生物传感器毕业论文设计.doc

南南 开开 大大 学学 本 科 生 毕 业 论 文（设 计） 中文题目：lspr 生物生物传传感器的研究感器的研究 系 别：电电子科学与技子科学与技术术系系 专 业：电电子科学与技子科学与技术术 完成日期：2010 年年 5 月月 12 日日 0 lspr生物传感器的研究生物传感器的研究 摘 要 目前，基于局域表面等离子体共振(lspr)现象的传感研究是一个热点方向， 这种方法在器件开发和相关应用上均有很大的潜力。lspr传感器具有一些优于 传统spr传感器的特性，在物理、化学和生物方面的特性测量分析上应用方便， 效果显著，有很高的开发潜力。这篇文章是一个综述性的文章，首先介绍了 lspr技术目前的发展状况，对lspr技术的原理和特点进行了归纳，并总结了 目前已经成型的几种lspr传感部件和系统的制作方法和技术要素，以及在实验 中的应用领域。同时，它对基于lspr的传感器传感芯片的未来发展趋势和商业 化前景也作出了讨论。 关键词 局域表面等离子体共振(lspr)；纳米粒子；生物传感器 i 目 录 摘摘 要要0 1简介简介1 2lspr 定义定义 2 3lspr 与与 spr 的区别的区别.4 4dda 算法算法6 5lspr 传感系统的基本构造传感系统的基本构造 7 5.1 基于光纤的生物传感系统.7 5.2 基于反射的光纤(rfo)传感系统 8 6lspr 传感器的构造传感器的构造 9 7lspr 传感器制作工艺传感器制作工艺 10 7.1 基于电光调制的 lspr 生物传感器的制作.10 7.2 在玻璃表面固定金纳米棒.11 7.3 金纳米线表面结合自组装分子.11 7.3.1 金纳米线阵列芯片的制作.11 7.3.2 自组装分子层结合.12 7.4 利用 nsl 技术制作 ag纳米微粒12 7.5 银纳米结构薄膜.13 7.6 金纳米井芯片的制作.13 8lspr 传感技术的工艺方法传感技术的工艺方法 14 8.1 光学系统的材料和技术.14 8.1.1 一种匹配生物传感器的光纤探针的制作.14 8.1.2金纳米粒子修饰的光学纤维的制备14 8.2 材料表面图案加工工艺 .15 8.2.1纳米刻蚀图案过程15 8.2.2 利用nsl拓展技术制作纳米孔阵16 8.2.3 利用cp技术在纳米粒子层表面形成图案17 9lspr 传感器的应用实例传感器的应用实例 18 9.1 lspr 传感器应用于测量物理量.18 9.1.1 金纳米线阵列表面结合自组装分子的lspr光谱测量方法18 9.1.2 纳米粒子表面典型消光光谱的测量.19 9.2 lspr 传感器在化学传感领域的应用.20 9.2.1基于纳米ag粒子的表面等离子体共振光谱测定cn- 的测定方法.20 9.2.2利用lspr传感器检测有机磷杀虫剂.20 9.3 lspr 传感器在生物传感领域的应用.21 9.3.1以氯金酸氧化还原反应为基础的蛋白质病人血清样本中的葡萄糖lspr传感探测.21 9.3.2使用基于lspr的纳米芯片蛋白质的无标记监测.21 9.3.3使用lspr的重组细胞蛋白质表达分析.22 ii 10lspr 传感器技术的商业化传感器技术的商业化 23 11lspr 传感器的未来发展趋势传感器的未来发展趋势 24 12总结总结25 参考文献参考文献26 致致 谢谢31 1 一、简介 近年来，纳米材料由于其独特的光学、电磁学和力学特性而得到了研究人 员的广泛关注。贵金属纳米粒子显示了很强的紫外-可见光吸收带特性，绝大多 数金属中都没有这种性质1-8。科学研究表明，贵金属纳米粒子悬浮液的这种特 有性质取决于它们同光的强烈作用，而对纳米粒子光学领域的研究又使得对于 材料的成分，尺寸，形状，以及局部绝缘环境和金属悬浮液的测色等等之间的 关系有了更深层次的理解。对贵金属纳米粒子的光学性质的研究在理论和实践 上都具有重要的意义。从理论上说，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学 性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等起到了十分重要的作用。从 实践上说，如果纳米结构的光学性质可调试，则它可以应用于表面增强光谱9-13， 光学滤波器14,15，等离子体设备16-19和传感器等领域。 目前局域表面等离子体共振(lspr)的形成以及它载体上的金和银纳米粒子 的光学特性都具有很大的吸引力20,21。金和银纳米粒子在各种纳米光学的应用， 如生物芯片22-25，以及纳米尺度26方面都得到了广泛的重视和研究。被测溶液 和固定在衬底表面的粒子之间的反应能够引起的生物分子层厚度的变化，而基 于lspr的检测方法就能够对这种即时变化进行检测27,28。我们知道，纳米粒子， 如金和银，在可见光区域有强吸收作用，这就是通常所说的lspr吸收。这种 lspr现象发生时，入射光子频率同金属纳米粒子或金属岛传导电子的整体振动 相匹配。纳米量级的粒子在紫外-可见光区域表现出独特的光学响应29,30，它们 的吸光率随着光子能量的减少呈指数衰减（被称为mie散射），在这个区域会出 现lspr带，对于粒子材料来说，它是叠加而成的。