鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻对低温、强光的响应论文.pdf

分类号 q943.2 u d c 633 学校代码 10129 学 号 08100022 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻对低温、强光的响应 the response to low temperature and high light of spirulina platensis in an alkali lake of erdos plateau 申 请 人：巩东辉 学科门类: 理 学 学科专业：植物学 研究方向：植物生理 指导教师：张少英 教授 论文提交日期：二零一三年六月 摘 要 螺旋藻，作为最为重要的经济蓝藻，其代谢机理与环境因子变化的关系一直 是该藻的热点研究内容。 目前国内螺旋藻工厂化养殖所采用的藻种原产地属于热 带地区， 属于冷敏感植物， 因此我国螺旋藻养殖基地主要分布在南方和沿海地区， 严重制约了我国北方地区螺旋藻养殖业的发展。 在鄂尔多斯地区螺旋藻温室养殖 过程中，chad 湖钝顶螺旋藻在初春和深秋产量与夏季相比有较大幅度的下降， 而鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻却表现出良好的适应性。 本研究以内蒙古鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻和非洲 chad 湖钝顶螺旋藻为 实验材料，模拟初春、深秋的光温条件（低温和强光辐射） ，系统地研究了低温、 强光胁迫下鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻在补偿生长、光合作用、抗氧化酶活性 等方面的应答及与非洲 chad 湖钝顶螺旋藻的差异比较，并对鄂尔多斯高原碱湖 钝顶螺旋藻规模化温室养殖的产量与光温的关联进行了分析。主要研究结果如 下： 1、低温、强光胁迫下螺旋藻的光抑制现象十分显著，且随处理温度降低、 时间延长，光合速率下降幅度加大，蓝光的光合作用恢复效果最显著，其次为红 光、黄光、绿光，黑暗中的恢复效果最差；螺旋藻光合能力的恢复与蛋白质的合 成有关。自然光下进行恢复生长，鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻恢复快于非洲 chad 湖钝顶螺旋藻，且恢复时间与处理温度、时间呈负相关。低温、强光处理 后的藻丝体发生不同程度的断裂，颜色由深变浅，发生光漂白，光漂白程度均为 非洲 chad 湖钝顶螺旋藻大于鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻。 2、螺旋藻叶绿素 a、可溶性糖、可溶性蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、类 胡萝卜素含量在低温、强光胁迫条件下呈现出不同程度的下降。 3、螺旋藻在低温、强光胁迫的耦合作用下，质膜因发生光氧化作用而导致 结构和功能被破坏。随着处理温度的降低和照光时间的延长，螺旋藻表现为膜通 透性增加，相对电导率、mda 含量、游离脯氨酸含量上升；且随胁迫条件的加 剧，非洲 chad 湖钝顶螺旋藻光氧化程度高于鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻。 4、低温、强光胁迫下，鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻类囊体膜的叶绿素 a、 蛋白含量、atp 酶活性相对稳定，变化幅度小于非洲 chad 湖钝顶螺旋藻，类囊 体膜 atp 酶在 5 30 范围内活性稳定。低温、强光条件下可诱导鄂尔多斯 高原碱湖钝顶螺旋藻生成一条 42.18kda 的新蛋白条带。 5、低温、强光下，螺旋藻 cat、sod 的酶活性与处理时间及处理温度呈正 相关；cat、sod 酶活性为鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻大于非洲 chad 湖钝顶 螺旋藻，pod 活性随处理时间的延长逐渐下降。cat、sod 是鄂尔多斯高原碱 湖钝顶螺旋藻抗低温、强光的生理基础。 6、日均光照在 50 klux 以下，培养液日均温度在 2224时，鄂尔多斯 高原碱湖钝顶螺旋藻的产量较高。在温度较低、光照充足的深秋，鄂尔多斯高原 碱湖钝顶螺旋藻生长良好，月均产量可达到最高产量的 86.86%，因此，鄂尔多 斯高原碱湖钝顶螺旋藻是一种适宜于我国北方地区养殖的耐强光的低温型藻种。 关键词：鄂尔多斯碱湖钝顶螺旋藻；非洲 chad 湖钝顶螺旋藻；强光；低温；生 理响应 the response of spirulina platensis to low temperature and high light in an alkali lake of the erdos plateau abstract as an economically important alga, spirulina platensiss metabolic response to environmental changes is the focus of many current researches. the breeding species used in the domestic factory was originated