Robo1 在视网膜脉络膜血管内皮细胞中的.doc

精品论文robo1在视网膜/脉络膜血管内皮细胞中的作用研究黄旅珍，徐永胜，黎晓新5（北京大学人民医院眼科，视觉损伤与修复教育部重点实验室，北京 100044） 摘要：目的：探讨神经导向因子 robo1 在视网膜/脉络膜血管内皮细胞（rf/6a ）中的作用。 方法：通过 sirna 干扰技术降低 robo1 基因在 rf/6a 细胞中的表达，用 rt-pcr 检测 mrna 表达变化,用 western blot 检测蛋白表达变化。采用 mtt，boyden 小室，免疫荧光，流式细 胞仪对细胞的增殖，迁移，伸展，细胞周期进行检测。用 matrigel 对 rf/6a 血管形成进行10检测。结果：sirna 干扰技术在 mrna 水平以及蛋白水平均有效的沉默 robo1 基因在细 胞中的表达。robo1 sirna 干扰后 rf/6a 细胞的粘附、增殖、迁移均受到抑制，rf/6a 血 管形成明显受到抑制。结论： robo1 sirna 对 rf/6a 细胞的细胞增殖、迁移能力的抑制作 用以及管道形成能力明显。robo1 基因为临床视网膜新生血管性疾病的治疗提供了新的靶 点。15关键词：小干扰 rna；rf/6a；robo1；增殖the roles of robo1 in the retinal/choroidal vascular endothelial cellshuang lvzhen, xu yongsheng, li xiaoxin20(key laboratory of vision loss and restoration, ministry of education, department ofophthalmology, peking university peoples hospital, beijing 100044)abstract: purpose: to evaluate the roles of robo1 in the retinal/choroidal vascular endothelial cells (rf/6a).methods: sirna technology was used to knock down survivin expression and to study its effects on cells in vitro. cell proliferation, migration, spreading, cycling, and apoptosis25were assessed with the mtt assay, boyden chamber assay, immunocytochemistry, and flowcytometry.tube formation by rf/6a on matrigel was also analyzed.results:robo1 sirna knockdown inhibited cellproliferation, migration. tube formation by rf/6a cells was also disturbed.conclusions: silencing the expression of robo1 in rf/6a cells inhibited their proliferation, migration and tube formation. this study indicates that robo1 may be a molecular30target for new diagnostic and therapeutic strategies for neovascular retinopathy diseases.keywords: sirna; rf/6a; robo1; neovascularization0引言病理性脉络膜和视网膜新生血管是造成视力丧失的主要原因如早产儿视网膜病变、年龄35相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等1-2。近年来，越来越多的研究发现，神经系统与血 管系统具有很多的相似点。有很多在神经系统中具有一定作用的因子被证实在血管生成系统 中也具有重要作用，其中就包括 robo 家族。robo 家族史一类与发育有关的保守的跨膜蛋 白家族，在神经系统的发育中发挥重要作用。1993 年，在对果蝇的研究中克隆了首个 robo 基因即 robo1 基因3。早期的 robo1 蛋白的功能研究主要集中在神经系统的发育过程。近40年来越来越多的研究发现 robo1 可能参与肿瘤组织的发生发展过程。