研究显示，表面等离子体能 量和强度对粒子结构和周围环境媒介等很多因素敏感31-36。贵金属纳米粒子由 于其独特的光学特性，即它们有在普通金属的光谱中不存在的强烈等离子体共 振光谱吸收带37，同时，基于lspr的设备还能够与简单光学系统同时建立，这 也使得对贵金属纳米粒子基于lspr派生的各种传感器的技术研究十分热门。 由于纳米材料与生物高分子、蛋白质、核酸等在尺寸大小上具有相同的量 级，所以在生物医学领域，基于lspr的各种传感器技术的研究和优化的工作也 在进行之中。生物领域中的药物研究、生物传感、细胞标记、定点诊断、分子 动力学研究以及载体治疗等方面的应用，都是以生物分子和纳米材料之间的相 2 互作用为基础的。lspr纳米传感器在检测生物分子方面应用很广泛22,38,39。生 物传感技术被应用于大蛋白和抗体的检测。以通过nsl技术（纳米球光刻术） 制得的银纳米粒子为例，当增加被吸附物层的密度和厚度时，会产生连续波长 的红移。纳米粒子表面的分子的大小和密度决定波长的移动响应，表面结合的 配体和溶液中的目标分子共同决定系统的检测能力。因为系统显示没有非特异 性结合22，所以整个反应归因于分子间的配对选择。lspr纳米传感器的性能优 化可通过调整纳米粒子的大小和形状实现32,40。理论计算表明，纳米粒子角上 的电磁场强度放大区域40以及整个可调传感区域，与环绕在纳米粒子周围的平 均感生电磁场有关32。于是，随着进一步的研究成果，我们可以将纳米传感器 应用于相关生物系统中来进行诊断操作，如老年痴呆症的诊断。 基于 lspr 技术的无标记光学生物传感器在继承了很多传统 spr 传感器的 优良特性的基础上，实时无标记监测分子动力学相互作用的能力也得到了进一 步的发展。这种生物传感器容易制造，使用方便，只需要紫外-可见光分光计或 者平板扫描仪辅助。值得注意的是，无标记光学生物传感器在基于阵列的形式 下，能够方便并多元化实现高度检测生物分子之间的相互作用。 二、lspr 定义 lspr现象是仅限于金属纳米粒子（有时被当作金属簇）和金属纳米结构中 的传导电子共振现象41-45。它发生在金属纳米结构中，如纳米粒子，纳米三角 形46，纳米岛42等。当光子跟金属纳米粒子中的传导电子振动相匹配时，就会 产生lspr现象。用入射波长能够激发共振的电场激励lspr，会产生强光散射， 出现强表面等离子体吸收带，同时局部电磁场增强。纳米粒子在紫外光区域表 现出唯一的光学响应30，吸光率随着光能的减少呈指数衰减（mie理论） ，出现 lspr带。表面等离子吸收带的频率、最大吸收波长和强度高度取决于材料的化 学成分（金，银，铂等贵金属） ，纳米粒子的尺寸，分布和纳米结构形状，以及 它们周围的环境31,32,36,47。lspr器件制作十分容易，它不需要特殊的系统结构， 如衰减全反射（atr）光学或波导耦合器件，它可以通过利用nsl等技术达到 很高的小型化程度。这些性能使基于lspr的传感器得到了高度的关注。 当入射光子频率与金属纳米粒子中的自由电子的集体振动发生共振时，会 产生lspr现象。最简单的纳米粒子光学响应模型是mie理论，它描述长波长段 3 球形金属颗粒的消光量。具体形式如下37： () = 2433 2 (10) (+ 2)2+ 2 (1) 其中，e()为消光量， 即吸收和散射光量的总和；na是纳米粒子的局部密 度；a是金属纳米球体的半径；m是金属纳米球体周围介质的介电常数（假设为 正实数，且与波长不相关）；是入射光波长，i是金属纳米球体介电常数的虚 部；r是金属纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项(r+2m)2 接近零时， 即达到了lspr的共振条件。 从这个最原始的模型中可以看出，掩埋于周围介电环境中的金属纳米球体 颗粒的lspr光谱特性取决于以下几个方面：纳米粒子的半径a、纳米粒子材料 （i和r）以及纳米粒子周围介质的介电常数m。进一步研究表明，在实际情况 中，即纳米粒子不是球体时，吸收光谱将取决于纳米粒子的直径、高度和形状。 在这种情况下，分母中的共振项应写作 (+ )2 (2) 其中是形状因子项11，用来描述纳米粒子形貌比例。5:1的纳米粒子形貌 比率所对应的的值从2（对于球体来说）最大可增加至17。此外，很多样品为 沉积在衬底表面的纳米粒子集合。因此，lspr还取决于粒子间距和表面绝缘常 数。 lspr消光导致波长的选择性吸收并伴有极大的摩尔消光系数，大概 31011l/(mcm)48，效率相当于106个荧光分子51产生的共振瑞利散射49,50， 以及在纳米粒子表面增强的局部电磁场，这是在所有表面增强光谱中观测到强 烈信号的原因，如表面增强拉曼散射(sers)和表面增强荧光31,32。 由式(1)还可以看出，贵金属纳米粒子的最大消光位置高度取决于周围环境 的电介质性质，并且纳米粒子最大消光波长的移动能够被用于检测纳米粒子周 围由分子引起的变化。因此，至少有 4 种不同的基于纳米粒子的传感机理，它 们均取决于 lspr 消光变化或者 lspr max散射强度变化。