from tropical regions, thus is sensitive to cold; for this reason the spirulina cultivation factory were mostly located in southern china, and consequently the development of breeding industry in the north was seriously hampered. the output of spirulina culture in greenhouses at erdos in northern china is drastically dropped during the early spring and late autumn when the species from chad was used due to the poor fitness, while the spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau showed good adaptability with the seasonal changes. this project using the species of spirulina platensis from the alkaline lake of erdos plateau and from the lake of chad africa as experimental subjects systematically characterized the growth, photosynthesis, autioxidant enzyme activities at the conditions simulating the stress of low temperature and high lights and compared the differences of stress responses between spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau and species from chad. in addition, the correlation between output variation and changes in temperature and light intensity of spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau in greenhouse culture was analysised. the results are summarized as following: 1. the photoinhibition of spirulina was significant under the stress of low temperatu- re and high light, the photosynthetic rate dropped drastically with lowering of temperature and longer treating time; the recovery rate for the treated samples varied with wavelengths, with the blue light showing the most remarkable, followed by red light, yellow light, and green light; after stressed by low temperature and high light , the recovery of physical indexes for samples from erdos plateau was faster than that of species from chad; the recovery time negatively correlated with the treating time and the treating temperature; protein biosynthesis involved in recovery of photosynthetic capacity of spirulina. 2. the chlorophyll a, soluble sugar, soluble protein, pc, apc, and carotenoid decreased under the stress of low temperature and high light; the algal filaments was found broken in various degrees after treated with low temperature and high light accompanied by the color change from dark to lighter, the degree of bleaching was higher for species from chad than that for samples from erdos plateau. 