利用蛋白质进行预测的方法.ppt

2019/7/21,第 六 章 利用蛋白质进行预测的方法,2019/7/21,第一节 概述,20世纪60年代后期，Anfinsen首先发现去折叠蛋白或者说变性(denatured)蛋白质在允许重新折叠的实验条件下可以重新折叠到原来的结构，这种天然结构(native structure)对于蛋白质行使生物功能具有重要作用，大多数蛋白质只有在折叠成其天然结构的时候才能具有完全的生物活性。自从Anfinsen提出蛋白质折叠的信息隐含在蛋白质的一级结构中，科学家们对蛋白质结构的预测进行了大量的研究，运用适当的算法，从氨基酸序列出发，预测蛋白质的结构。,2019/7/21,1.意义,一种生物体的基因组规定了所有构成该生物体的蛋白质，基因规定了组成蛋白质的氨基酸序列。虽然蛋白质由氨基酸的线性序列组成，但是，它们只有折叠成特定的空间构象才能具有相应的活性和相应的生物学功能。了解蛋白质的空间结构不仅有利于认识蛋白质的功能，也有利于认识蛋白质是如何执行其功能的。确定蛋白质的结构是非常重要。,2019/7/21,意义,分析蛋白质结构、功能及其关系是蛋白质组计划中的一个重要组成部分。 研究蛋白质结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质（或其它分子）之间的相互作用，对于生物学还是对于医药学都是非常重要。 新发现的蛋白质分子，通过结构分析，可以进行功能注释，指导进行功能确认的实验。 通过蛋白质的结构分析，确认功能单位，为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据，同时为新的药物分子设计提供合理的靶分子结构。,2019/7/21,2. 蛋白质折叠结构,蛋白质序列由相应的核酸序列所决定，通过对基因的转录和翻译，将原来四字符的DNA序列，根据三联密码规则翻译成20字符的蛋白质氨基酸序列。 蛋白质具有不同的长度、不同的氨基酸排列和不同的空间结构。蛋白质中相邻的氨基酸通过肽键形成一条伸展的链，肽链上的氨基酸残基形成局部的二级结构，各种二级结构组合形成完整的折叠结构。 在蛋白质的空间结构中，序列上相距比较远的氨基酸可能彼此接近。 在水溶液中,由于氨基酸残基的疏水性，肽链折叠成为特定的三维结构。氨基酸疏水片段位于于分子的内。,2019/7/21,例: 酪氨酸磷酸酶的蛋白质序列,2019/7/21,例: 酪氨酸磷酸酶的蛋白质序列的二级结构,H 代表螺旋，E 代表折叠，B表示桥，G表示310螺旋，I表示螺旋，T表示氢键转角，S代表转向,2019/7/21,例:酪氨酸磷酸酶的蛋白质序列的三级折叠结构,2019/7/21,3. 蛋白质结构预测问题,寻找一种从蛋白质的氨基酸线性序列到蛋白质所有原子三维坐标的映射。 自然界实际存在的蛋白质是有限的，并且存在着大量的同源序列，可能的结构类型也不多，序列到结构的关系有一定的规律可循。因此，蛋白质结构预测是可能的。,2019/7/21,蛋白质结构预测的核心问题,序列结构功能,.-Gly-Ala-Glu-Phe-.,功能,2019/7/21,4. 蛋白质结构预测的两大类方法：,（1）理论分析方法 通过理论计算（如分子力学、分子动力学计算）进行结构预测。 （2）统计的方法 对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到以级结构结构的映射模型，根据映射模型直接从氨基酸序列预测结构。 包括： 经验性方法 结构规律提取方法 同源模型化方法,2019/7/21,5. 蛋白质功能结构的分析流程,2019/7/21,6. 