这些机理分别是：(1)来 自类似于荧光染料标记的纳米粒子标记中的共振瑞利散射39,50,51,52-57，(2)纳米 粒子聚合58-63，(3)纳米粒子表面电荷转移的相互作用46,64-68，(4)局部折射率变 化22,28,32,38,46,69-75。 4 三、lspr 与 spr 的区别 多项研究表明，基于lspr的纳米传感器的传导机理与平面传感器的传导机 理一致，是spr传感器的拓展和延续。在近20年来，spr传感器，利用折射率的 原理来探测接合在金属表面76上或其附近的分析物，并且被广泛的用于检测一 系列的分析物的表面接合相互作用，包括小分子的吸收77, 79, 80，配体受体结合 77, 81-83，蛋白质在自组装单层膜上面的吸收84-86，抗体抗原结合87，dna和 rna杂交88-91以及蛋白质dna的相互作用92。 就spr技术来说，它有三个明显的缺点：(1)spr的共振角和共振波长的移 动检测模式需要大量的光学阵列来实现87,93,94；(2)局限于一些平方微米量级的 信号传感元的尺寸,特别典型的是10m10m 95；(3)实时性不强。 比较spr和lspr传感器，它们非常明显的区别是折射率的灵敏度和特征电 磁场的衰变波长。由于spr传感器具有大折射率灵敏度(2106nm/riu)79，所 以，spr响应经常通过单位折射率的变化来体现。lspr纳米传感器，从另一方 面上说，折射率灵敏度则逊色一些(2102nm/riu)46。可以看出lspr纳米传感 器在这方面上比spr传感器低了4个量级，表面上spr传感器在灵敏度上要比 lspr传感器高10,000倍，但事实并不如此。就现阶段应用研究中所需要的灵敏 度来说，两个传感器都可以很好的满足要求。特征电磁场的短的可调的衰变长 度ld，可以使lspr纳米传感器的灵敏度提高31, 32。lspr纳米传感器的ld大概在 5-15nm或者光波长的1-3%，并且取决于尺寸，形状，以及纳米粒子的成分； spr传感器的衰变长度大约在200-300nm或是光的波长的15-25%的。由此可见， 二者在这方面具有很大的区别79。spr和lspr的最小足纹也是不同的。在实际 中，spr传感器需要至少1010m2的区域进行传感实验。对于lspr传感器，这 个尺寸可以通过单一纳米粒子技术最小化为大量独立的传感元件（1010个纳米 粒子在一个2mm2点位上，纳米球直径=400nm）或纳米粒子（直径约为20nm） 57。这种纳米粒子方法能够达到和spr传感器一样的效果，由此它的像素尺寸 可以减小到100nm2以下。由于更低的折射率灵敏度，lspr纳米传感器不需要温 度控制，而spr传感器（大折射率灵敏度）需要。另外，lspr和spr传感器之 间最值得关注的区别就是造价。已经投入商业使用的spr设备的造价在150,000 到300,000美元之间，而处于实验阶段的便携式lspr系统的造价则少于5,000美 5 元。 由于lspr中的消光现象是由纳米粒子对光的吸收和散射造成的，因此 lspr的实现不需要表面等离子体共振(spr)那样庞大的实验装置。lspr技术可 以制作出体积小、系统设置简单的生物传感器，较传统的spr生物传感器有很 大的差别。 但是，这两种传感器之间存在着一个相同的关系。它们的全响应都能够通 过如下等式来描述79： = (1 2 ) (3) 这里max是波长移位响应，m是折射率灵敏度，n是折射率由吸收引起的 折射率变化量，d是有效吸收层的厚度，ld是特征电磁场的衰变长度。值得注意 的是，对于平面lspr传感器，这个等式在数值上说明了传感器上吸附物的影响。 当用于lspr纳米传感器的时候，这个指数方程不仅近似于吸收物层的响应，还 对它的响应在数值上作了详细的解释31,32。同spr传感器类似，lspr纳米传感 器的灵敏度取决于距离，而距离取决于来自纳米粒子表面电场的平均诱发区域。 为了清晰的说明，列表总结lspr技术与spr技术的比较如下（表1）： 表1 lspr传感器与spr传感器的比较 特性sprlspr 无标记检测可以78,80,89,100可以22,38,46,57 距离影响1000nm7930nm（尺寸可调）31,32 折射率灵敏度2106nm/riu77,79,81,972102nm/riu31,46 模式角位差94，波长差，成像消光22，散射39, 57，成像39, 57 温控要求需要不需要 化学识别spr-ramanlspr-sers 场移植不可以可以 商业应用开始尚未 造价$150,000-$300,000$5,000（多粒子） ， $50,000（单粒子） 空间分辨率1010m95,1011 个纳米粒子39, 57,96 非特定约束最小（取决于表面化学成分和 清洗）77,97,98,100,102 最小（取决于表面化学成分和 清洗）22 6 实时测量时间范围=10-1-103s，平面扩散 77,80,98,99,103 时间范围=10-1-103s，幅射扩散 57 多通道能力可以93,104可以并有研发潜力 小分子灵敏性好77更好31 微流体兼容性有有研发潜力 四、dda 算法 离散偶极近似算法(dda)是近年发展起来的一种数值方法，原则上对任意 形状及尺寸的纳米颗粒的吸收、散射及消光等光学特性进行计算。