于 co2 培养箱内培 养 4-6h 后，吸去悬浮细胞（为增加细胞纯度，可用胶头滴管清清吹洗培养平面），每板加 入 5-8ml egm-2 mv bulletkit 培养基培养，隔天换液，除净悬浮细胞，观察细胞形态。选取 生长状态良好的原代培养第 5 天的 epc（day5）用于后续实验。从上海中科院细胞库获取脉络膜-视网膜内皮细胞系 (rf/6a 细胞),在含 10%胎牛血清95(gibco), 100 u/ml 青霉素,100 g/ml 链霉素的 dmem 培养基培养。血管性血友病因子(santacruz biotech., usa)免疫染色鉴定。细胞缺氧处理之前给予含 1%胎牛血清的 dmem 培养。分别培养 1, 6, 12 及 24 小时后加入 200mol/l cocl2形成缺氧环境。转染组给予 sirna 转染 48 小时后加入 200 mol/lcocl2继续培养 12 小时。1001.2 分离 rna按制造商说明用 trizol (invitrogen, usa)提取培养细胞全部 rna。75%乙醇洗涤后放入20 l 无核酸水中。分光光度仪测定 rna 的浓度及纯度。od1.3 逆转录 pcr 与实时定量 pcr260/ od280= 1.9 - 2.0。105110利用 cdna synthesis kit (revertaid first-strand cdna synthesis kit, canada)对 rf/6a 细 胞全部 rna 行逆转录。由中国上海 genechem 公司对 dll4, hes1, hey1 and gapdh 进行 引物设计及合成。引物序列如表 1 所示。表1 pcr引物序列tab. 1. primers used for pcr analysisgeneprimer sequenceproduct size. bp115120dll4 forward primer: 5-acggggacctactgtgaacg-3 337reverse primer: 5-gcagcaccagcagcaccgccag-3hes1 forward primer: 5-ctaccccagccagtgtcaaca -3 271reverse primer: 5-aacgcagtaccggcgagtg -3hey1 forward primer: 5-cggcaggagggaaaggcta -3 248reverse primer: 5-cgggtgatgtccaaaggcag -3gapdh forward primer: 5-accacagtccatgccatcac -3 452reverse primer: 5-tccaccaccctgttgctgta -3125取 25ul 进行逆转录-pcr。95c 5 min 变性后 95c30 s, 58c 45 s,72c 30 s 35 个周期 ，72c，3 min 产物延伸。从 25 l pcr 反应产物中取出 5ml 放入 2%琼脂糖凝胶中紫外光下观 察。利用 abi prism 7500 系统 (biosystems, usa)，用 sybr green (takara bio., japan)对 dll4、hes1 以及 hey1 mrna 表达水平进行实时定量 pcr 检测。每个 cdna 样本放130135140145150155160165入含 1 l cdna，12.5 l sybr green rt-pcr master mix (2), 以及 1 l 引物 (10 mol/l)的 25 l 容器，重复检测三次。实时定量 pcr 检测步骤包括 95c 10 min 酶反应，95c15 s 变性及 60c1 min 复性共 40 周期，最后 72c20 min 延伸。利用相对 ct (ct)计算基因表 达相对含量(biosystems 提供), 公式如下: 倍数改变=2-ct, ct 表示信号达到阈值时扩增循 环次数。1.4 蛋白印迹技术rf/6a 细胞放入 6 孔板，48 小时转染后继续缺氧培养 12 小时。pbs 冲洗 2 次后每孔给 予 100 l 裂解缓冲液，4c 冰浴 5min。依据生产商提供说明，用 bca protein assay kit (tianlai, china)测量分析蛋白表达水平。每个蛋白样本 100c 加热 10 min 后载入 5%sds-聚丙烯酰胺 凝胶，冰转移缓冲液(25 mmol/l tris, 192 mmol/l 糖胶, 100%冰乙醇)中转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂乳封闭，一抗为抗 dll4 兔多克隆抗体(abcam, usa)以及抗 gapdh 兔多克隆抗体（内对照），结合辣根过氧化物酶的抗兔 igg 孵育。用增强化学免疫蛋白印迹试剂 pierce检测 dll4 蛋白表达。dll4 蛋白条带以 gapdh 标准化。重复测量三次。