蛋白质预测免费工具,NCBI: BLAST提供的工具(已介绍) ExPASy: Expert Protein Analysis System / 瑞士生物信息院提供的蛋白质在线分析工具,包括: 蛋白数据库(SWISS-PROT) 蛋白分析工具:蛋白质辨识、蛋白序列、结构分析、同源性分析、DNA-蛋白质转换、一级结构分析、二级结构分析、三级结构分析、跨膜序列预测、信号肤等。 /tools/ 此外还提供了多数知名分析工具。,2019/7/21,第二节 蛋白质辨识,1、AAComIdent 功能：利用氨基酸组成识别未知蛋白质。 前提：如只有蛋白的氨基酸组成、pI值和分子量,就可用AACompIdent寻找相似蛋白。 过程：将查询蛋白与库中已知蛋白进行比较,给出相似蛋白及其打分。 该程序需输入蛋白质的氨基酸组成、等电点pI和蛋白质分子量、正确的物种分类等关键词。 有6种氨基酸框架可选择，不同的框架对分析方式有一定的影响。,2019/7/21,AACompIdent,对数据库中的每一个序列根据序列组成差异打分，询结果由电子邮件返回,共有3级列表： 所列蛋白只考虑物种分类不考虑pI和分子量。 不考虑物种分类、pI和分子量的全体蛋白。 即考虑物种分类,也考虑pI和分子量。 蛋白质RRF-ECOLI(P16174)EMAIL结果实例 注意：零分表明查询序列与提出的序列完全相符，打分越低相似性越高。,2019/7/21,2. AACompSim,与AACompIdent以实验室所得的氨基酸组成为依据进行搜索不同,AACompSim使用SWISS-PROT蛋白质的序列为依据,将用户要查询的蛋白与SWISS-PROT数据库中的蛋白质的序列进行比较、辨识,检测蛋白质之间的微弱关系。 与AACompIdent算法类似,该算法也提供了4种氨基酸的组合方式(Constellation)供用户选择,查询时用户需要在4种氨基酸组合中挑选其一,输入所要查询蛋白的SWISS-PROT ID、物种。 查询结果输出与AACompIdent类似,见P121,2019/7/21,3. PROPSEARCH,如果序列的相似性小于特异性阈值25%,通常的蛋白质辨识工具就难以辨识其功能和结构的相似性。如查询蛋白是一个新蛋白,也不能用序列对比的方法查询。 PROPSEARCH方法可解决上述问题。PROPSEARCH忽略了蛋白质的氨基酸残基顺序,利用蛋白的氨基酸组成来检测蛋白质之间的联系。它使用了144种不同的物化属性，如：分子量、巨大残基含量、小残基含量、平均疏水性、平均电荷、所选择的二肽集团的含量等进行分析。 这些物理属性集合被称为“查询向量“,PROPSEARCH将“查询向量“与目标数据库(SWISS-PROT)中“向量数据库“逐个进行比较,然后给出计算结果。 利用PROPSEARCH查询十分简单,可在线分析。 访问PROPSEARCH的Web页面和Expasy的连接进行计算，用EMAIL返回结果。,2019/7/21,PROPSEARCH查询结果,E-mail输出结果包括3个部分： 解释性材料 距离分值(DIST)与整个目标数据库的直方图。DIST列是距离分 值,表示查询序列与PROPSEARCH找到的属于同一家族的序列之间的相似性程度,该分值通常表明具有相似的功能,分值越低,相似度越大,零分表示完全相似。 分值在0.01.3,相似度为99.9%,分值在10.011.2相似度为80%。“Number of hit”列给出的是数据库中具有该分值的蛋白数目。 查询结果综合表 “DIST“结果按距离分值顺序排列;“ID“为该蛋白在SWISS-PROT中的标识； “LEN2“表示该蛋白与查询蛋白重叠的序列的长度;“POS1“、“POS2“是重叠序列的起始、终止位点;“pI“是计算出该蛋白的pI值;“DE“是SWISSPROT中对该蛋白的描述。,2019/7/21,4. PepMAPPER,PepMAPPER(Protein Mapper)是利用质谱(MS)技术获得信息,通过测量被特定蛋白酶消化得到的肽段进行数据库比较,进行蛋白质辨识分析的工具。 