黑木耳天然黑色素理化性质及其抗氧化活性的研究.pdf

118 黑木耳天然黑色素理化性质 及其抗氧化活性的研究 邹宇1， 尹冬梅2， 胡文忠1， 姜爱丽1 ， 陈 晨1， 顾振新3， * ( 1.大连民族学院生命科学学院， 辽宁大连 116600; 2.上海应用技术学院生态技术与工程学院， 上海 201418; 3.南京农业大学食品科技学院， 江苏南京 210095) 摘要: 对黑木耳天然黑色素的理化性质与抗氧化活性进行了研究， 结果表明: 黑木耳天然黑色素粉末呈黑色( L * = 41.03) ， 略带红色和黄色( a*=2.26， b*=3.78) ， 具有与其他黑色素相似的溶解性; 黑木耳黑色素热稳定性较强， 100 加热 4h 后， 色素保存率仍达到 88.0%， 但对光照敏感， 自然光照射 5d 时残存的黑色素仅为 25.3%; 黑木耳黑色素具有 较强的抗氧化能力， 1.0mg/mL 浓度的黑色素溶液羟自由基清除率和脂质过氧化抑制率均在 40%以上。黑木耳黑色素 可进一步开发为具有保健功能的天然食用色素。 关键词: 黑木耳， 黑色素， 理化性质， 抗氧化活性 Physicochemical properties and antioxidant activities of Auricularia auricula melanin ZOU Yu1， YIN Dongmei2， HU Wenzhong1， JIANG Aili1， CHEN Chen1， GU Zhenxin3， * ( 1.College of Life Science， Dalian Nationalities University， Dalian 116600， China; 2.Ecology School， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China; 3.College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China) Abstract: The physicochemical properties and antioxidant activities of Auricularia auricula( A.auricula) melanin were studied.The result showed that A.auricula melanin powder was dark with a little red and yellow colored( L*=41.03， a*=2.26， b*= 3.78) . The solubility properties of A. auricula melanin were very similar to those of the typical melanin.A.auricula melanin possessed a stronger thermal stability and pigment retention rate was 88.0% after heating at 100 for 4h.Whereas， A.auricula melanin was sensitive to light and pigment retention rate was only 25.3% when irradiation for 5d by natural light. A. auricula melanin exhibited a strong antioxidant activity. At concentration of 1.0mg /mL，hydroxyl radical scavenging activity and lipid peroxidation inhibiting activity of A.auricula melanin were greater than 40%.Thus， A.auricula melanin could be further used as a natural healthful food colorant. Key words: Auricularia auricula; melanin; physicochemical property; antioxidant activity 中图分类号: TS255.1文献标识码: A 文 章 编 号: 10020306( 2013) 05011804 收稿日期: 20120815* 通讯联系人 作者简介: 邹宇( 1979) ， 男， 讲师， 博士， 研究方向: 食品生物技术。 基金项目: 大连民族学院博士启动基金项目( 110015) 。 黑色素是广泛存在于生物体中的一类天然色 素， 通常是由多酚或吲哚化合物氧化聚合而形成， 具 有分子量高、 结构复杂等特点 1 。许多研究证实， 生 物体内的黑色素具有抗氧化、 抗辐射、 抗病毒、 提高 免疫力等许多重要的生理功能， 具有广泛的开发应 用潜力 2 。黑木耳子实体是一种黑褐色可食用的大 型真菌， 其含有丰富的黑色素， 是中国越来越流行的 “黑色食品” 之一。目前， 有许多关于黑色素分离和 特性研究的报道， 并且黑色素被认为是这些黑色食 品中最重要的功能成分之一 3 。