wang 等首次报道了 robo1 在肿瘤血管形成中的重要作用，发现 robo1 表达在肿瘤血管内皮细胞上，并通过体 内实验发现阻断 robo1 的表达明显减少了恶性黑色素瘤新生血管密度和肿瘤大小4。文献基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20090001110083） 作者简介：黄旅珍，(1980-)，女，助理研究员，眼科基础与临床。 通信联系人：黎晓新，（1950-），女，教授，眼底病。e-mail: drli_- 7 -报道，在结肠癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等常见肿瘤中，robo1 在肿瘤细胞质和细胞膜中高表达，并且表达强度与肿瘤的进程与分化程度密切相关5-6。robo1 蛋白过量表达在人45正常肾上皮 293 细胞中，可改变其细胞形态，提高细胞的体外增殖和迁移能力，并通过下 调 e-cadherin 基因的表达诱导正常细胞向恶性增生的肿瘤细胞转化7。表明 robo1 可能在 肿瘤新生血管形成及肿瘤细胞增殖方面具有作用。目前 robo1 的研究主要集中在 robo1 的表达及肿瘤方面，robo1 在视网膜相关疾病方面的研究未见报道。本研究以体外培养的视网膜/脉络膜血管内皮细胞为研究对象，采用 sirna 技术对50robo1 在血管内皮细胞中的表达进行抑制，观察抑制 robo1 表达后细胞生物行为学的变化， 探讨 robo1 作为治疗视网膜新生血管疾病的新靶点的可行性。1材料与方法1.1研究对象视网膜/脉络膜血管内皮细胞（rf/6a ，crl-1780 cell line ），购自上海中科院细胞研55究所。1.2实验试剂trizol reagent 购自 invitrogen 公司，prime scripttm rt reagent kit 、sybr premix extaptm 均购自 takara公司，所用引物由 qiagen 公司合成。实验用一抗包括：兔抗人 robo1 购自 chemicon 公司、小鼠抗人-actin 抗体均购自 sigma 公司。实验用二抗：fitc60标记的山羊抗小鼠 igg 、tritc 标记的山羊抗小鼠 igg 和 dapi 均购自 sigma 公司。robo1 sirna、阴性对照组 negative sirna，转染剂 hiperfect 购自 qiagen 公司。细胞检测用 mtt, pi, annexin v-pi 购自 sigma 公司，matrigel 购自 bd 公司。1.3实验方法1.3.1细胞培养和 sirna 处理细胞65细胞培养参照细胞生物学方法进行，rf/6a 细胞均采用含 10%fbs 的 dmem/f12 培 养基培养。参照说明书对 sirna 进行配制保存。试验中设阴性对照组（negative sirna, ns ）、转染剂对照组（untransfection, ut）以及 robo1 sirna 实验组，以 gapdh 为内 参。按照细胞传代培养的方法，将细胞消化成悬浮状态，以 1105/细胞密度接种于 6 孔板 上，每孔 2300l 培养基，6 孔板置于 37 c、5%co2 条件下孵箱中备用。sirna 加入到70100l 无血清培养基中（其终浓度将为 15nm，再加入 12lhiperfect 转染剂，涡旋振荡器 混匀，室温下孵育 15-30 分钟以形成转染复合体混合液。将混合液滴加到 6 孔板的细胞培 养液中，轻晃混匀。6 孔板置于 37 c、5%co2 条件下孵箱中孵育 48-72 小时。收集细胞 用于检测。1.3.2细胞 rna 提取、cdna 制备及 real time pcr 反应75参照 trizol reagent 使用说明提取细胞 mrna 后，参照 prime scripttm rt reagent kit 使用说明将其逆转录为 cdna ，参照 sybr premix extaptm 使用说明 real time pcr 。根 据 ncbi 中 gene bank检索的基因序列合成引物，具体信息见表 1。80表 1 pcr 引物序列信息基因名称上游引物下游引物片 段 长 度（bps）robo1aaatatggtgggcaaagctgctggatgactgtggtggttg104gapdhgagtccactggcgtcttcacgttcacacccatgacgaaca1208590951001051101.3.3细胞总蛋白的提取、sds-page 电泳及免疫印记分析参照蛋白提取试剂使用说明提取细胞总蛋白，经 bca 进行蛋白定量分析。参照分子生 物学实验方法进行 sds-page电泳、转膜，最终经由封闭、一抗、二抗环节完成免疫印 记检测。