该方法不需全部或部分测序,显著的减少了实验时间。 用户登陆PepMAPPER网页，在线输入蛋白的物种分类、所用的消化酶、质谱中得到的粒子类型、每个肽段的电荷数、肽段的pI值等。,2019/7/21,第三节 序列的物理性质,1、Compute pI/MW(ExPASy) Compute pI/MW是计算输入序列等电点和分子量的工具。 分子量的计算是把序列中每个氨基酸的平均分子量加在一起,在加上一个水分子的分子量。该工具使用时非常简单,可上网输入查询序列。 可用2种输入方法: 把序列整理为FASTA格式,该工具会自动计算全序列的pI值和分子量; 提供SWISSPROT标识,即ID(如G3PZHUMAN)或SWISS- PROT/TrEMBL注册号:AC(如zP04406)。在计算结果中,该工具会提醒用户是计算全序列还是中间某一片段,如果是片段,请输入N端和C端位置,结果中该工具不仅给出pI值和分子量,还提供该条目的描述和物种记录。,2019/7/21,3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3P2-HUMAN,p04406),查询其100200氨基酸残基的分子量和pI值的结果,2019/7/21,2. PeptideMass,PeptideMass工具针对肽段图谱进行分析,主要用来预测蛋白质在与特定的蛋白酶或化学试剂作用下的内切产物。 这些蛋白酶和试剂包括: 胰蛋白酶(Trysin） 糜廉蛋白酶(Chymotrypsin） LysC、ArgC、Asp N、Glu C 溴化氰。 另外，半光氨酸和甲硫氨酸可在计算产物肽段之前加以修饰。,2019/7/21,PeptideMass,分析可用一段原序列,也可提供SWISSPROT标识,| 如果是后者,PeptideMass工具还能利用SWISS-PROT库中的信息进行改进计算:除去信号序列、在剪切之前引入已知的翻译后的修饰等。 然后用户在“Select an enzyme,一项中选择想要的酶。 PeptideMass工具将输出的结果列成表格,其中包括输入蛋白的pI理论值和分子量,SWISSPROT库中相关变种的分子量、位点、修饰后的分子量和信息,肽片段的序列。 示例结果,2019/7/21,3. SAPS,SAPS(Statistical Analysis of Protein Sequence) 是瑞士实验癌症研究院提供的蛋白质序列统计分析方法,用于查询序列的统计信息。 将查询蛋白序列提交给SAPS Web服务器, 对查询序列分析,输出该蛋白的物理化学性质信息,如:各种氨基酸的含量、整个序列电荷分布、正负电荷聚集区分析、高疏水性区域和跨膜区段、重复序列、周期性等分析结果。,2019/7/21,第四节 二级结构和折叠类型,蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构。主要为:-螺旋(-helix)、折叠( pleated sheet)、 转角( -turn)、无规则弯曲(Random Coil)。 在许多蛋白质分子中,可发现2个或3个具有二级结构的肽段,在空间上相互接近,形成一个具有特殊功能的 空间结构,称为基序(Motif)。 一个基序总有其特征性的氨基酸序列,并发挥特殊的功能。一级结构是二级结构的基础,有时蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代,都会严重影响空间构象乃至生理功能,如,由蛋白质分子发生变异产生的“分子病“。研究蛋白质的二级结构对确定蛋白质空间结构有重要意义。,2019/7/21,二级结构和折叠类型,己知蛋白质的性质和结构信息可以到SWISS-PROT或PHD数据库中检索。 对新发现的蛋白质或功能未知的基因产物进行分析,首先用BLAST或其他工具在公共数据库中进行相似性搜索,寻找相匹配的蛋白质。 