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第 28 卷第 16 期农 业 工 程 学 报Vol.28No.16 2702012 年8 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringAug. 2012 基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化 魏文志，付立霞，陈国宏 （扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009） 摘要：为了优化水提法小球藻多糖提取的工艺，该文在单因素试验的基础上，选择水料质量比、超声波功率、提取时 间、冻融- 超声波次数进行 4 因素 3 水平的正交试验提取小球藻多糖，采用三氯乙酸法去除游离蛋白质。结果表明：小球 藻多糖最佳提取条件为水料质量比 15，超声波功率 600 W，超声波作用时间 6 min 和冻融- 超声波 2 次，小球藻粗多糖得 率为 5.918%。三氯乙酸法脱游离蛋白质以 pH 值为 4 为最佳，多糖回收率为 57.84%。该研究可为从小球藻中大规模分离 和提取以及纯化多糖提供参考。 关键词：多糖，超声波，提取，小球藻，脱蛋白 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.16.042 中图分类号：O632文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-16-0270-05 魏文志，付立霞，陈国宏. 基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化J. 农业工程学报，2012，28(16)：270274. Wei Wenzhi, Fu Lixia, Chen Guohong. Process optimization of polysaccharides extraction from Chlorella pyrenoidosa based on ultrasound assisted by freezing and thawingJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(16): 270274. (in Chinese with English abstract) 0引言 小球藻 （Chlorella pyrenoidosa FACHB5） 是一类普生 性单细胞藻类。小球藻具有生态分布广、可快速生长和 繁殖、 易于培养等优点， 是地球上动植物中唯一能在 20 h 增长 4 倍的生物1，具有很高的应用价值。目前小球藻已 经广泛地应用在动物饲料、食品添加剂、医药制剂、美 容产品等方面。小球藻及其热水抽提物具有促进免疫、 抗肿瘤的作用2，已有大量试验证明，小球藻的活性成分 中，多糖具有促进机体免疫、抗肿瘤等功能3- 4。 小球藻多糖的提取一般采用热水抽提法5- 6。但热水 提取多糖时，易引起多糖降解，从而影响多糖的生物活 性7- 8。超声波提取法是在传统水提法的基础上，辅助超 声波处理，利用超声波产生的空化作用、机械作用加速 细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出。已经有研究证明， 超声波法比热水抽提法具有能耗低、效率高、不破坏有 效成分等优点9- 10，因此被广泛应用于目的物质的强化提 取。 冻融法是在- 20冷冻、 室温缓慢融化11的一种方法， 是一种比较温和的破壁方式，可以避免高温对原料所造 成的营养损失等不良影响12，也是使细胞破裂较为彻底 的方法13。 由于小球藻具有坚固的细胞壁14，因此本研究采用 冻融辅助超声波法对小球藻多糖进行不同提取工艺参数 收稿日期：2011- 11- 22修订日期：2012- 04- 22 作者简介：魏文志（1970） ，男，副教授，博士，研究方向为生物饵料与 营养。扬州扬州大学动物科学与技术学院，225009。 Email： 通信作者：陈国宏（1963） ，男，教授，博士，研究方向为遗传资源评 价与利用。扬州扬州大学动物科学与技术学院，225009。 Email： 的筛选，并利用正交试验进行主次因素分析，采用三氯 乙酸法进行多糖的纯化，以期为从小球藻中大规模分离 提取和纯化多糖提供参考。 1材料与方法 1.1材料 小球藻藻粉：江苏明天生物科技有限公司生产藻泥， 经冷冻干燥成干粉（藻粉）。 1.2试剂与仪器 无水乙醇、硫酸、苯酚等均为分析纯；葡萄糖标准 品（Sigma 公司生产）；牛白蛋白（中国医药集团上海化 学试剂公司生产）；JD- 600 超声波细胞粉碎机（宁波邱 隘金达超声波仪器厂生产）；RE- 5202 型旋转蒸发仪（上 海亚荣生化仪器厂生产）；UV- 2401PC 分光光度计（日 本岛津公司生产）。 1.3试验方法 1.3.1小球藻多糖提取的工艺流程 小球藻粉（冻融+超声波处理）离心上清液真 空浓缩醇析离心得粗多糖复溶三氯乙酸法去除 蛋白真空浓缩冷冻干燥多糖 1.3.2多糖含量和蛋白质含量的测定 多糖含量采用苯酚- 硫酸法15测定，用葡萄糖为标准 物，在 490 nm 波长处测定标准物质量浓度与吸光度的对 应关系，制备标准曲线。 蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法16测定。用牛白 蛋白作为标准物，在 595 nm 波长测定标准物质量浓度与 吸光度的对应关系，制备标准曲线。 1.3.3多糖提取正交试验设计 在前期预试验的基础上，考察水料质量比、超声波 功率、超声波时间、冻融- 超声波次数 4 个单因素对小球 第 16 期魏文志等：基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化 271 藻多糖得率的影响。同时依据单因素试验的结果，采用 4 因素 3 水平正交试验设计，进行主次因素和最佳提取条 件的分析。其中冻融处理为在- 20冷冻，室温缓慢融化， 超声波处理为在冰浴中进行。 在单因素试验的基础上，选取水料质量比、超声波 强度、超声波粉碎时间、冻融- 超声波次数 4 个因素，以 多糖得率为指标， 设计了 4 因素 3 水平的正交试验表 （见 表 1），并按 L9（34）正交表安排试验。 表 1正交试验因素水平 Table 1Factors and levels of orthogonal test 因素 水平 A 水料质量 比 B 超声波功 率/W C 超声波时 间/min D 冻融- 超 声波次数 11036061 21548082 320600103 100% 粗多糖质量 多糖得率 小球藻粉质量 （1） 1.3.4多糖纯化 采用三氯乙酸法除蛋白17。三氯乙酸是一种有机酸， 可以使多糖样品中的蛋白质变性沉淀，该方法操作简单、 结果稳定、反应温和，在除蛋白时能很好保证多糖的活 性，是一种简单有效的去除粗多糖中蛋白质的方法18- 19。 取 1.0 g 粗多糖，溶入 200 mL 蒸馏水中，用 20%的 三氯乙酸调节 pH 值至 2、3、4、5、6，静置过夜，离心， 取上清液测量蛋白质脱除率和多糖损失率，计算多糖回 收率。 01 100% 0 MM M 蛋白质脱除率（2） 式中，M0 为纯化前蛋白质质量，mg；M1 为纯化后蛋白 质质量，mg。 01 100% 0 NN N 多糖损失率（3） 式中，N0 为纯化前多糖质量，mg；N1 为纯化后多糖质 量，mg。 100% 纯化后多糖质量 多糖回收率 粗多糖质量 （4） 1.3.5品质分析 小球藻多糖水溶液用 UV- 2401PC 分光光度计做 190700 nm 全波段扫描20。 2结果与分析 2.1单因素试验 2.1.1水料质量比对多糖得率的影响 称取小球藻粉 6 g，固定超声波功率 360 W，超声波 粉碎时间 8 min，冻融次数 2 次的条件下，设置水料质量 比为 5、10、15、20、25，研究不同水料质量比对小球藻 多糖得率的影响。 从图 1 可知，水料质量比从 5 增加到 15 时，多糖得 率随着水料质量比的增加先增大而后降低；当水料质量 比为 15 时，多糖得率达到最大，而当水料质量比超过 15 时，多糖增加略有下降，可能原因为料液比过大会引起 小球藻细胞不能被完全破碎，多糖不能充分溶出。因此 选择水料质量比 15 较为合适。 注：小球藻粉6g；超声波功率360 W；超声波粉碎时间8min；冻融次数2次。 图 1水料质量比对多糖得率的影响 Fig.1Effect of ration of Chlorella pyrenoidosa to water on extraction rate 2.1.2超声波功率对多糖得率的影响 称取小球藻粉 6 g，固定水料质量比 15，超声波粉碎 时间8 min， 冻融次数2次的条件下， 设置超声波功率120、 240、360、480、600 W，研究不同超声波功率对小球藻 多糖得率的影响。 从图 2 可知，多糖得率随超声波功率的增加而明显 增大，当超声波功率达到 480 W 左右时，达到最大，后 趋于稳定，可能是小球藻细胞内多糖已完全释放。因此 选择超声波功率为 480 W 较为合适。 注：小球藻粉 6 g，水料质量比 15，超声波粉碎时间 8 min，冻融次数 2 次。 图 2超声波功率对多糖得率的影响 Fig.2Effect of ultrasonic power on extraction rate 2.1.3超声波粉碎时间对多糖得率的影响 称取小球藻粉 6 g，固定水料质量比 15，超声波功率 480 W， 冻融次数 2 次的条件下， 设置超声波粉碎时间 4、 6、8、10、12 min，研究不同超声波粉碎时间对小球藻多 糖得率的影响。 从图 3 可知，在时间低于 8 min 时，多糖得率随时间的 增加逐渐提高，之后随着时间的延长而降低。这说明，多糖 的浸出过程与时间相关，浸提时间过短，多糖溶解不充分， 但时间过长，又会引起多糖糖链断裂或者增加其它成分的溶 出，从而使多糖得率降低。因此选择8min 是比较合适的。 农业工程学报2012 年 272 注：小球藻粉 6 g，水料质量比 15，超声波功率 480 W，冻融次数 2 次。 