3. the structure and function of plasma membrane of spirulina was damaged caused by photo oxidation under the stress of low temperature and high light. the permeability of plasma membrane, the relative conductivity, the content of malondial-dehyde (mda), and free proline increased with lower temperature and longer irradiation; as the stress aggravated, the level of photo oxidation of spirulina platensis was deeper also, the level of photo oxidation of spirulina platensis from chad higher than samples from erdos plateau. 4. the chlorophyll a, protein content, and atp activity of thylakoid membrane of spirulina platensis from erdos plateau was found relatively to be more stable than that of samples from chad under stress, indicated by smaller variation ranges. the atp activity was stable with the temperature in the range of 5 30 . the sds-page showed that low temperature and high light stress induced a new protein band with a molecular weight of 42.18 kda. 5. the activity of cat and sod of the samples were positively correlated with treating time and temperature under high light; the enzymatic activity of spirulina platensis from erdos plateau was higher than that of samples from chad; the activity of pod decreased with treating time prolonged .cat、sod were the physiological basis of spirulina platensis from erdos plateau to low temperature and high light. 6. the output rate of s1 reached the highest when the average illumination per day was below 50 klux and temperature was in the range of 2224 . s1 grew well in the late autumn when the temperature became lower yet the light was sufficient with the output rate being 86.86% of the highest. thus, s1 is a suitable species for cultivation in northern china because its resistance to high light and low temperature. key words: spirulina platensis in the alkaline lake of erdos; spirulina platensis from chad lake of africa; high light;low temperature; physiological response directed by: prof. shaoying zhang applicant for doctor degree: gong donghui (botany) (college of agronomy, inner mongolia agricultural university, hohhot 010018, china) 目 录 1 引言 . 1 1.1 研究的目的和意义 . 1 1.2 研究综述 . 2 1.2.1 螺旋藻的发现及产业化概况 . 2 1.2.2 国内外研究现状 . 2 1.2.3 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻的发现及研究进展 . 4 1.2.4 鄂尔多斯地区螺旋藻产业发展概况 . 6 1.2.5 植物抗性生理概述 . 7 2. 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻光合性能的影响 10 2.1 材料与方法 . 10 2.1.1 实验材料 . 10 2.1.2 实验方法 . 