dda算法与 实验测得的紫外-可见吸收光谱的结合已成为认识纳米颗粒的结构特点及光学性 质的重要手段之一，在计算光与金属纳米颗粒的相互作用方面具有较强的优势。 为计算任意大小及形状的纳米颗粒的光学性质，dda算法首先将该颗粒视 为n个立方单元构成的集合体，再把每个立方单元视为电偶极子来处理105。任 一个电偶极子与局域场的相互作用表示为（忽略频率因子eiwt） = , (4) 式中表示单个偶极子的极化率；由入射光场和其他偶极子在该处所形成 , 的偶极场两者组成，即 e e, = , + , = 0( ) (5) 式中，e0为入射光电场的振幅，k为波矢，相互作用矩阵如下： a a = () 3 2 ( )+ (1 ) 2 2 3( ) ( ) (6) 在这个公式中有如下关系： = ，=| |，= (7) 将式(5)与(6)代入式(4)并整理可得到： ( 1) + = , (8) 再将此式写作矩阵形式： 7 = (9) 对于包含n个电偶极子的体系来说，p和e都是3n维矢量，a为3n3n的对称矩 阵。解此3n复线性方程可求得极化矢量，从而消光系数(包括吸收与散射两部 分)可由以下方程求得106： = 4 |2 = 1 (, ) (10) 以螺旋银纳米结构为例，通过 dda 计算，我们可以发现这种结构可以很 好的实现等离子体峰调制和电场分布排列。随着螺旋体半径的增加，主要的等 离子体峰受到 s 偏振，右旋圆偏振，以及左旋圆偏振入射的影响而发生红移。 即使不改变结构，通过把入射光从左旋圆偏振改变为右旋圆偏振，等离子体峰 也能够实现可调。除此之外，最大电场的空间分布可以通过改变入射光的偏振 方向来调节：对于位于主要的等离子体峰波长的 s 偏振光来说，最大电场分布 在螺旋横截面附近，或者接近螺旋中轴线，这是由于强耦合作用形成的；而对 于圆偏振光，根据入射方向，最大电场会位于螺旋的顶端或者底部。所以，对 于传感和分析领域来说，通过使用不同的入射偏振，我们可以从空间上断定被 分析物在螺旋中的位置。因此，我们可以获得空间分辨的被分析物信息。在实 际中，它可以在亚微米量级内判定被分析物的空间分布情况。 5lspr 传感系统的基本构造 5.1 基于光纤的生物传感系统 如图 1 所示这个系统包括一个激光器(hitachi hl6320g laser diode, 635 nm, 10mw; thorlabs ldc500 laser diode controller; thorlabs tec2000 temperature controller; thorlabs tcldm9 laser mount)，一个斩波器(stanford research sr540)， 一个光纤耦合器，一条传感光纤，一个样液池(10ml)，一个光接收器(thorlabs pda55)，一个锁相放大器(stanford research sr830)。将乙酰胆碱(ach)溶液放 入样液池中，并使 lspr 传感器水平放置。在达到平衡后，在容器中放入特定 量的对氧磷，60 秒后会产生一个新的稳定响应，它们之间的反应可在 2 到 4 分 钟内测量。 8 图 1 lspr 生物传感器系统的示意图 5.2 基于反射的光纤(rfo)传感系统 rfo对于高压的构造如图2所示。这个系统由一个激光器(hitachi hl6320g laser diode, 635nm, 10mw; thorlabs ldc500 laser diode controller; thorlabs tec2000 temperature controller; thorlabs tcldm9 laser mount)，一个斩波器 (stanford research sr540)，一个分光器，一个锁相放大器(stanford research sr830)，以及一个图片接收器(thorlabs pda55)组成。图2的放大部表示没有覆 盖的光纤穿过一个1/16英寸的peektm联合管套筒。peektm联合接线至一个热 控制的高压室中，接线管为1/4英尺长，0.065英尺厚的不绣钢高压管，在450 k 下可以承受高达70mpa。高压室的温度通过循环水浴(wisdom, model lc-06)保 持误差在0.05k内。在高压室中使用镍镉-镍铝热电偶(thermocoaxe type k)测 量待测液样温度，热电偶通过铂温度计(guildline, model 9540)校准。温度测量 的精确度在0.01k之内。压力测量使用仪器为精确度在0.05mpa内的50.4mpa 的压力变换器(sensotec, model ag-300)。高压源容器用来供给超临界二氧化碳 (scco2)，高压液体泵(shimadzu lc-8a)把被分析溶液压入高压室。每个测量至 少重复5次。测量受体单位浓度时，归一化强度会发生变化，从而可以确定金纳 米粒子修饰的lspr光纤传感器的灵敏度。 9 图 2 高压条件下基于反射的光纤传感系统示意图 6lspr 传感器的构造 目前出现的各种新型的，把生物识别反应转换成放大的光电信号的设备的 基础是纳米金和银粒子所产生的局域表面等离子体共振光谱及其电学性质。