图 3超声波粉碎时间对多糖得率的影响 Fig.3Effect of time on extraction rate 2.1.4冻融次数对多糖得率的影响 称取小球藻粉 6 g，固定水料质量比 15，超声波功率 480 W，超声波粉碎时间 8 min 的条件下，设置超声波和 冻融次数 1、2、3、4 次，研究冻融- 超声波次数对小球藻 多糖得率的影响。 从图 4 可知，多糖得率随冻融-超声波次数的增加而 增加，冻融-超声波 2 次的多糖得率比 1 次的明显要高， 而反复冻融 2 次以上多糖得率增加不明显，可能是因为 小球藻内多糖已接近完全溶出。因此从经济方面考虑选 择冻融-超声波次数为 2 次较为合适。 注： 小球藻粉6 g； 水料质量比15； 超声波功率480 W； 超声波粉碎时间8 min。 图 4冻融- 超声波次数对得率的影响 Fig.4Effect of freezing- thawing and ultrasonic times on extraction rate 2.2正交试验结果 在单因素试验基础上采用正交试验，对冻融结合超声 波法提取小球藻多糖的工艺条件进行优化，结果见表 2。 表 2正交试验方案与结果 Table 2Experiment scheme and results 因素水平试验 编号 ABCD 多糖得率/% 111113.593 212224.705 313334.048 421235.172 522314.389 623126.099 731325.160 832135.004 续表 因素水平试验 编号 ABCD 多糖得率/% 933214.214 K112.34613.92514.69612.196 K215.66014.09814.09115.964 K314.37814.36113.59714.224 R3.3140.4361.0993.768 通过以上极差分析（表 2）可以看出，影响多糖得率 因素的主次顺序为：DACB，小球藻多糖的最佳提 取条件为：A2B3C1D2，即水料质量比为 15，超声波功率 为 600 W、超声波时间为 6 min、冻融- 超声波次数为 2 次时，多糖得率最高为 6.099%。进一步的方差分析表明， 4 个因素中冻融- 超声波次数和水料质量比对粗多糖有显 著的影响，见表 3。 表 3方差分析表 Table 3 Variance analysis of orthogonal test 因素离差平方和自由度F 值显著性 A5.5823.56* B0.1020.06 C0.6120.39 D7.1124.52* 误差14.1618 注：F0.05(2,18)=3.55；*表示显著水平（P0.05）。 采用上述优化条件，即水料质量比为 15、超声波功 率为 600 W、超声波时间为 6 min、冻融- 超声波次数为 2 次做小球藻多糖提取的验证试验，重复 4 次，测得平均 多糖得率为 5.918%。 2.3三氯乙酸法法蛋白去除的效果分析 三氯乙酸法去除小球藻游离蛋白的试验效果见图 5。 图 5三氯乙酸法对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响 Fig.5Effect of trichloroacetic acid concerntration on rate of protein- removed and polysaccharide lost 由图 5 可以看出，pH4 之前，随着 pH 值的增加， 粗多糖溶液中蛋白质脱除率逐渐增加，pH 值达到 4 之后 蛋白质脱除率逐渐减少，pH 值为 4 时蛋白质脱除率达到 为 68.08%，但在 5 个不同 pH 值条件下，多糖损失率相 差不是很大，因此综合蛋白质脱除率和多糖损失率，采 用 pH 值为 4 较好，此时多糖的损失率最高为 36.26%， 多糖的回收率为 57.84%。 2.4品质分析 三氯乙酸脱蛋白的多糖溶液紫外扫描结果见图 6。 由 第 16 期魏文志等：基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化 273 图 6 可以看出， 该工艺制备的多糖在 195 nm 处有吸收峰， 没有明显的蛋白质（280 nm）、核酸（260 nm）和色素 （400700 nm）的特征吸收峰，说明该多糖较为纯净21。 图 6多糖样品 190700 nm 扫描吸收光谱 Fig.6l90- 700 nm absorbance spectra of polysaccharide sample 3结论与讨论 1）在单因素试验的基础上，运用正交分析确定了冻 融辅助超声波法小球藻多糖的最佳提取条件：水料质量 比 15，超声波功率 600 W，提取时间 6 min 和冻融- 超声 波提取 2 次，小球藻粗多糖得率为 5.918%，好于采用热 水结合超声波小球藻粗多糖最高得率 4.480% 22的方法， 说明了反复冻融能使细胞破裂更加彻底，多糖溶出增加。 2）pH 值为 4 时脱游离蛋白质效果较好，小球藻多 糖回收率达到 57.84%，品质分析结果表明，所得多糖较 为纯净。 本研究中小球藻多糖的提取和纯化没有在高温中进 行，小球藻多糖的生物活性与热水提取法相比，其效果 有待于进一步的研究。 参考文献 1Yamaguchi K. 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