然而， 有关黑木耳子 实体中黑色素的研究报道却很少见， 且多数研究集 中于色素的提取和初步的理化性质分析 45 。迄今为 止， 黑木耳黑色素的抗氧化等功能特性方面的研究 尚未见报道。故本实验对黑木耳天然黑色素的理化 性质和抗氧化活性进行较为全面的研究， 旨在为天 然功能性色素的开发利用提供参考。 1材料与方法 1.1材料与仪器 黑木耳子实体干品黑龙江省东宁县市场， 粉 碎后过 40 目筛; 亚油酸、 2， 2偶氮二异丁基脒二盐 酸盐( AAPH) 美国 sigma 公司; 羟自由基测定试剂 盒南京建成生物有限公司; 其余试剂均为国产 分析纯。 CR 400 色差计日本柯尼克美能达公司; UV2802紫外可见分光光度计美国尤尼科公司; KQ250DB 超声波清洗器昆山市超声仪器有限公 119 司; TDL40B 离心机上海安亭科学仪器厂; GHH6 型数显恒温水浴锅国华电器有限公司。 1.2黑木耳天然黑色素提取与纯化 参照 Zou 等 6 的提取与纯化方法。黑木耳子实 体干粉加入蒸馏水( 液固比为 431， mL/g) ， NaOH 调 pH 为 12， 43 超声( 功率 250W) 提取 36min， 样品 4000r/min 离心 5min， HCl 调 pH 为 2， 4000r/min 离 心 5min， 得黑色素粗品。黑色素粗品用 7mol/L HCl 100下水解 2h， 离心( 10000r/min， 20min) ， 沉淀先 后用氯仿、 乙酸乙酯和乙醇洗涤。纯化后的黑色素 冻干并于20保存。 表 2温度对黑木耳黑色素稳定性的影响 Table 2Effect of temperature on stability of A.auricula melanin 温度( ) A400 0h1h2h3h4h 250.721 0.010a0.708 0.008a0.699 0.008a0.696 0.006a0.687 0.003a 500.723 0.007a0.709 0.010a0.695 0.009a0.691 0.006a0.677 0.008a 750.724 0.007a0.711 0.009a0.693 0.006a0.678 0.008b0.665 0.004b 1000.721 0.006a0.699 0.006a0.678 0.006b0.653 0.008c0.634 0.008c 注: 同列不同字母表示在 0.05 水平上有显著性差别， 表 3、 图 1图 3 同。 1.3黑木耳天然黑色素的理化性质 1.3.1粉末颜色黑色素粉末的外观颜色通过色差 计测定， 色差值采用 L*、 a*和 b*表示。 1.3.2溶解性根据 Wang 等 7 的测定方法略作修 改， 100mg 黑色素加入 10mL 水、 酸( pH 3) 、 碱( pH 8) 和常见的有机溶剂( 乙醇、 甲醇、 氯仿、 丙酮、 乙 醚、 石油醚、 苯、 乙酸乙酯、 正丁醇) 中， 搅拌 1h， 静置 0.5h， 观察黑色素的溶解情况。 1.3.3热稳定性将 50mg/L 的黑色素溶液( pH9.0) 分别置于 25、 50、 75 和 100 的恒温水浴中保温 4h， 每隔 1h 取样， 参考 Wang 等 7 的黑色素测定方法， 测 定样品 400nm 吸光度值。 1.3.4光稳定性将 50mg/L 的黑色素溶液( pH9.0) 分别置于暗处( 对照) 、 自然光和白炽灯光( 300lx) 下 照射 5d， 在 0、 1、 3 和 5d 时分别取样， 测定 400nm 吸 光度值 7 。 1.4黑木耳天然黑色素的抗氧化活性 1.4.1还原力在 Oyaizu 等 8 方法基础上适当调 整。取黑色素溶液1mL， 依次加入3.0mL 0.5mol/L 磷 酸盐缓冲液( pH6.6) 和 2.5mL 1% 六氰合铁酸钾溶 液， 50保温 20min， 再加入 2.5mL 10% 三氯乙酸溶 液， 3000r/min 离心 10min， 取上清液 2.5mL， 依次加 入 2.5mL 蒸馏水， 0.5mL 0.1% 三氯化铁溶液， 静置 10min， 700nm 下测定吸光度值。 1.4.2羟自由基清除能力采用羟自由基测定试剂 盒， Fenton 反应产生羟自由基， H2O2的量与羟自由基 量呈正比， 当给予电子受体后， 用 griess 试剂显色， 形 成红色物质， 其呈色与羟自由基的量成正比关系。 清除率( % )= A0A1 A0 100 式中， A0为空白样品反应后吸光度值; A1 为样 品反应后吸光度值。 1.4.3脂质过氧化抑制能力参考 Gabrielska 等 9 的测定方法。取1mL 样品溶液于10mL 具塞试管中， 依次加入 2mL 2.51% 亚油酸无水乙醇溶液， 4mL 0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液( pH7.0) ， 2mL 蒸馏水， 0.417mL 0.1mol/L AAPH， 密闭后置于暗处， 37保温 200min。取0.1mL 混合溶液， 加入9.7mL 75% 的乙醇 和 0.1mL 30% 硫氰酸铁， 再加入 0.1mL 0.02mol/L 氯 化亚铁( 溶解于 3.5% 盐酸中) ， 混匀后反应 5min， 500nm 测定吸光度值。 抑制率( % )= A0A1 A0 100 式中， A0为空白样品吸光度值; A1 为样品反应 后吸光度值。 