当无法找到匹配蛋白质,或有时虽然找到 一个有统计学意义的匹配蛋白质,但序列中记录也没有其二级结构的信息。 因此，利用二级结构和折叠类型的预测工具可以预测出序列折叠成-螺旋和 -折叠的能力、可能存在的基序以及功能结构域。,2019/7/21,二级结构和折叠类型,蛋白质二级结构的预测方法与核酸序列预测类似, 大多采用了“神经网络”算法,在计算过程中，通过已知数据库中数据作为训练样本进行学习，然后进行预测。 有关的二级结构的工具有很多,其中有商用软件,也有在线提供的免费软件,有些仅限用于UNIX机上。我们主要介绍NNPREDICT、PredictProtein 和SOPMA 3种计算工具。,2019/7/21,1 . NNPREDICT,NNPREDICT 工具使用了一个双层前馈神经网络，预测每个氨基酸分配的类型。 使用简单,可以直接登陆NNPREDICT网页或通过ExPASy页面上的Protemics Tools链接或发送电子邮件，将查询序列提交给： 每个电子邮件只能提交1个序列。 NNPREDICT服务器使用FASTA格式文件 NNPREDICT的输入页面。,2019/7/21,NNPREDICT 的输出结果说明,NNPREDICT的输出结果包括用单字符或3字符表示的序列、蛋白质的折叠类型： 残基的预测结果中:“H”表示螺旋,“E”表示链,“T”表示拐角,”“为未给出预测 。 如果没有关于折叠类的信息,预测在缺省条件(不定折叠类)下进行。 NNPREDICT的准确率超过了65%。,2019/7/21,NNPREDICTFOSB_HUMAN Protein fosB结果,2019/7/21,2. PredictProtein,PredictProtein是一个综合性程序,它的功能很全,既包含数据库搜索部分,又包含蛋白预测部分。数据库搜索部分包括多序列比较(Maximm)、功能区检测(PROSITE、组成偏好-低复杂区域的检测(SEG、结构域(PRODOM)、折叠区域(TOPITS）预测部分包括二级结构、跨膜螺旋、球形蛋白、卷曲螺旋、二硫键、结构转换区。对用户输入的查询序列,程序既可以进行同源性比较,又可以进行二级结构预测。,2019/7/21,PredictProtein计算过程:,先将待查询的蛋白序列在SWISSPROT库中进行搜寻,找出相似的序列。第1次搜索完成后,采用1个叫MaxHom的算法将所有找到的序列与查询序列进行对比,产生1个对比后的特征简图;然后利用产生的简图在SWISS-PROT库中进行第2次搜索,寻找相似序列,而MaxHom算法产生的序列放入1个神经网络,用PHD算法进行预测;最后预测结果给每个残基分配1个二级结构类型,并对序列每个位点的预测可信度给予统计分析。该方法的平均准确率超过72%,最佳残基预测准确率大于90%。 可登陆PredictProtein的主页或ExPASy上“Proteomics Tools”的链接使用。,2019/7/21,PredictProtein计算结果:,该计算程序要求输入E-mail地址、查询序列。 按 PREDITION按钮,完成查询。随即会出现确认页面,提示用户提交的序列已经被接受,列出E-mail地址、查询序列。 其优点：确认页面上同时提供其他服务供用户选择、包括蛋白质功能位点的选择、确定信号肽、其它二级结构预测、跨膜区域预测等,这些服务全部列出表格。 在使用PredictProtein预测的同时,可以用不同的工具进行二级结构预测,将结果进行相互比较，也可以获得有关该蛋白的其他信息, 简便实用,也利于将结果相互比较。查询结果也以Email形式返回。 总输出结果示例（H16109）,2019/7/21,3. SOPMA -法国Lyon,SOPMA采用了5种方法对蛋白质二级结构进行预测,然后将结果优化组合,汇集整理成一个结果。