11 2.2 结果与分析 . 17 2.2.1 低温、强光胁迫对鄂尔多斯钝顶螺旋藻光合速率的影响 . 17 2.2.2 低温、强光胁迫对鄂尔多斯钝顶螺旋藻叶绿素a含量的影响 . 18 2.2.3 低温、强光胁迫对鄂尔多斯钝顶螺旋藻类胡萝卜素含量的影响 21 2.2.4 低温、强光胁迫对鄂尔多斯钝顶螺旋藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量影响 23 2.2.5 低温、强光胁迫处理对鄂尔多斯钝顶螺旋藻类囊体膜蛋白的影响 25 2.2.6 低温、强光胁迫处理对鄂尔多斯钝顶螺旋藻类囊体膜 atp 酶活性的影响 29 2.2.7 低温、强光条件下蛋白合成与鄂尔多斯钝顶螺旋藻光合作用 32 2.2.8 低温、强光下鄂尔多斯钝顶螺旋藻总蛋白变化 35 2.3.1 讨论 . 37 2.3.2 小结 . 40 3. 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻细胞膜透性、游离脯氨酸含量的影响 41 3.1 材料与方法 . 41 3.1.1 实验材料 . 41 3.1.2 实验方法 . 41 3.1.3 测定指标与方法 . 42 3.2 结果与分析 . 42 3.2.1 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻细胞外渗液电导率的影响 42 3.2.2 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻丙二醛含量的影响 46 3.3 讨论与小结 . 52 3.3.1 讨论 . 52 3.3.2 小结 . 54 4. 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻 cat、sod、pod 酶活性的影响 54 4.1 材料与方法 . 54 4.1.1 实验材料 54 4.1.2 实验试剂 54 4.1.3 实验方法 . 56 4.2 结果与分析 . 57 4.2.1 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻 cat 酶活性的影响 . 57 4.2.2 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻 sod 酶活性的影响 59 4.2.3 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻 pod 酶活性的影响 60 4.3 讨论与小结 . 61 4.3.1 讨论 . 61 4.3.2 小结 . 62 5 低温、强光对鄂尔多斯钝顶螺旋藻补偿生长的影响 62 5.1 材料与方法 . 62 5.1.1 实验材料 . 62 5.1.2 实验方法 . 63 5.2 结果与分析 . 64 5.2.1 低温、强光处理后鄂尔多斯钝顶螺旋藻生长的恢复 64 5.2.2 低温、强光处理后鄂尔多斯钝顶螺旋藻叶绿素 a 含量的恢复 66 5.2.3 低温、强光处理后鄂尔多斯钝顶螺旋藻可溶性蛋白的恢复 68 5.2.4 低温、强光处理后鄂尔多斯钝顶螺旋藻可溶性糖的恢复 69 5.3 讨论与小结 . 70 5.3.1 讨论 . 70 5.3.2 小结 . 71 6. 鄂尔多斯钝顶螺旋藻中试养殖产量与光温关联分析 71 6.1 材料与方法 . 72 6.1.1 实验材料 72 6.1.2 实验方法 . 72 6.2 结果与分析 . 72 6.2.1 鄂尔多斯钝顶螺旋藻日产量与气温关联分析 . 72 6.2.2 鄂尔多斯钝顶螺旋藻日产量与光照、温度关联分析 . 73 6.2.3 产量与不同光照、温度区间关联分析 . 74 6.3 讨论与小结 . 75 6.3.1 讨论 . 75 6.3.2 小结 . 76 7 结论 . 76 8 研究展望 . 77 致 谢 . 82 参 考 文 献 . 83 作 者 简 介 . 93 插图和附表清单 1. 图 1.1 鄂尔多斯沙区碱湖四种螺旋藻的光镜照片 . 4 2. 图 2.1 强光下不同温度对 s1光合速率的影响 . 17 3. 图 2.2 s1的净光合放氧速率与起始值的百分比 . 17 4. 图 2.3 强光下不同温度对 s2光合速率的影响 . 18 5. 图 2.4 s2的净光合放氧速率与起始值的百分比 . 18 6. 图 2.5 25 oc 下螺旋藻细胞 chla 含量的变化 19 7. 图 2.6 20 oc 下螺旋藻细胞 chla 含量的变化 19 8. 图 2.7 10 oc 下螺旋藻细胞 chla 含量的变化 20 9. 图 2.8 5 oc 下螺旋藻细胞 chla 含量的变化 . 20 10. 图 2.9 10 oc 下螺旋藻细胞类胡萝卜素含量的变化 . 21 11. 图 2.10 15 oc 下螺旋藻细胞类胡萝卜素含量的变化 21 12. 图 2.11 20 oc 下螺旋藻细胞类胡萝卜素含量的变化 22 13. 图 2.12 25 oc 下螺旋藻细胞类胡萝卜素含量的变化 22 14. 图 2.13-图 2.15 处理 30、60、120 min 不同温度下 s1、s2类胡萝卜素含量的变化 . 23 15. 图 2.16 10 oc 下螺旋藻细胞藻蓝蛋白含量的变化 23 16. 图 2.17 15 oc 下螺旋藻细胞藻蓝蛋白含量的变化 23 17. 图 2.18 20 oc 下螺旋藻细胞藻蓝蛋白含量的变化 24 18. 图 2.19 25 oc 下螺旋藻细胞藻蓝蛋白含量的变化 24 19. 