1.5 体外 si rna 转染的检测由 genechem 公司 (shanghai, china)化学合成 dll4 sirna： dll4-duplex-1 (100 nmol/l): gtaccttctcactcatcat; dll4-duplex-2(100nmol/l): gtttccccacagtgacaag;dll4 scrambled 对照 (100 nmol/l): actaccgtt- gttataggtg。转染前 rf/6a 细胞在含 1% fbs 的 dmem 中孵育 24 小时。转染当天按推荐密度接种：24 孔板: (5.08.0)104, 96 孔板: (0.53.0)104。依据产商说明通过 lipofectamine 2000 (invitrogen, usa)将 sirna 导入 rf/6a 细胞 。以无转染组，转染试剂组，scrambled 阴性对 照组为三个对照组。sirna 转染 48 小时后缺氧培养 12 小时再检测 dll4mrna 及蛋白的表 达水平。dll4sirna 进一步用于分析沉默 dll4 对主要下游基因 hes1 和 hey1 表达的影 响以及对 epc 和 rf/6a 细胞的生物学功能的影响。1.6 细胞增殖及细胞周期的检测细胞分为四组:空白对照组，转染试剂对照组，scrambled 阴性对照组及 dll4 sirna 组， 各组分别给予相应的试剂处理细胞。epc 细胞各组给予相应干预处理前用 ebm-2+1%fbs 培养 24h，使其同步化后，再加相 应干预处理 24h、将加过药物的培养液换成新的 ebm-2+1%fbs 继续培养 0h、24h 和 48h， 分别在这 3 个时间点再加 mtt，4h 后测 od450 值。每组每个时间点设三个附孔。（增殖 实验中细胞可参考 5*103/ml 密度接种于 96 孔板内。）利用流式细胞仪分析 dll4 sirna 对缺氧下 rf/6a 细胞周期的影响。将 rf/6a 细胞接 种在密度为每孔 1104 的 96-孔板，完全培养基培养，过夜贴壁后换 1% fbs 的 dmem 培养 基 ，在转染 48 小时及 200 mol/l cocl2 缺氧 24, 48, 72 及 96 小时后加入 3-(4,5-二甲基-2- 噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑 (mtt) 。细胞进一步孵育 4 小时， 培养基不受甲臜污染，每 孔加入二甲基亚砜(dmso; 100 l /孔)，曝光 10 分钟后利用 elisa 阅读器计算 570 nm 激光 吸收系数(a) 第 3 天更换培养基，每组使用三孔，实验重复三次。为完成细胞周期分析, 将 rf/6a 细胞接种在密度为每孔 1106 的 6 孔板。细胞分为四组:空白对照组，转染试剂对照组， scrambled 阴性对照组及 dll4 sirna 组。在转染 48 小时精品论文170175180185190195及缺氧 72 小时后依据生产商提供说明给予 bd cycletesttm plus dna reagent kit (bectondickinson, usa)。用 facs caliber cytometer (becton dickinson)对样本进行分析。每组使用 三个平行孔，实验重复三次。1.7 细胞迁移的检测用纤维连接蛋白包被的孔径为 8 m 的 transwell 小室对 epc 和 rf/6a 细胞迁移进行分 析。经过 48 小时转染 5104 细胞接种至小室内。上室用含 1% fbs 的 dmem 培养基孵育，1 小时后放入 24 孔板，细胞会越过微孔膜向含 dmem 及 10% fbs 200 mol/l cocl2 的下室 迁移。孵育 8 小时后膜上细胞经 4% pfa 固定 giemsa 染色 15 min。用显微镜计数迁移细 胞数目，细胞分为四组: 空白对照组，转染试剂对照组， scrambled 阴性对照组及 dll4 sirna 组。每个小室随机选择 5 个视野，每组检测三个小室，实验重复三次。1.8 血管管腔形成的检测设立三组对照：分别为无转染空白对照组、转染试剂组、scrambled sirna 阴性对照组。 在 24 孔培养板内加入 250 l matrigel (bd, usa) 37c 孵育 1 小时形成胶体，聚合凝胶后将 转染 4 小时 4104 rf/6a 细胞接种至小孔中，1% fbs、dmem 及 200 mol/l cocl2 孵育。 每组三孔，每组实验重复三次。24 小时后,利用倒置相差显微镜观察 matrigel 胶上二维血管 管腔形成的情况。每孔随机选择 5 个视野，adobe photoshop 7.0 计算新生血管管腔长度，用 每孔每个视野下生成血管平均总长度(mm)表示。1.9 统计学分析所有数据以平均值士标准差（sd）或平均值士标准误（se）表示。采用单因素方差分 析检验(anova) ，mann-whiteney u test 和 independent-samples t-test。 显著性检验水准为 p005。利用 spss for windowsl3.0 软件(spss inc., usa)进行数据统计分析。