5种方法包括: GOR (Garnier-Gibrat-Robson)方法 Levin同源预测方法,双重预测方法 PredictProtein中的PHD方法,SOPMA方法 SOPMA用这些方法建立已知二级结构的蛋白数据库,库中的每个蛋白都经过二级结构预测,然后用从库中得到的信息对查询序列进行二级结构预测。 登录网站或发电邮到deleageibcp.fr 查询。 ExPASy上“Proteomics Tools”有链接。 使用E-mail查询时应注意,邮件主题标明SOPMA。,2019/7/21,SOPMA分析的结果,SOPMA分析的结果分为4部分: 1.整个序列上的各个氨基酸可能的二级结构 2.整个序列上的各种氨基酸的含量 3.整个序列上的二级结构直方图 4.整个序列上的二级结构分布曲线,2019/7/21,4. 各种方法的比较,以上各方法在预测二级结构方面都不错,但均不完美。 NNPREDICT简单明了 PredictProtein方法在整体上预测表现较好,而且带有相关预测 SOPMA的输出形式比较直观。 建议将序列提交给多个服务器,将结果汇集整理,选取共性较大的结果。,2019/7/21,第五节 特殊结构或特征结构,像螺旋和折叠的位置可以较为准确地预测出一样,其他特定的结构或结构特征,如跨膜区域和信号肽等特征也可以预测出来。 目前,由于这些结构或结构特征的折叠规律尚不十分清楚；因此,有关软件不是很多,常用ExPASy上相关工具进行分析。,2019/7/21,1. 跨膜区域预测,对于跨膜蛋白中跨膜区域的预测,对蛋白质的性质研究非常重要。一旦确定了跨膜蛋白的跨膜区域, 就可以对跨膜区域的氨基酸残基顺序、官能团性质、可能的立体结构进行研究,以确定蛋白质在细胞信号传导机制、细胞识别等方面的生物功能。 跨膜区域预测,网上提供了许多专门预测方法,如前面提到的Predictprotein， 在 Proteomics Tools上提供免费的计算工具还有DAS、TMAP、TMPM等。 可以通过Proteomics Tools连接进入各算工具。 重点介绍DAS和Tmpred两种预测方法。,2019/7/21,示例结果,已知G蛋白偶联受体有7个跨膜区域,从SWISSPROT数据库中查得这7个跨膜区域的位置分别在4874，84104,120141,160180, 212238,255279,304321，以此为例分别用DAS和Tmpred应用程序预测跨膜区域。,2019/7/21,1.DAS,在Expasy的Proteomics Tools 网页种找到DAS的连接，可见界面十分简洁,用户只需将查询序列输入序列文本框即可。 结果：,2019/7/21,2.TMpred,TMpred是一个专门预测跨膜区的方法。 利用源自SWISSPROT的TMbase跨膜蛋白数据库,其包含有每个序列的附加信息，如：跨膜结构区域的数量、跨膜结构域的位置及侧翼序列的情况。 TMbase将这些信息与若干加权矩阵结合起来进行预测分析。TMpred将这些信息与若干加权矩阵结合起来进行预测。 在TMpred的Web界面上可输入用单字符表示的查询序列,并可以指定预测时采用的跨膜螺旋疏水区的最小长度和最大长度。,2019/7/21,TMpred 输出结果,TMpred 输出结果包括: 跨膜螺旋区、相关性列表、建议的跨膜拓扑模型以及示意图。 在每种模型中指出跨膜段的起始位点，结果所打的分数（500）,膜的取向:由内向外或由外向内。 其它跨膜预测工具的应用与上述两个类似, 可以采用多种工具分析,然后进行比较,选择一个比较满意的结果。,2019/7/21,2. 信号肽,信号肤是未成熟蛋白质中,可被细胞转运系统识别的特征氨基酸序列。蛋白质在核蛋白体合成后要靶向输送到执行功能的地点。穿过合成所在细胞到其他组织细胞中的蛋白质统称为分泌性蛋白质。