图 2.20 10 oc 下螺旋藻细胞别藻蓝蛋白含量的变化 25 20. 图 2.21 15 oc 下螺旋藻细胞藻蓝蛋白含量的变化 25 21. 图 2.22 20 oc 下螺旋藻细胞别藻蓝蛋白含量的变化 25 22. 图 2.23 25 oc 下螺旋藻细胞别藻蓝蛋白含量的变化 25 23. 图 2.24 螺旋藻细胞类囊体膜蛋白含量的变化 26 24. 图 2.25 螺旋藻细胞类囊体膜蛋白含量的变化 26 25. 图 2.26 螺旋藻细胞类囊体膜蛋白含量的变化 27 26. 图 2.27 强光下螺旋藻细胞类囊体膜蛋白含量随温度、时间的变化 28 27. 图 2.28 不同低温处理，s1和 s2类囊体膜蛋白 sds-page 图谱 . 28 28. 图 2.29 螺旋藻细胞类囊体膜 atp 酶活性的变化 29 29. 图 2.30 螺旋藻细胞类囊体膜 atp 酶活性的变化 30 30. 图 2.31 螺旋藻细胞类囊体膜 atp 酶活性的变化 30 31. 图 2.32 强光下螺旋藻细胞类囊体膜 atp 酶活性随温度、时间的变化 31 32. 图 2.33 螺旋藻细胞类囊体膜 atp 酶活性 arrhenius 图 31 33. 图 2.34 链霉素对 s1光合放氧的影响 32 34. 图 2.35 图 2.35 链霉素对 s2光合放氧的影响 32 35. 图 2.36 链霉素对 s1光合恢复的影响 34 36. 图 2.37 链霉素对 s2光合恢复的影响 34 37. 图 2.38 低温、强光处理后 s1光合速率在不同波长的光下随处理时间的变化 35 38. 图 2.39 使用 tablet 直观检测新一代测序数据 . 35 39. 图 2.40 低温、强光处理后 s1总蛋白 sds-page 图谱 . 36 40. 图 3.1 25 oc 下螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 . 43 41. 图 3.2 15 oc 下螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 . 43 42. 图 3.3 10 oc 下螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 . 44 43. 图 3.4 5 oc 下螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 44 44. 图 3.5-图 3.6 螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 . 45 45. 图 3.7-图 3.8 螺旋藻细胞外渗液相对电导率的变化 . 46 46. 图 3.9 25 oc 下螺旋藻细胞 mda 含量的变化 47 47. 图 3.10 20 oc 下螺旋藻细胞 mda 含量的变化 47 48. 图 3.11 10 oc 下螺旋藻细胞 mda 含量的变化 48 49. 图 3.12 5 oc 下螺旋藻细胞 mda 含量的变化 . 48 50. 图 3.13-图 3.16 螺旋藻细胞 mda 含量的变化 . 49 51. 图 3.17-图 3.18 螺旋藻细胞游离脯氨酸含量的变化 50 52. 图 3.19-图 3.20 螺旋藻细胞游离脯氨酸含量的变化 . 51 53. 图 3.21-图 3.23 处理 30、60、120 min 不同温度下 s1、s2游离脯氨酸含量的变化 . 52 54. 图 4.1 螺旋藻细胞 cat 酶活性的变化 . 58 55. 图 4.2-图 4.3 螺旋藻细胞 cat 酶活性的变化 . 58 56. 图 4.4-图 4.5 螺旋藻细胞 sod 酶活性的变化 . 59 57. 图 4.6 螺旋藻细胞 sod 酶活性的变化 . 60 58. 图 4.7-图 4.9 螺旋藻细胞 pod 酶活性的变化 . 61 59. 图 5.1 螺旋藻恢复生长曲线(10处理 30min) 64 60. 图 5.2 螺旋藻恢复生长曲线(20处理 30min) 64 61. 图 5.3 螺旋藻恢复生长曲线(10处理 60min) 65 62. 图 5.4 螺旋藻恢复生长曲线(20处理 60min) 65 63. 图 5.5 螺旋藻恢复生长曲线(10处理 180min) . 65 64. 图 5.6 螺旋藻恢复生长曲线(20处理 180min) . 65 65. 图 5.7 叶绿素 a 含量随时间的变化(10处理 30min) 66 66. 图 5.8 叶绿素 a 含量随时间的变化(20处理 30min) . 66 67. 图 5.9 叶绿素 a 含量随时间的变化(10处理 60min) . 67 68. 图 5.10 叶绿素 a 含量随时间的变化(20处理 60min) . 67 69. 图 5.11 叶绿素 a 含量随时间的变化(10处理 180min) 67 70. 图 5.12 叶绿素 a 含量随时间的变化(20处理 180min) 67 71. 图 5.13 可溶性蛋白含量随时间的变化(10处理 30min) . 68 72. 图 5.14 可溶性蛋白含量随时间的变化(20处理 30min) . 68 73. 图 5.15 可溶性蛋白含量随时间的变化(10处理 180min) 69 74. 图 5.16 可溶性蛋白含量随时间的变化(20处理 30min) . 69 75. 图 5.17 可溶性蛋白含量随时间的变化(10处理 30min) . 69 76. 