2结果2.1 细胞培养及鉴定观察细胞形态，新鲜分离的血单个核细胞（pbmnc）呈圆形，35h 后即有细胞贴壁， 并伸出突起。第 3 天开始出现梭状内皮样细胞，至第 5 天大部分贴壁细胞呈长梭状内皮样生 长，至 7-9 天可观察到皿底出现成簇生长的内皮细胞集落。典型集落，周围细胞呈放射状排 列(图 1)。培养的 rf/6a 细胞和血管性血友病因子免疫染色鉴定,胞浆呈红色(图 2)。图 1 血管内皮祖细胞形成的集落 (40)fig.1 the colony of endothelial precursor cells (40)200205图2 培养的rf/6a 细胞和细胞鉴定。a：亚融合状态的rf/6a 细胞 (200); b:培养的rf/6a细胞血管性血友病因子免疫荧光染色(400)。fig. 2 cultured rf/6a cells and cell identification. a: subconfluent rf/6a cells (original magnification 200); b: immunofluorescent staining for von willebrand factor in cultured rf/6a cells. (original magnification 400).2.2 体外不同缺氧时间下 rf/6a 细胞 dll4 mrna 及其蛋白表达rf/6a 细胞暴露于缺氧条件 124 小时。在正常及缺氧下 dll4 mrna 及其基因均表达。 实时定量 pcr 结果显示 dll4 mrna 于缺氧 1 小时开始表达，持续 24 小时，其峰值位于12 小时(图 3)。实时定量 pcr 显示在 1,6,12,24 小时 dll4 mrna 表达呈 1.25-, 3.38-, 4.76-,2.95-倍增加。2106relative dll4 mrnaexpression ( fold )543210161224hypoxia time (hour)图3 缺氧下rf/6a 细胞dll4 mrna表达定量分析fig.3 . expression of the dll4 mrna in rf/6a cells2152.3 dll4 sirna 对 dll4 mrna 及其蛋白表达水平的影响流式细胞仪显示 dll4 sirna 经过 48 小时转染效率是 66.2% (图 4 a)。缺氧培养 12小 时的 rf/6a 细胞的 dll4mrna 及蛋白表达的上调可被 dll4 sirna 明显抑制(图 4 b,c,d)。 dll4 sirna 可显著降低 dll4 mrna 的表达水平。dll4 sirna-duplex1 和 sirna-duplex2 转染组的 mrna 水平较 scrambled sirna 组分别降低 91.4% 和 82.5%, 蛋白水平则相应降 低 86.2% 和 75.3% 。对 照组间 dll4 蛋白的表达无明显 差异 (p=0.139) 。 dll4 sirna-duplex1 因其高效的基因沉默作用被用于下一步研究。a220abbdll4 337 bpgapdh 452 bp225cdll4 74 kdagapdh 38 kdad0.5relative dll4 pixel intensity(normalized to gapdh)0.10blank control trans fectiondll4 s irna- dll4 s irna-scrambledreagentduplex1duplex2control230235240245图4 dll4 sirna显著降低dll4 的mrna及蛋白表达水平。a:流式细胞仪检测dll4 sirna转染效率。(a) 空 白对照组(b) dll4 sirna转染组。 b:pcr图示dll4 sirna明显抑制mrna表达。c:各组缺氧rf/6a细胞dll4 表 达的蛋白印迹分析图。条带1:空白对照组; 条带2:转染试剂组;条带3: dll4 sirna-duplex1 组;条带4: dll4 sirna-duplex2 组;条带5:scrambled sirna 对照组。d: 各组相dll4蛋白的相对表达量。fig. 4 dll4 in sirna specifically knocks down dll4 mrna and protein levels. a: dll4 sirna transfection efficiency as determined by flow cytometry. (a) blank control group (b) dll4 sirna transfection group. b: dll4 sirna inhibited the mrna expression. c: a representative photograph of the western-blot analysis of dll4 expression in hypoxic rf/6a cells. 