将免疫印记结果 bio-rad 计算机凝胶成像系统拍照，quantity one 软件分析杂交条 带，spss 10.0 软件包统计分析蛋白不同时间段表达量的差异。1.3.4细胞增殖检测（mtt 法）调整消化细胞浓度，按 500/孔/0.2ml 接种于 96 孔板培养板中，设 6 个平行孔，置 37，5%co2 孵箱中。从第 2 天起固定时间加入 5mg/ml 的 mtt20l。4 小时后倾去上清， 加入分析纯 dmso150l。在 wallac victor2 上，590nm 测每孔的吸光值。计算每个时相点 6 孔的吸光度的平均值。1.3.5细胞黏附实验（mtt 法）将消化下来的细胞悬液加入到 96 孔板中，每孔 100l （3104 个细胞/孔）；将 96 孔 板置于 37 c、5%co2 条件下孵箱中孵育 1 小时；pbs 液小心清洗 96 孔板，将未黏附的 细胞清洗掉；加入 80l 新鲜 dmem 培养液；加入 5mg/ml 的 mtt20l；余步骤同细胞增 殖检测。计算抑制率( 对照-空白)-( 干预- 空白)/(干预- 空白)100%。1.3.6细胞迁移试验（transwell 法）将 transwell 小室取出，向小室下方的 24 孔板中加入 600 l dmem 和 10% 胎牛血清； 将 transwell 小室放回原位；向 transwell 小室内加入细胞悬液 100l；置于 37 c、5%co2 条件下孵箱中孵育 5 小时；取出小室；用棉签擦去上室内的细胞；4%多聚甲醛固定；加入1:1000 稀释 dapi，3715 分钟；0.1m pbs 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟；将 transwell 小 室底膜取下，封片剂封片，荧光显微镜下观察；取 5 个随即视野照相，计数穿过 transwell 小室底膜的细胞数。1.3.7细胞周期的检测(pi 法)细胞消化后制成单细胞悬液；-20预冷的 70% 乙醇固定 4过夜；冷 pbs 洗涤 3 次， 每次 5 分钟；rnaase 消化 30 分钟，离心；加入 100g/ml 碘化丙锭 0.5ml，避光 5 分钟。 流式细胞仪 488nm 检测。1.3.8体外管道形成能力检测(matrigel 法)参照 matrigel 说明进行铺 48 孔板；细胞消化后制成单细胞悬液，以 1104 细胞/孔进 行接种；置于 37 c、5%co2 条件下孵箱中孵育 24 小时。倒置显微镜下观察；取 5 个随 即视野照相，使用 image pro plus 图像分析软件计算管道形成面积。计算抑制率(1-干预/ 空白)100%。1.3.9统计学分析全部试验重复 3 次以上。使用 spss13.0 统计学软件，采用 t 检验及单因素方差分析115120（anova）进行统计，计量资料采用 mann-whitney u test 法。p0.05 表示有统计学意义。2结果2.1robo1 sirna 特异的抑制 robo1 在细胞的表达如图 1a 实时定量 pcr 结果表明，与阴性对照组（ns）和转染剂对照组(ut)比较而言， 显示 robo1 sirna 可特异敲减了 rf/6a 细胞中 robo1 基因的表达（图 1a）。图 1b 中的 western-blot 结果表明 robo1 特异 sirna 可以在蛋白水平上有效地沉默 robo1 基因的表达（图 1b）。表明该实验体系可以特异、有效地敲减 robo1 基因。125130图 1. robo1 sirna 可特异地从 rna 水平和蛋白水平抑制 robo1 在 rf/6a 细胞的表达。a. 定量 pcr 检测 robo1 在转染剂对照组（ut）及阴性对照组（ns）和特异的 robo1sirna 处理组的表达水平。b. western-blot 显示 robo1 蛋白条带在不同处理组的表达。2.2robo1 特异 sirna 对 rf/6a 细胞生物学特性的影响2.2.1robo1 特异 sirna 抑制细胞增殖实验如图 2 所示，与阴性对照组（ns）相比，mtt 结果显示，robo1 特异 sirna 在第 3天时可明显抑制 rf/6a 细胞的增殖，抑制作用可持续至第五天，均有统计学差异 (p 0.01)。1352.2.2细胞迁移实验图 2. robo1 sirna 抑制 rf/6a 细胞的增殖作用如图 3 所示，与阴性对照组（图 3a）相比，robo1 sirna 均抑制了 rf/6a 细胞的迁移（图 3b）。rf/6a 细胞中，平均每个视野中迁移细胞数与对照组相比具有统计学差异(图 3c，p 0.01)。140145150图 3 robo1sirna 对 rf/6a 细胞的迁移作用。a. 阴性对照组（negative sirna, ns ）中 rf/6a 细胞迁移 结果。