图 5.18 可溶性蛋白含量随时间的变化(20处理 30min) . 69 77. 图 5.19 可溶性蛋白含量随时间的变化(10处理 180min) 70 78. 图 5.20 可溶性蛋白含量随时间的变化(20处理 180min) 70 79. 图 6.1 产量与温度变化曲线（6-10 月） . 73 80. 图 6.2 产量、温度、光照日变化曲线（8-10 月，2011） . 73 81. 图 6.3 不同光照区间平均日产量变化曲线 . 74 82. 图 6.4 不同温度区间平均日产量变化曲线 . 74 83. 图 9.1 鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻水华 . 79 84. 图 9.2 作者在鄂尔多斯高原碱湖考察和标本采集 . 79 85. 图 9.3 鄂尔多斯高原碱湖现场拍摄的钝顶螺旋藻显微照片 . 80 86. 图 9.4 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻中试跑道养殖池（左）及收藻（右）照片 . 80 87. 图 9.5 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻形态显微照片 . 81 88. 图 9.6 非洲乍得湖钝顶螺旋藻形态显微照片 . 81 89. 表 1.1 鄂尔多斯沙区碱湖四种螺旋藻的形态特征 5 90. 表 2.1 实验材料及来源 . 11 91. 表 2.2 胶体成分 . 15 92. 表 2.3 强光下、不同处理温度时鄂尔多斯钝顶螺旋藻叶绿素 a 含量 . 20 93. 表 6.1 多重比较结果 . 75 内蒙古农业大学博士学位论文 1 1 引言 1.1 研究的目的和意义 螺旋藻是一种属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科的原始藻类 1。其营养成 分和生理活性物质含量极为丰富，具有抗衰老、抗辐射、提高机体免疫功能、抗癌和 防癌等作用。因此，螺旋藻被认为是可开发利用的最有前途的的一种新型的微藻，并 被世界卫生组织和联合国粮农组织誉为21 世纪人类最佳保健品和最理想的食 品 2,3。 国内螺旋藻养殖厂生产所采用的产业化藻种原产地均为国外， 分别是来源于非洲 chad 湖的钝顶螺旋藻（spirulina platensis）和中美洲墨西哥 sosa texcoco 湖的极大螺 旋藻（s. maxima） 4。植物自然地理分布受很多条件的制约，但光照和温度是最主要 的决定性因素，这两个藻种的原产地属于热带地区，均在北纬十几度，因此这两个物 种喜高温，对低温敏感，带有明显低纬度植物的烙印。正因为气候条件的限制，非洲 chad 湖的钝顶螺旋藻和墨西哥 sosa texcoco 湖的极大螺旋藻引入中国后，其养殖工 厂主要分布在云南、广西、福建等南方和沿海气候较热的地区，尽管引进藻种随着时 间的推移有所驯化，一些北方地区也开始螺旋藻的养殖，但主要养殖基地仍分布于北 纬 37 以南。 1996 年，内蒙古农业大学教授乔辰、李博生的螺旋藻课题组在鄂尔多斯高原碱 湖发现了四种螺旋藻，其中一种被藻类学家鉴定为钝顶螺旋藻 57。鄂尔多斯高原成 为了世界上目前发现有钝顶螺旋藻分布的第三个地区，且其分布属高纬度地区（39 23n） 。后来的研究表明：鄂尔多斯钝顶螺旋藻可在-20 45 的温度范围内生存， 适于生长的温度范围为在 6 40 之间，最适生长的光照强度为 1030 klux，最 适生长温度在 24 左右，营养成分分析发现其含有脑黄金（二十二碳六烯酸，学 名 dha） ，是一个具有高营养价值的天然耐低温、温度适应范围广、耐强光的藻种 6。 鄂尔多斯高原毛乌素沙地属于典型温带大陆性干旱、半干旱气候区。气温日、季 节变化大，极端最低气温为-31 ，极端最高气温为 37 ，年平均气温为 6.4 7， 无霜期 130165d；全年日照时间长，太阳辐射能高。初春和深秋是该地区日照最为 充足的时期，平均辐射量达 55 104 kj/m2，平均温度 510 7。在螺旋藻温室养殖 过程中， 初春和深秋的产量与夏季相比有较大幅度的下降， 一般认为是由于低温所致， 作者在实验中发现在初春和深秋 11:0014:00 时螺旋藻的净光合速率下降近 90%， 出 现午睡现象，而这一现象的出现是与低温和强光辐射的耦合作用有关，但其对低温 和强光辐射的反应如何？其组成、 生理功能等方面如何适应低温和强光辐射？机理如 何？其在大规模温室养殖中培养液营养成分、温度、藻体变异等如何控制，藻粉产量 与气候条件之间存在怎样的相关性等等，有必要对这一系列问题进行深入、系统地研 究。本研究以内蒙古鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻和非洲 chad 湖的钝顶螺旋藻为 实验材料，系统地研究了低温和强光辐射胁迫下内蒙古鄂尔多斯钝顶螺旋藻在生长、 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻对低温、强光的响应 2 光合作用、 生理功能、 蛋白表达等方面的应答及与非洲 chad 钝顶螺旋藻的差异比较； 并对鄂尔多斯钝顶螺旋藻规模化温室养殖的产量与光温的关联进行了分析。 以期揭示 该藻对低温和强光的适应性及抗逆机理； 丰富和完善内蒙古鄂尔多斯高原毛乌素沙地 碱湖钝顶螺旋藻生理、生态和抗性生理学的理论； 为螺旋藻养殖在初春和深秋提高产 量、延长养殖时间提供科学依据，为该藻的产业化生产和大规模推广奠定理论基础。 