t. schalkhammer107曾详细地论证了1个金属镜面上能够结合聚合物隔离层、生物 反应层和与生物识别相结合的纳米金属簇，借助于簇与镜面偶极分子之间的相 互作用(连接或解离)，通过产生的共振增强光谱从而转换成清晰可检测的光学 信号，如图3所示。 图 3 放大了的金属簇光学生物传感器组成 图 4 所示的是基于电光调制的 lspr 生物传感器，左上图为该生物传感器 的实物照片，右上图为该生物传感器的截面示意图。这种 lspr 生物传感器的 设备结构制作在 x-剖面，y-方向的 linbo3上，这种材料具有优异的电光效应。 10 这种生物传感器由一对电极，钛扩散的波导，以及涂覆了人血清白蛋白(hsa) 的金纳米粒子的传感区域组成。在共面电极上加电压可以使电场沿 z 方向传播， 这样就可以通过电光系数 r13来调制折射率。 图 4 基于电光调制的 lspr 生物传感器的设备结构 7lspr 传感器制作工艺 7.1 基于电光调制的 lspr 生物传感器的制作 1020 c 下在衬底上扩散 20nm 厚的条形钛，整个过程持续 6 小时，就可形 成波导。利用光刻和热蒸发技术制成 300nm 厚的带有电极的铝膜，电极间距分 别为 40，60 和 80m，对应波导宽度分别是 20, 40 和 60m。为了防止电极由于 液体分析物的增加而短路，在衬底的传感区域上沉积一个 4nm 长，300nm 厚的 sio2开口层。向沸腾的 haucl4溶液中加入柠檬酸钠即可制取金纳米粒子，粒 子直径的平均值是 22.64nm，标准差是 2.32nm。为了在 linbo3上固定金纳米 粒子，使用羟基团和 3 氨丙基三甲氧基硅烷对衬底表面的末端分子进行化学修 饰。金纳米粒子通过光刻和旋涂选择性沉积在表面上。把经过化学修饰的表面 108浸泡在 hsa 的磷酸二氢钠溶液中，就可使 hsa 在纳米粒子表面自合成。完 整的 lspr 生物传感器如图 4 所示。被分析物为 阻滞剂（心得舒），它可以 按照 1:9 配置乙腈和去离子水溶液制取。 11 7.2 在玻璃表面固定金纳米棒 80c 下，用 rbs 洗涤剂清洗玻璃衬底，并使用超声波降解标本 10 分钟。 在用水冲洗干净后，把载玻片放在 1:1 的甲醇/盐酸溶液中，超声波降解 30 分钟 后，再一次用大量水冲洗，然后使用乙醇冲洗。接下来，将载玻片置于烤箱中 在 60c 下进行烘干，烘干过程大概需要 12 小时。在冷却后，将载玻片放在 10%的 巯丙基三乙氧基硅烷(mptes)的乙醇溶液中反应 15 分钟，使玻璃表面形成硫基 硅烷自组装单层膜(sam)结构。将这些经过处理的载玻片在乙醇中彻底清洗并 再一次使用超声波降解（每一个载玻片持续 5 分钟）。最后，把载玻片放入烤 箱，保持温度为 120c，烘干过程持续 3 小时69,109,110。 金纳米粒子棒固定在硫基硅烷 sam 的玻璃表面上之前，要进行精密离心 过滤过程，去除金纳米棒悬浮液中多余的溴化十六烷基三甲基铵(ctab)。悬浮 液均匀分布在三个管中并在 4500rpm 下进行 30 分钟离心（beckman 模式 j21-21 离心机，配有 js-13.1 旋转器），过滤掉一半悬浮物。将纳米棒悬浮液重新悬浮， 同时将每个试管中的溶液稀释为 30ml，再次离心，过滤所有悬浮物。接下来， 将每个试管中的纳米棒悬浮液再次稀释至 30ml 并悬浮，再一次离心。在过滤 悬浮物后，金纳米棒会互相组合，最终可以得到总体积为 75ml 的水悬浮液， 将经过修饰的硫基硅烷玻璃载玻片置于此悬浮液中，约 12 小时后，即可完成金 棒芯片的制备。 7.3 金纳米线表面结合自组装分子 7.3.17.3.1 金纳米线阵列芯片的制作金纳米线阵列芯片的制作 在硅基板上旋涂浓度为1.25%的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)溶液，膜厚约 50nm，在150c下烘烤半小时，去除水气并使pmma排列定型。使用原子力显 微镜(afm)(smena-hv, nt-mdt, russia)进行纳米压印，力学常数为40n/m，探 针针尖直径约20nm (nsc15, mikromasch, russia)。这个过程主要是在铺有 pmma的硅基板上刻划出纳米凹槽后，用电子枪蒸镀系统。蒸镀时，要先蒸镀 厚度约为1nm的钛层，再蒸镀厚度为20nm的金层。制作过程中还要辅助剥离与 清洗过程。最后，可以得到线宽小于100nm金纳米线阵列，流程示意图如图5所 12 示。 图5 金纳米阵列制作流程示意图 7.3.27.3.2 自组装分子层结合自组装分子层结合 在室温下，把制作好的金纳米线阵列芯片浸入浓度为 10-3m 的十八烷硫醇 (odt)酒精溶液中，经过一段特定时间后取出芯片，立即用酒精清洗并用氮气 枪吹干。最后，在空气中用加热板在 100c 下烘烤约 10 分钟，确保残留在芯片 上的水分完全去除，进而可以得到表面结合了 odt 分子的金纳米线阵列。 7.4 利用 nsl 技术制作 ag 纳米微粒 纳米球光刻术(nsl)是一种纳米加工制造技术。利用这种技术能够控制表面 限定的纳米微粒的形状、尺寸和结构（见图 6） 。