b. robo1 sirna 处理组中 rf/6a 细胞迁移结果。c. ns 组和 robo1 sirna 处理组中细胞迁移的统计 结果。2.2.3体外成管实验如图 4 所示，与阴性对照组（ns）相比，robo1 特异 sirna 明显抑制 rf/6a 细胞体 外管道形成能力，管道形成数目明显减少，具有统计学差异(p 0.01)。图 4. robo1sirna 对 rf/6a 细胞成管作用。a. 阴性对照组（negative sirna, ns ）中 rf/6a 细胞管道形 成结果。b. robo1 sirna 处理组中 rf/6a 细胞管道形成结果。c. ns 组和 robo1 sirna 处理组中细胞管道 形成的统计结果。1551602.2.4robo1 特异 sirna 细胞周期呈 g0/g1 实验如图 5 所示，与阴性对照组（ns）相比，robo1 sirna 处理组 rf/6a 细胞 g1 期为 74.92% 而对照组为 63.91%；s 期为 16.08%而对照组为 28.27%。与对照组相比，处理组细胞中 robo1 的减少导致细胞周期 g0/g1 期延长，s 期减少，均具有统计学差异(p 0.01)。图 5. robo1 对 rf/6a 的细胞周期作用。a：ns 处理组；b：robo1 sirna 处理组；c. ns 组和 robo1 sirna处理组中细胞周期的统计结果。1651701753结论小干扰 rna（sirna）介导的 rna 干扰在哺乳动物细胞中能够介导转录后基因沉默， 具有高效性和特异性。但是，sirna 过程中，mrna 水平和蛋白水平中的非特异性效应可 能是限制这一技术应用的原因之一【8】。因此，我们使用阴性对照来观察这种效应。发现特 异地 robo1 sirna 可以很好的沉默 rf/6a 细胞中 robo1 的表达。本研究选用视网膜/脉络膜 血管内皮细胞为研究对象，采用 sirna 技术降低 robo1 的表达，以研究 robo1 在细胞中 的作用，探讨其在视网膜新生血管性疾病。对于 robo1 特异 sirna 的验证采用了实时定量 pcr 和 western blot 的方法从 mrna 水平和蛋白水平对 sirna 的敲减效率进行验证，结果证实了这一体系的可靠性。对于 robo1 特异 sirna 处理后对细胞黏附、增殖、迁移、周期、管道形成的影响均采用较为成熟的方 法进行检测。管道形成是 rf/6a 细胞的特性之一，也是新生血管形成中最重要的阶段。我们的研究 结果显示，robo1 基因沉默可显著降低 rf/6a 的管道形成能力，提示 robo1 在 rf/6a 体 外形成血管中具有一定的作用。细胞迁移、黏附是细胞正常生理功能的主要指标。robo1 sirna 处理的 rf/6a 细胞与 对照组相比，细胞迁移明显减少，细胞黏附能力均降低，说明沉默 robo1 的表达可以抑制 rf/6a 细胞的迁移和黏附。180185190细胞的生长和增殖是细胞生命活动的重要体现。真核细胞是以有丝分裂的方式进行增殖的。细胞周期亦即细胞增殖周期，是指细胞从第一次有丝分裂结束到第二次有丝分裂结束所 经历的过程。它包含有丝分裂间期和有丝分裂期，有丝分裂间期又包括 dna 合成前期（g1）， dna 合成期（s），dna 合成后期（g2）和有丝分裂期（m ），此外静止相的 g1 期细胞 没有增殖活性，又被称做 g0 期。各类细胞的细胞周期时间有很大差异，细胞周期短的细胞 因可以在短时间内大增殖，故增殖能力强，细胞周期长的细胞增殖能力弱。而细胞周期长短 的时间主要取决于细胞周期中的 g1 期时间，不同细胞 g1 期时间差别很大，而细胞进入 s 期 后，一直到有丝分裂完成所需要的时间相当恒定。robo1 sirna 转染的细胞较对照组 g1 和s 期延长，细胞生长受到抑制。总而言之，我们的研究结果首次发现，robo1 可能在脉络膜-视网膜血管内皮细胞的管 道形成、细胞粘附、迁移和增殖中具有重要作用。后续研究需要进一步深入研讨 robo1 体 内对视网膜新生血管中的作用。比如通过 robo1 的特异抑制剂或特异激活剂来抑制或活化 robo1 的表达可能有助于确定 robo1 在视网膜新生血管中的作用。参考文献 (references)1952002052101 ferris fl 3rd, fine sl, hyman l. age-related macular degeneration and blindness due to neovascularmaculopathy. arch ophthalmolj. 1984;102:1640-1642.2 green wr. histopathology of age-related macular degeneration. mol visj. 19