1: blank control group; 2: transfection reagent control group; 3: dll4sirna-duplex1 group; 4: dll4 sirna-duplex2 group; 5: scrambled sirna control group. d: the data of the relative dll4 protein.2.4 dll4 sirna 对缺氧下 epc 细胞增殖的影响mtt 结果见表 2。表 2 dll4 sirna 对缺氧下 epc 细胞增殖的影响tab.2 effect of the dll4 sirna on proliferation of hypoxic endothelial precursor cells时间 空白对照组 转染试剂组 scrambled sirna 对照组 dll4 sirna-duplex1 组0h0.1390.0210.1330.0150.1460.0040.4780.02425024h48h0.2410.0030.3520.0110.2610.0220.2580.0060.2790.0190.3160.0330.6390.013 *0.9740.045 *255注：*p 0.052.5 dll4 sirna 对缺氧下 epc 细胞迁移的影响各组迁移结果见表 3。表 3 dll4 sirna 对缺氧下 epc 细胞迁移的影响tab.3 effect of the dll4 sirna on migration of hypoxic endothelial precursor cells260迁移细胞数目 空白对照组 转染试剂组 scrambled sirna 对照组 dll4 sirna-duplex1 组（个）45.45.6 35.22.3 41.76.8 115.32.7 *注：*p 0.052652702.6 dll4 sirna 对缺氧状态下 rf/6a 细胞 hes1 和 hey1 mrna 表达水平 的影响用逆转录-pcr 及实时定量 pcr 研究 dll4 sirna 对 dll4-notch-hes1-hey1 信号通 路中主要下游基因 hes1 和 hey1 的表达的影响。结果示：相对于 scrambled sirna 对照组, 下调 91.4%的 dll4 mrna 的表达导致 hes1 的 mrna 表达减少 75.1% (p=0.004)，hey1 的 mrna 表达减少 86.3% (p=0.004) (图 5)。ad ll4 337 bphes1 271 bpgapdh 452 bp hey1 248 bp gapdh 452 bprelative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)b4.03.53.02.52.01.51.0 *0.5blanktransfe ction reagentscramble dduplex 1*2750.0hes1 hey1280285290图 5 各组缺氧培养rf/6a细胞中hes1和hey1 mrna 的表达水平。a:pcr图示各组hes1和hey1的mrna表达。条带1: dll4 sirna-duplex1 组; 条带2:scrambled sirna对照组;条带3:转染对照组;条带4:空白对照组;条带5: 缺氧0小时。b:各组rf/6a细胞中hes1和hey1 mrna 的表达量。将缺氧0小时的mrna表达作为基线对照， 其值设定为1。(较scrambled sirna对照组，*p 0.05)fig.5 mrna expression of hes1 and hey1 in rf/6a cells. a: rf/6a cells were exposed to 200m cocl2 for12h to achieve chemical hypoxia. lane 1: dll4 sirna-duplex1 group; lane 2: scrambled sirna control group;lane 3: transfection reagent control group; lane 4: blank control group；lane 5: hypoxic time 0h. b: the data of the mrna expression of hes1 and hey1. basal reference levels in control (hypoxic time 0 hour) are defined as 1.(*p 0.05 vs scrambled sirna control group).2.7 dll4 sirna 对缺氧状态下 rf/6a 细胞周期进程的影响细胞周期分析结果表明 dll4 的表达下调可诱导细胞进入细胞周期的 s 期(图 6)。结果 显示缺氧培养 96 小时，空白对照组、转染试剂组、scrambled sirna 组及 dll4 sirna 组 的 g0/g1 期细胞比例分别为(69.645.02)%、(70.174.96)%、(70.595.67)% 、(49.963.38)%。 