2结果与分析 2.1黑木耳天然黑色素的理化性质 2.1.1颜色色差计测定结果中 L*表示亮度， a*表 示红/绿， b*表示黄/蓝。由表 1 可知， L*值较大， 而 a*值和 b*较小， 这表明黑木耳黑色素是趋近于黑色 并略带红色和黄色的固体粉末。黑木耳子实体生长 在自然环境中的固体培养基上， 其黑色素包含了一 些其它物质， 如蛋白质、 碳水化合物和金属离子 等 10 ， 这些物质已经成为黑木耳黑色素的一部分， 因 此表现出红色或黄色等多种颜色。 表 1黑木耳黑色素的外观颜色 Table 1Color values of A.auricula melanin 样品 颜色指标 L*a*b* 黑木耳色素41.03 0.312.26 0.303.78 0.21 2.1.2溶解性黑木耳黑色素不溶于水， 也不溶于 乙醇、 甲醇、 氯仿、 丙酮、 乙醚、 石油醚、 苯、 乙酸乙酯、 正丁醇等常见的有机溶剂， 但极易溶解于碱性溶液 ( pH 8) 中， 而在 pH 小于 3 的酸性溶液中沉淀。黑 木耳黑色素的溶解性与报道的乌骨鸡 10 、 红茶叶11 、 山杏种皮 12 中黑色素的溶解性十分相似。 2.1.3热稳定性由表 2 可知， 黑木耳黑色素在 25加热4h 仅损失4.7% ， 随着加热温度的升高和加 热时间的延长， 黑木耳色素的保存率有所下降， 但在 100加热 4h 后， 色素保存率仍达到 88.0% ， 这表明 黑木耳黑色素较为耐热， 具有一定的热稳定性， 这与 张金萍等 13 的研究结果相一致。 2.1.4光稳定性光照是对色素稳定性影响比较显 著的因素之一。由表 3 可知， 黑木耳黑色素在暗处 保存5d， 其损失率不超过1% 。但是在自然光下存放 仅 1d， 色素损失率就达到了 16.0% ， 存放 5d 时残存 120 表 3光照对黑木耳黑色素稳定性的影响 Table 3Effect of different light sources on stability of A.auricula melanin 光照条件 A400 0d1d3d5d 暗处0.719 0.007a0.717 0.007a0.716 0.007a0.712 0.009a 自然光0.722 0.009a0.607 0.013c0.391 0.010c0.183 0.021c 白炽灯0.722 0.009a0.663 0.009b0.565 0.008b0.400 0.018b 的黑色素仅为 25.3% 。黑木耳黑色素在白炽灯照射 下， 具有与自然光照射时相似的变化规律， 白炽灯照 射 5d 时黑色素残存率为 55.4% ， 这表明光照对黑色 素的破坏作用随时间的延长而增强， 且光照强度越 高， 破坏程度越大。这可能是由于黑木耳黑色素在 光照过程中其结构发生了变化， 导致稳定性降低 14 。 2.2黑木耳天然黑色素的抗氧化活性 2.2.1还原力测定还原力是为了检验样品的电子 供应能力， 还原力强表明样品可供应较多的电子。 这些电子可使 Fe3 +还原为 Fe2 +， 同时参与自由基反 应， 使自由基变成更加稳定的物质。从图 1 可以看 出， 黑木耳黑色素的还原力随着添加浓度的增大而 成正比例上升趋势， 这表明黑木耳黑色素是良好的 电子供应者， 能提供电子并将自由基转变为稳定的 产物， 从而终止自由基链式反应。 图 1黑木耳黑色素的还原力 Fig.1Reducing power of A.auricula melanin 图 2黑木耳黑色素清除羟自由基能力 Fig.2Hydroxyl radicalscavenging activities of A.auricula melanin 2.2.2羟自由基清除能力羟自由基通常产生于抽 氢反应和加成反应过程中， 其可轻易通过细胞膜， 并 与细胞内的碳水化合物、 蛋白质、 DNA 等生物大分子 发生反应， 从而导致细胞损伤。由图 2 可知， 在 0.2 1.0mg/mL 浓度范围内， 黑木耳黑色素对羟自由基的 清除率在 30% 50% 之间， 这与提取自红茶叶中黑色 素的羟自由基清除率相同 15 。 2.2.3脂质过氧化抑制能力脂质过氧化可使细胞 膜内的磷脂、 酶、 多不饱和脂肪酸和核酸等发生改 变， 降低细胞膜的流动性和通透性， 最终导致细胞死 亡。由图 3 可见， 黑木耳色素浓度在 0.6mg/mL 以下 时， 脂质过氧化抑制率随添加浓度的增加而增大， 但 当浓度超过 0.6mg/mL 时， 脂质过氧化的抑制率保持 在 43% 左右不变， 此抑制率略低于乌骨鸡黑色素的 脂质过氧化抑制率 10 。 图 3黑木耳黑色素抑制脂质过氧化能力 Fig.3Lipid peroxidationinhibiting activities of A.auricula melanin 3结论 提取并纯化了黑木耳子实体中的天然黑色素， 色差计测得黑色素粉末呈黑色， 略带红色和黄色， 不 溶于水和有机溶剂， 仅溶于碱性溶液; 黑木耳黑色素 具有较强的热稳定性， 但对光照敏感， 长时间强光照 射可引起黑色素大量损失; 黑木耳黑色素具有较强 的抗氧化活性， 还原力随添加浓度的增加而增大， 1.0mg/mL 浓度的黑色素溶液羟自由基清除率和脂 质过氧化抑制率均在 40% 以上。 参考文献 1 Riley PA. 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