1.2 研究综述 1.2.1 螺旋藻的发现及产业化概况 1940 年，法国药物学家 creach 博士在非洲考察时发现 chad 湖面上有蓝绿色的 水华，当地的土著人捞取这些漂浮物，拌佐料食用，或者晒干后制成类似于饼干的食 物，当地虽蔬菜、肉蛋等食物供给极其缺乏，但土著人身体却十分健壮。藻类学家 dangeard 对 creach 采集的蓝绿色漂浮物进行了鉴定，鉴定结果是 creach 采集到的蓝 绿色水华是蓝藻门的螺旋藻所形成的。法国探险队在 1965 年又来到非洲，且在 chad 湖及其邻近湖泊再次发现蓝绿色的漂浮物，经分类学家 compere p. 鉴定其所采集到 的标本为钝顶螺旋藻(spirulina platensis) 8。关于极大螺旋藻，早在 1521 年西班牙人 就发现当地人食用该湖里的螺旋藻， 并在市场上出售由其加工的食品 （tecuitlatl 饼干） 2 。 sosa texcoco 公司于 1973 年在墨西哥城东北郊的 sosa texcoco 湖兴建了世界上 第一个螺旋藻工厂，利用该湖富含苏打成分的湖水进行半天然的螺旋藻养殖。1978 年，日本大墨水化学公司（dic）在泰国曼谷开始螺旋藻的养殖生产，这也是采用人 工培养池进行螺旋藻商品化生产的起点。 1981 年 dic 公司和美国 proteus 公司合作在 美国加州南部的 calipatria 建立了 earthrise farms 公司，并于 1983 年投产，现在已经 有包括中国在内的十几个国家生产螺旋藻。相对于国外，我国对螺旋藻的研究起步较 晚，但发展很快。1986 年螺旋藻研究列入国家七五科技攻关项目 4，我国第一座螺 旋藻养殖中试基地是胡鸿钧教授于 1989 年在云南程海湖建立的 9。上世纪 90 年代， 螺旋藻的研究和开发利用步入快速发展期，截止到 1995 年，我国螺旋藻干粉年产量 约达 800 吨，占世界产量的 1/4，全国有近 80 多家螺旋藻生产工厂 10。2003 年后， 内蒙古螺旋藻养殖异军突起，依托当地独有的资源优势，螺旋藻养殖产业迅速崛起， 目前鄂尔多斯市鄂托克旗的螺旋藻产量已经占全国总产量的 40%左右， 已成为全国乃 至全世界最重要的螺旋藻养殖地区。 1.2.2 国内外研究现状 自从螺旋藻被发现后，各国学者就开始了对于螺旋藻基础及应用等方面的研究 4。人们从螺旋藻的生理、生态、形态解剖、分子、营养构成等方面开展了一系列系 统的研究。例如：分类：gomont（1892） ，geitler（1932） ，desikachary（1959）和 内蒙古农业大学博士学位论文 3 n. jeeji bai（1999）等分别对螺旋藻分类进行了研究 4,11,12,13；vonshak 在其 1997 年 的专著中对螺旋藻的分类、结构组成、生理代谢、规模养殖等方面进行了全面的介绍 14；分子遗传学和育种：riccardi 等（1981）对编码钝顶螺旋藻的 rubpcase（1， 5二磷酸核酮糖羧化酶）的大小亚基的基因成功分离，并在 e.coli 中得以表达 15； tragut（1995）从钝顶螺旋藻获得了 4 种限制性内切酶，即 spa、spa、spa和 spa ，它们分别是 tthiii、pvu、pvu和 hind r 的同裂酶，这 4 种酶的限制 位点已确定，使人们了解了螺旋藻的 dna 的限制-修饰系统生物学特征 16。培养条 件：1966 年 c. zarrouk 在巴斯德研究所发表螺旋藻培养研究的博士论文 17，第一次 使用人工培养基在实验室成功培养出螺旋藻，使工厂化养殖螺旋藻成为了可能，其所 研制的 z 氏培养液配方至今仍广泛应用于螺旋藻的实验室培养及工厂化生产中 18； ogawa （1970）和 tredici 等（1986）对螺旋藻生长的研究 19,20； kebede （1996 和 1997） 研究了盐分对螺旋藻生长的影响及培养的最适条件 21,22； 生理、 生化和生态： melack （1979）和 vonshak（1996）等对螺旋藻光合作用的研究 23,24；martel（1992）对糖苷 酶的研究 25；iltis（1980）对其生态的研究26等等。 此外，国内学者对螺旋藻的基础和应用研究也不断深入。例如：分类学研究： 胡鸿钧（1999）对螺旋藻的分类进行了较详细的探讨和研究 27；形态学研究：聂明 （2005）使用原子力显微镜对钝顶螺旋藻表面微观形态的观察研究 28；培养条件： 张爱琴等（1989）对不同光质对螺旋藻生长及放氢的影响进行了研究 29；殷春涛等 （1997） 研究了不同培养条件对螺旋藻脂肪酸组成和含量的影响 30； 王巍杰等 （2005） 使用正交实验法对钝顶螺旋藻的培养条件进行了优化 31；生理、生化和生态：林惠 民（1991）对盐泽螺旋藻光合作用的研究 32；邱丽氚等（1998）对大螺旋藻的色素、 吸收光谱、pod 同工酶的研究 33；李庭古（2006）等对不同盐度条件下螺旋藻的生 长和生化成分的变化进行了研究 34； 原生质球： 彭国宏等 （1996） 和郭厚良等 （2000） 对螺旋藻原生质球的制备 35,36；生物活性物质：曾昭琪（1994） 、于平等（2008）对 螺旋藻多糖的研究 37,38；张成武（1996） 、张少斌等（2007）对藻胆蛋白的研究39,40； 基因工程：秦松等（1993）在螺旋藻中发现质粒 41；秦松等（1998）从钝顶螺旋藻 中分离别藻蓝蛋白基因，并分析了其核苷酸序列 42；郑俊枝（1997）将质粒 pbr325 导入螺旋藻细胞内并得以表达 43；张海生等（2008）对 gfp 基因在钝顶螺旋藻中的表 达进行了研究，已初步证明该基因可以在藻株中稳定表达 44。