利用这种技术合成面宽约为 100nm，高为 500nm 的 ag 纳米三角形微粒，并采用 lspr 光谱测量法测量微 粒的光学特性。纳米微粒的消光波长极大值随吸附物质发生位移，导致靠近纳 米微粒表面处的局部反射发生改变。 为制备生物传感用 lspr 纳米传感器，首先用自组装单层膜使 ag 纳米三角 形微粒具备吸附功能；其次利用零长度耦合试剂将生物素共价连接吸附到羧基 上。 如图 6 所示，ag 纳米微粒的制作步骤如下：(1)清洁基片；(2)将单一溶剂 聚苯乙烯纳米球滴落覆盖在基片上；(3)烘干六边紧密填充的纳米球单层膜，形 成纳米球掩模；(4)ag 蒸发沉积在样品上；(5)在乙醇中进行超声波降解去除纳 米球掩模；(6)制备出 ag 纳米微粒样品。 13 图 6 银纳米微粒的 nsl 加工工序 7.5 银纳米结构薄膜 目前，出现了一种新颖的制作银纳米结构薄膜的方法，在制作过程中，反 应溅射 agox薄膜量较之以往减少了 110,111。这种方法具有如下优点：(1)可以 在圆片级区域上制作均匀的银纳米结构薄膜；(2)不需要额外加热；(3) agox的 还原所需时间短。这些优点使得这种方法不单适用于批量生产银纳米薄膜，而 且适用于制作低成本的 lspr 传感芯片。银纳米薄膜在 lspr 生物传感器方面 的应用具有很大的潜力，它可以用于检测生物素和链酶亲和素分子间的反应。 通过反应离子刻蚀(rie)还原 agox薄膜可以制取银粒子的纳米结构薄膜 111,112。在总压强为 0.5pa 的氩氧混合气体（40%氩气，60%氧气）中对纯银靶 (99.99%)进行反应射频磁控溅射，经过抛光的硅晶片上（尺寸为 1010mm2）可 沉积一层厚度为 50nm 的 agox薄膜。然后 agox通过两个 rie 刻蚀过程被还原 为 ag。第一个刻蚀过程在 cf4(2sccm)，h2(30sccm)和 o2(10 sccm)的混合气流中 进行，整个过程持续 1 分 30 秒；第二个刻蚀过程在 h2(30sccm)和 o2(10sccm)的 混合气流中进行，整个过程持续 8 分钟。第一个刻蚀过程让银纳米粒子成核， 而第二个刻蚀过程是核的生长过程。 7.6 金纳米井芯片的制作 在金纳米岛芯片上旋涂（在 500rpm 下持续 5 秒钟，然后在 1500rpm 下持 续 30 秒）su-8100 (microchem, usa)，涂层厚度为 200m，然后在 95c 下前 烘 100 分钟。在波长为 365nm 处进行紫外曝光（每次能量密度为 630mj/cm2） ， 14 可以形成一个 88 的井(=800m)阵列图案。在曝光后，在 95c 下进行 30 分 钟后烘，然后将其置于 su-8 显影液中，进行 3 分钟弱超声处理，就可以去除井 区域不交联的 su-8 树脂并使部分井中的金纳米岛表面曝光。图 7 为金纳米岛井 芯片的制作过程原理图。 向金纳米岛芯片表面的井中放入 0.2l 不同含量 gst-hil6 细胞裂解液，然 后将井芯片在 25c 下放置在密闭的培养皿中，以防止样品溶液蒸发。然后将芯 片用磷酸盐缓冲溶液(pbs)和去离子水彻底冲洗，并用氮气风干。 图 7 金纳米岛井芯片的制作过程原理图 8lspr 传感技术的工艺方法 8.1 光学系统的材料和技术 8.1.18.1.1 一种匹配生物传感器的光纤探针的制作一种匹配生物传感器的光纤探针的制作 把多模态光纤(g50/125 3002, fujikura ltd., japan) 新切割的端面放在 n-s2- 氨基乙基 3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(silaace s320, chisso corp., japan) (50mm)的 乙醇溶液及 5% 的乙酸溶液中，在室温下浸泡十分钟。用乙醇冲洗光纤，然后 放在烤箱里，在 120c 下进行硅烷化。在此之后，把光纤浸泡在金纳米粒子的 水溶液中。一段时间后金纳米粒子就被固定在光纤的端面上。由于金纳米粒子 有超过 80%的重现性，因此这个过程大概产生约 20%的覆盖范围，这对于目前 的用途来说是足够的。 8.1.28.1.2 金纳米粒子修饰的光学纤维的制备金纳米粒子修饰的光学纤维的制备 15 多模态塑复合二氧化硅光学纤维(model f-mbc)（从 newport (irvine, ca)购 买）芯直径为 400m，包层直径为 430m。在样液池中以 3:7 混合过氧化氢(浓 度 30%)和浓硫酸，光纤裸露部分(2cm)在此混合液中清洗 30 分钟。清洗过后， 将光纤裸露部分浸泡在 1%mptms 的甲苯溶液中。8 个小时后，取出光纤并用 甲醇清洗，去除表面的多余单体。在经过彻底清洗之后，把光纤裸露部分放入 吸光率大概为 1 的金溶胶中。经过 5 小时后，在芯表面上可以形成自合成金纳 米粒子单层。随后，经过修饰的光纤要依次用水，甲醇和三氯甲烷冲洗。 8.2 材料表面图案加工工艺 8.2.18.2.1 纳米刻蚀图案过程纳米刻蚀图案过程 纳米刻蚀图案过程如图 8 所示。首先沉积一层金属铬薄层(2nm)增强金层同 衬底的黏合。