各组 s 期细胞的比例分别为(12.091.21)%、(10.891.05)%、(11.371.12)%、(29.661.93)% 。rf/6a cell cycle distribution100 blank control transfection reagents crambled control dll4 sirna-duplex180 60 40 20 0go/g1 g2/m sstage295300图 6 dll4 sirna对缺氧下rf/6a 细胞周期的影响fig 6 effect of the dll4 sirna on the cell-cycle progression of rf/6a cells2.8 dll4 sirna 对体外缺氧下 rf/6a 细胞迁移的影响如图 7 所示，缺氧下 rf/6a 细胞迁移以跨过 transwell 室纤维膜细胞数目表示。缺氧 8 小时，dll4 sirna 组较 scrambled sirna 对照组 rf/6a 移行细胞数目增加 1.6 倍(p 0.001)。 对照组间迁移细胞数目无统计学差异(p=0.137)。abc35*30number of migrated cells2520151050blank control t ransfection reagent scrambled control dll4 sirna- duplex1 groups305310315320图7 dll4 sirna对缺氧下rf/6a 细胞迁移的影响。a:scrambled sirna对照组的迁移细胞( 200)；b:dll4 sirna组的迁移细胞( 200)；c:各组迁移的跨膜细胞数目。fig.7 effect of the dll4 sirna on the migration of hypoxic rf/6a cells. a: migrated cells in the scrambled sirna control group (original magnification 200); b: migrated cells in the dll4 sirna group (original magnification 200). c: the number of migrated cells in each group .2.9 dll4 sirna 对缺氧下 rf/6a 细胞血管管腔形成的影响缺氧 24 小时各组 rf/6a 细胞血管管腔形成情况 (图 8)。dll4 水平下调导致 matrigel 内形成多而密集的网状血管结构，而空白对照组形成不完整的稀疏血管网络。 用总血管长 度表示二维血管管腔形成情况，dll4 sirna 组较空白对照组形成增加(p 0.001)。而三个对 照组组间的血管管腔长度无明显统计学差异(p=0.178)。ab6*5tube length , mm43210blank controltransfection reagentscrambled controldll4 sirna- duplex1groups325330图8 dll4 sirna对缺氧下 rf/6a 细胞血管管腔形成的影响。a: rf/6a 细胞形成血管管腔的典型图片。b:各组rf/6a 细胞形成血管管腔的平均总长度。fig.8 effect of the dll4 sirna on tube formation in hypoxic rf/6a cells. a: representative photograph of thetube formation in hypoxic rf/6a cells (bar = 100 um) . b: downregulation of dll4 expression in hypoxic rf/6a cells led to a significant increase in total tube length compared with the scrambled sirna control (*p 0.05). data were shown as meansd of triplicate wells in three independent experiment.3353403453503讨论rf/6a 细胞是从健康雄性恒河猴提取的脉络膜-视网膜内皮细胞。细胞形态，生长模式， 超微结构以及免疫细胞化学证明其为脉络膜血管内皮细胞。用 rf/6a 细胞系研究脉络膜内 皮细胞被认为是体外研究 cnv 相关疾病致病机制及治疗的可靠模型。21,22cnv 是一个复杂过程，其中缺氧起重要作用3-7。200 mol/l 浓度 cocl2 可用来模拟缺 氧环境23。我们的研究利用 cocl2 形成的化学缺氧来观察 rf/6a 细胞 dll4 的表达，以及 dll4sirna 对 epc 和 rf/6a 细胞血管生成包括细胞增殖，移行以及血管管腔形成的影响。 虽然 cocl2 形成的化学性缺氧与生理性缺氧不能完全等同，但