种质的遗传改良，优 良藻种的选育：胡天赐等（1990）用 -射线诱变螺旋藻 45；张学成等（1990）用甲基 磺酸乙酯诱变螺旋藻 46；龚小敏等（1996）使用 co- 射线研究了螺旋藻的的变异情 况 47。但总的来看，其基础研究相对滞后。 关于温度及光强对螺旋藻生长影响的研究，国内外有一些报道。早在 1967 年法 国研究人员通过实验证明钝顶螺旋藻最适生长温度为 3035 ，是属于喜高温的藻 种 8；在实验室中培养，螺旋藻最适生长温度的范围在 3537 之间，在室外培养， 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻对低温、强光的响应 4 培养液温度达到 39 时，持续几个小时，其光合作用的变化不明显，也未见明显的 伤害，白天培养温度低于 15 时螺旋藻的生长会受到抑制 48；最适生长温度为 35 38 ， 其忍受的最高温度是 60 49； 螺旋藻最适生长温度为 2835 ， 40和 15 为其最高和最低生长温度 50。zarrouk 在 1966 年测得极大螺旋藻（s. maxima）的光饱 和区间为 2530 klux 17；vonshak a.在其 1997 年出版的螺旋藻生理、细胞和生物技 术一书中提到螺旋藻生长的最适光照为 150200 mol/m2s 50；巩东辉（2007）报道 鄂尔多斯钝顶螺旋藻的光饱和点为 180360 mol/m2s 51； 但这些仅仅是零星的报道， 且局限于螺旋藻培养温度和光照的研究，缺乏系统、深入的工作，特别是未见到对螺 旋藻因低温和高光强导致的午睡反应及鄂尔多斯钝顶螺旋藻抗寒、 抗强光机理的研 究。 1.2.3 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻的发现及研究进展 鄂尔多斯高原地区碱湖分布密集，但每个碱湖的面积相对较小，该地区有 61 个 大于 1 km2的碱湖，占总湖泊面积的 56.1%，碱湖的总面积约为 189 km2，占总湖泊 数量的 65.8%。从 19952001 年，内蒙古农业大学螺旋藻课题组相继对鄂尔多斯高 原沙区的碱湖进行了调研， 在乌审旗的巴彦淖尔湖和查干淖尔湖以及鄂托克旗的白音 淖尔湖和查汗淖尔湖中发现了 4 种螺旋藻，经藻类学专家鉴定为 2 个新种： 鄂尔多斯 螺旋藻（spirulina erdosensis）和巴彦淖尔螺旋藻（spirulina bayanmurensis）及 2 个 新记录种：钝顶螺旋藻（spirulina platensis）和方胞螺旋藻（spirulina jengr） ，其形态 特征见下图及下表 6。 图 1.1 鄂尔多斯沙区碱湖四种螺旋藻的光镜照片(乔辰，李博生。2001) fig.1.1 light micrographs of spirulina in erdos sandy alkaline 1.鄂尔多斯螺旋藻 s. erdosensis 2.巴彦淖尔螺旋藻 s. bayannurensis 3. 钝顶螺旋藻 s. platensis 4. 方胞螺旋藻 s. jenngr 内蒙古农业大学博士学位论文 5 表 1.1 鄂尔多斯沙区碱湖四种螺旋藻的形态特征 tab. 1.1 morphology of spirulina in the alkaline lakes 物种 鄂尔多斯螺旋藻 s. erdosensis 巴彦淖尔螺旋藻 s. bayannurensis 钝顶螺旋藻 s. platensis 方胞螺旋藻 s. jenngr 细胞宽度（m） 912 1.01.2 7.39.0 57 细胞长度（m） 2.53.7 4.56.3 23 螺宽（m） 2850 3.04.0 3245 912 螺距（m） 3065 1.62.2 2760 32.037.5 横璧 有（lm-sem-tem） 有（tem） 有 （lm-sem-tem） 有（lm-sem-tem） 横璧处颗粒 有 - 有 有 横璧处缢缩 有 - 有 有 末段形态 半球型或略变细或略膨大 钝圆锥型 钝圆或略膨大 半球型 颜色 鲜艳蓝绿色 蓝绿色 暗蓝绿色 鲜艳蓝绿色 浮水型（p）/沉 水型（b） b b p b 注：lm：光学显微镜；sem：扫描电镜；tem：透射电镜 分布有螺旋藻的碱湖位于海拔高度为 13001400 m 的鄂尔多斯高原毛乌素沙 地，该地区从气候区划分应属于较典型的温带大陆性干旱半干旱区，全年降水较少， 四季分明，冬季漫长且温度较低，夏季短暂但最高温度可达 37 ，气温日变化剧烈， 昼夜温差较大， 最低温度-30 左右， 年均气温在 6.4 左右。 年日照时数 29573076 h， 年均太阳辐射总量 57305930 mj/m2。 分布有螺旋藻的碱湖湖水 ph 为 9.310.5， 夏秋季螺旋藻爆发时会形成蓝绿色水华，碱湖中除螺旋藻外，还发现有颤藻、绿藻、 轮虫等浮游生物 7。 鄂尔多斯碱湖螺旋藻的发现具有重要的意义， 一是使我国的螺旋藻种质资源进一 步丰富，为螺旋藻优良藻种的选育提供了新的材料；二是将螺旋藻的分布从低纬度的 热带地区向北推进到处于温带的北纬 39o。鄂尔多斯钝顶螺旋藻是我国目前发现可用 于产业化生产的唯一的低温藻种，改变由于气温原因而使我国在高海拔、高纬度的北 方地区进行螺旋藻养殖受限的局面，并可大大延长中部地区螺旋藻养殖的有效时数。 自 1996 年鄂尔多斯钝顶螺旋藻发现以来，研究人员就开始对其从生理、生化、分子 生物学等方面进行了相关基础研究。高凌岩（2003）对鄂尔多斯钝顶螺旋藻生态适应 性进行了研究，结果表明：该藻在 24 和连续