接下来，通过电子束蒸发技术在玻璃衬底上沉积厚度为 40nm 的 金层，并在金薄膜上旋涂不同浓度的聚苯乙烯(ps)溶液（质量分数分别为 1.5，0.8，0.5%，ps 的分子量为 45,730)。聚合薄膜在玻璃过渡温度 tg 以上退 火并且选用预先设定的混合 pdms 模式刻蚀。刻蚀过程在真空中 150 c，1.60kpa 低压下进行，持续 30 分钟到 1 小时。图 8 中，方案 a 适合高 ps 浓 度，由于 ps 膜足够厚，所以可填充在 pdms 和衬底之间的圆柱孔；方案 b 适 合低 ps 浓度，质量分数在 0.8%之下，由于 ps 膜很薄，所以对于缝隙只能部分 填充。ps 薄膜在毛细管力的作用下延 ps 壁上升并且在壁周围形成环形波动。 ps 图案经过 cf4/o2的 rie 处理后，可以去除衬底表面多余 ps 层。rie 过程改 进了 ps 图案的形体尺寸。在冷却到室温后，用氩离子粉末掩模 2 分钟，使 ps 图案位于金阵列图案的后面。离子刻蚀的直流偏置是 400v，同时要保持氩气压 在 510-4torr 以下。注意，带有波浪边缘的薄环形 ps 点最后制成的金环图案如 图 8b 所示。最后，使用超声波在甲苯中降解衬底 15 分钟去除残余 ps 掩模。 我们使用氨基烷链硫醇(aut)的 sam 对金岛表面进行修饰，如图 8 的 c 部 分所示。为了保证经过 aut 修饰的 sam 在金岛上能够良好生长，我们先将样 品放在 aut 溶液中，经过 24 小时后，彻底冲洗并在纯氮气中吹干。然后使用 含有 10mm 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(bs3)的 pbs 溶液活化金图案阵列。然 后，把衬底放在质量分数为 10%的端氨基聚酰胺-胺(pamam)g4 树状大分子的 16 甲醇溶液中，锚定的 pamam 会同活化生物素 sulfo-nhs-lc-biotin 共价结合形 成胺基键。把经过生物素修饰的金点和环阵列放在 20m 的链霉亲和素(sa)溶 液中曝光，从而诱发 sa 结合在经过生物素修饰的金表面上。用带有单色仪双 光束系统的紫外-可见近红外光谱仪(jasco: v-570)测量 lspr，扫描波长分布 在 300 到 2500nm 区域内，光源是非偏振的卤钨灯(2002500nm)。在介质中， 我们使用 afm (seiko instruments: spa400)在接触模式下拍摄纳米阵列的图像。 在图8中，a, b分别表示利用厚和薄的ps膜形成点和环图案。c表示利用端 氨基pamam树状大分子的sam作为中间耦合层在金图案上固定sa蛋白质的过 程。在这个过程中，我们使用活化生物素sulfo-nhs-lc-biotin交联sa蛋白质。 图 8 压印光刻和离子刻蚀制作金岛纳米图案示意图 8.2.28.2.2 利用利用 nsl 拓展技术制作纳米孔阵拓展技术制作纳米孔阵 首先要对衬底（熔融石英，25mm25mm1.5mm）进行化学处理使其表面 具有亲水性。将衬底浸在硫酸/过氧化氢为3:1的溶液中，最少持续2小时。然后 将衬底在超纯水中清洗，接下来将其置于超纯水溶液/氢氧化铵/30%过氧化氢为 5:1:1的溶液中并使用超声波作用持续1小时。最后，衬底在超纯水中彻底清洗并 且置于超纯水中保存，待使用时再从水中取出，60 c下在空气中被烘干。接下 来，将新制备的超纯水滴落在衬底上并使其扩散，所需水量取决于胶体溶液的 浓度和所用纳米球的直径。胶体纳米球溶液（直径390nm，4%的固体来自于 duke scientific corps）最初为团状，浮在水膜上，所以要对它进行扩散处理， 使其浓度在衬底表面各处均匀分布。然后，把样品放入烤箱中，在60c下烘干， 烘干过程持续1小时。 17 由于水气蒸发，纳米球自合成为六边形紧密堆积的单层阵列，可以作为光 刻掩模。最后，要在纳米阵列中热蒸发银。在二氯甲烷中使用超声波作用去除 纳米球后，留下来的即为三角形银纳米粒子阵列。 若要利用此技术制作更大的纳米粒子阵列和纳米孔阵，在蒸发银之前要使 用氧等离子体对纳米球进行反应离子刻蚀。haginoya等人首先使用了这个附加 步骤，利用在经过刻蚀的纳米球阵列区域蒸发铂钯抗蚀剂，他们成功地制取到 硅孔阵113。如果把刻蚀时间从50s增加到120s，纳米球的直径就会减少，这就 导致样品的金属纳米粒子尺寸持续增加，最后合并成与纳米粒子阵列相同周期 的孔阵。 概括说来，整个过程如图9所示，其各部分小图示意如下：(1)滴落移液管 中的胶体溶液；(2)纳米球随着液体的蒸发而排序；(3)银蒸发在非酸蚀（左）和 酸蚀（右）的纳米球阵列上；(4)纳米球被移除之前的俯视图；(5)在纳米球被去 除后形成的离子阵列（左）和孔洞（阵列）。 图 9 制作过程示意图 8.2.38.2.3 利用利用 cp 技术在纳米粒子层表面形成图案技术在纳米粒子层表面形成图案 18 微接触印刷技术(cp)是一种多功能技术，它使得在微米和微米以下量级结 构的表面图案的产生变得容易(xia and whitesides, 1998)。对于复杂的纳米粒子 层结构，首先使用乙醇清洗金包层硅晶片和弹性聚二甲基硅氧烷(pdms)图案， 然后把它们用氮气流中吹干。