细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术实验教学PPT.ppt

1,实 验 二,细菌培养基的配制、灭菌及接种、培养技术,第一部分 细菌培养基的制备、灭菌,目的要求 实验材料 实验程序,3,目 的 要 求,熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。,4,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。 高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。,5,实 验 程 序,玻璃器皿的洗涤和包装 培养基的制备 无菌稀释水的制备 培养基和玻璃器材等的灭菌,6,实验程序1 （玻璃器皿的洗涤和包装）,清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。,7,实 验 程 序2 （培养基的种类）,据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入1530g/l左右的琼脂。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入35g/l左右的琼脂。,8,实 验 程 序2 （培养基的种类）,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,9,实 验 程 序2 （培养基的配制方法和步骤）,1. 取一个300ml烧杯，装150ml蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。 注意： a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 可加热促进各成分溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。,10,实 验 程 序2 （培养基的配制方法和步骤）,3. 调ph值：用10 naoh调ph至7.6，用精密ph试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250ml锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,11,实 验 程 序2 （培养基的分装和斜面培养基的制作）,每支试管装的量为试管高度的1/41/3. 斜面长度为试管长度的1/31/2.,12,实验程序2 （培养基的配制方法和步骤）,13,实验程序3 （无菌稀释水的制备）,取一个250ml的锥形瓶装90(或99)ml蒸馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 另取5支18mm180mm的试管，分别装9ml蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。,14,实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）,加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50左右，才能将物品取出。,15,实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）,湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。,16,实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）,5. 当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121)即开始灭菌，使其维持1530min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于37恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。,17,18,实验程序4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。 操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次在100煮沸3060min，连续3d重复进行。 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。,19,实验程序4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）,过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,20,第二部分 细菌纯种分离、培养和接种技术,目的要求 实验材料 实验程序,21,目 的 要 求,掌握从环境中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。,22,实 验 材 料,无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1ml2支、10ml1支。 营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，无菌稀释水90ml1瓶、9ml5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。,23,实 验 程 序,细菌的纯种分离 细菌的接种方法,24,实验程序1 （细菌的纯种分离）,稀释平板法 平板划线法,25,实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法）,1. 取样。 2. 将1瓶90ml和5管9ml无菌水排列好，用记号笔依次编上101、 102、103、104、105、106。在无菌操作条件下，用10ml的无菌移液管吸取10ml水样(或其它样品)加入编号为101无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。用1ml无菌移液管吸取1ml 101浓度的菌液于编号为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度菌液。同样方法，依次稀释到106 。,26,实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法）,稀释液的制备,27,实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法）,3. 平板的制作 取10套无菌培养皿编号， 104、105、106各3个，另一个为空气对照。 取1支1ml无菌移液管从浓度小的菌液开始，以106、105、104为序分别吸取0.5ml菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。,28,实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法）,3. 平板的制作 加热培养基，当其冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30培养2448h，然后观察结果。,29,实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法）,3. 平板的制作 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于30培养2448h，然后观察结果。,30,实验程序1 （细菌的纯种分离平板划线法）,1. 平板制作：将融化并冷至约50的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。 2. 划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)。划线完毕盖好皿盖，30培养2448h后观察结果。,31,实验程序1 （细菌的纯种分离平板划线法）,32,实验程序2 （细菌的接种技术）,接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。,图6,33,实验程序2 （细菌的接种技术斜面接种法）, 左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面(两支试管的斜面同时向上) 。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。,1,2,3,34,实验程序2 （细菌的接种技术斜面接种法）, 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。,4,5,6,7,8,35,实验程序2 （细菌的接种技术液体接种和穿刺接种）,液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。 穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。,36,实验程序2 （细菌的接种技术稀释平板涂布法）,稀释样品：方法同稀释平板分离法 倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板 用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样