分泌性蛋白上有一段疏水性氨基酸较多的肽段,称为信号肤(Signal Peptide）其作用是把合成的蛋白转移到细胞膜并与细胞膜结合，然后把合成蛋白送出细胞外。,2019/7/21,信号肽的一级结构的特点,由1O多个至40多个氨基酸残基组成, 分为3个区段： N端有带正电荷的氨基酸,如赖氨酸和精氨酸,称为碱性氨基末端。 中间较大的以中性氨基酸为主的疏水核心区,常见有亮氨酸、异亮氨酸等。 C端含有小分子如甘、丙、丝氨酸较多,是被信号肽酶剪切的部位,称为加工区。,2019/7/21,SignalP 分析工具,SignalP 分析工具是网上免费用来检测信号肽及其剪切位点的工具,主要适用于分泌型信号肽,而不是参与细胞内信号传递的蛋白。也同样采用了神经网络算法,用已知信号序列的革兰革兰阴性原核生物、革兰阳性原核生物及真核生物的序列作为训练集的计算结果。,2019/7/21,SignalP网页,http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP,丹麦技术大学生物序列分析中心) 或通过ExPASy上的proteomics tools 链接。 SignalP查询可在第1个框架里输入待查询的氨基酸序列,也可以在第2个框架中输入文本格式的文件。 利用该预测工具,用户每天可处理2000个氨基酸序列,每个序列不超过4000个氨基酸。,2019/7/21,SignalP输出结果与格式:,输出结果分为两部分:SignalP对序列各个氨基酸位点打分;SignalP最后的预测结果。 在第1部分,C是原始剪切位点的分值;S是信号肤的分值;Y是前两项的综合分值,表明该位点具有高C分而S分又从高转低的特性。对于典型的信号肽,C和Y的分值应该在剪切点之前+1位点高,同时S分应该在剪切点之后分数高。对于非典型的信号肽,单靠最大C分值不能准确预测出信号肽,但结合Y分值后就能准确预测信号肽。对于典型的非分泌蛋白,整个序列的各项分数都很低。有的非分泌性蛋白虽然C分和S分都高于域值,SignalP根据其Y分和S分平均值仍能准确判断。,2019/7/21,3. 卷曲螺旋,预测卷曲螺旋的工具有Coils、Pairciol以及Muticol，可在Expasy的Protemics Tools上找到。 Coils的界面很简单。 COILS算法是将查询序列在卷曲螺旋结构蛋白的数据库中进行搜索,同时也将查询序列与球状蛋白序列PDB次级库进行比较,根据两个库搜索结果决定序列形成卷曲螺旋的概率。可在Web界面使用。使用COILS程序时要求序列为GCG或FASTA格式,一次可以提交一条或多条序列。,2019/7/21,选择两种打分序列中的1种:,MTK：根据肌球蛋白、原肌球蛋白和角蛋白序列得到的打分矩阵; MTIDK：根据肌球蛋白、原肌球蛋白和中间纤维类蛋白、桥粒蛋白和角蛋白得到的打分矩阵。 前者适合检测双链结构,后者适合其他情况。程序还提供一个权重选项:可以给每个卷曲a、d位残基和b、c、e、f、g位残基相同权重。如果在有权重和无权重项下得到的结果相差很大,表明可能存在错误。COILS是用来检测与溶液接触的左曲螺旋的,包埋螺旋或右螺旋很可能检测不到。最后输出一张预测结果图,显示沿序列各个部分形成卷曲螺旋的倾向性。l,2019/7/21,结果图,2019/7/21,Paircoil 工具,Paircoil分析界面,2019/7/21,第六节 三级结构的预测,蛋白质的一级结构决定了蛋白质的构象,那么,多个序列就可能决定同一个构象,由此开发出蛋白质的三级结构预测方法。当前主要有同源建模“Threading“方法和结构对比方法。 “Threading”方法是把已知由X射线衍射或核磁共振得到的蛋白质作为靶蛋白建立坐标。把预测蛋白穿过坐标,逐个位置移动比较算出残基相互作用力和疏水作用的大小,以预测序列在结构上的可能位置。但由于该程序