接下来，在含有 1mm 十八硫醇(c18)的乙醇溶液 中印刷图案。1 分钟后，图案用氮气风干并且轻轻的压在晶片上。2 分钟后，撤 去图案，用乙醇冲洗衬底并在氮气流中烘干。把裸露的表面区域在新制备的 10mm 巯基乙酸盐(tg)的微孔水溶液中曝光。经过 1 小时后，表面用微孔水清 洗干净并用氮气吹干。 向粒子层表面滴落一层由 350nm 的 ps 粒子组成的粒子悬浮液。微孔水、 edc/pbs 溶液（100ml 的 pbs 中，1-乙基-3-(3-(二甲基氨)丙基)碳化二亚胺 (edc)的质量是 1.25-2.50mg）的体积比是 2:1:4。持续 1 小时曝光之后，用微孔 水轻轻冲洗衬底并在氮气流中风干。纳米粒子仅仅被 tg 覆盖的区域吸收。然 后，采用与同性表面相同的处理方法对其金属化即可。注意，这个方法与 kaltenpoth 等人于 2003 年提出的方法不同，因为这里的胶状纳米粒子是在吸收 之前形成的。 9lspr 传感器的应用实例 9.1 lspr 传感器应用于测量物理量 9.1.19.1.1 金纳米线阵列表面结合自组装分子的金纳米线阵列表面结合自组装分子的 lspr 光谱测量方法光谱测量方法 将原始金属纳米线阵列与之后浸过odt溶液的金属纳米线阵列分别在暗室 中进行lspr散射光谱测量。使用100w的卤素灯 (olympus, bx51m, japan ) 作 为光学显微镜的光源。在暗视野下，用白光照射制作好的芯片，通过光纤接收 金属钠米线阵列散射出来的光，并将此散射光导入单色光谱仪中 (cvi, dk240, u.s.a) ，然后使用光电倍增管 (cvi, ad110, u.s.a ) 放大接收光信号，再将此 放大信号送到电脑中，经过软件cvi ad110处理后即可得到金属lspr散射光光 谱。最后使用ccd相机拍摄光学显微镜暗视野模式下金纳米线阵列的光学影像。 光谱测量仪器结构如图10所示。 19 图 10 光谱测量仪器结构示意图 9.1.29.1.2 纳米粒子表面典型消光光谱的测量纳米粒子表面典型消光光谱的测量 工作在反射模式的光纤结构可以测定纳米粒子层的某些性质，如图11所示。 用光谱分布在190到1700nm的氚钨卤素光源(dh2000, ocean optics, dunedin, fl, usa)通过光纤照射样品表面，并用另一个光纤收集从表面反射回来的光，再用 带有二极管阵列的微型光谱仪(hr2000, ocean optics)在200到1100nm的光谱范 围内进行分析。 根据测量对横向分辨率的要求，两个光纤分别被用作照明和检测。对于光 斑直径约3mm左右的大尺寸的测量，我们使用普通光纤反射探针(r200-7, ocean optics)，如图11a所示。在高分辨率实验的情况下，横向分辨率减少至5m，这 时使用如图11b所示的检测光学方法。在这种情况下，用带有纤维束的大功率卤 素光源(fiber-lite 190, dolan-jenner, boxborough, ma, usa)取代氘钨卤素光源。 这样可以保证足够高的光子通量，满足每个光斑以及样品表面的扫描达到足够 的收集量。来自表面的反射光利用光学系统在50m长的多模光纤的端面成像。 光学系统主要由一个显微镜物镜(msplan20, olympus deutschland, hamburg, germany)和一个相当于目镜的凸透镜（焦距为50mm）组成，横向分辨率为 5m。若要实现高分辨率模式下样品的自动扫描，可以自行设计基于 visualbasic的软件，它可以实时控制两个步进电机（分辨率0.5m，owis gmbh, staufen, germany）和微型光谱仪。 图11各部分具体示意如下：图11a表示自动光谱分辨测量的普通结构，这里 使用的反射探针横向分辨率大约为3mm。图11b表示用于高横向分辨率表面的光 20 学探针。为了获得高通量，使用光纤束取代反射探针，探测过程通过透镜系统 在多模光纤端面的成像完成。 图11 在紫外-可见-近红外区域测定金纳米粒子层反射率和消光光谱的光学系统 9.2 lspr 传感器在化学传感领域的应用 9.2.19.2.1 基于纳米基于纳米 ag 粒子的表面等离子体共振光谱测定粒子的表面等离子体共振光谱测定 cn- 的测定方法的测定方法 向容积为 25ml 的比色管中，加入一定浓度 cn- 试样溶液和体积为 15ml 密度为 10g/ml 的胶体银溶液。在剧烈震荡后，把混合溶液稀释至 25ml（保 持溶液 naoh 浓度为 0. 015 %( m/ v)）。接下来，向溶液通氧 3 分钟。然后用 1cm 石英比色皿、以水作参考，比较测定溶液于 399nm 处的吸光度值，由工作 曲线求出 cn-浓度。 9.2.29.2.2 利用利用 lspr 传感器检测有机磷杀虫剂传感器检测有机磷杀虫剂 液相和气相色谱分析是检测有机磷杀虫剂的常用方法，但是这些方法需要 很长时间，并且需要进行繁琐的样品预处理。这里介绍的方法是使用金纳米粒 子同乙酰胆碱酯酶(ache)共价耦合的 lspr 生物传感器来检测对氧磷样品。将 经过 ache 修饰的 lspr 传感器浸泡在 0.05mm 的 ach 溶液中，可以检测的范 围是 1100