枯草芽孢杆菌的生理和培养特性研究.pdf

广东饲料第 1 7卷第 4期 2 0 0 8年 4月 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 生 理 和 培 养 特 ，I 生x 0 1 - 究 杜 冰 r ， 杨公 明 ， 刘长海 ， 张延 涛 。 ， 张忠武 。 ( 1 华南农业大学食品学院， 广东 广州 5 1 0 6 4 2 ； 2 仲恺农业技术学院食品科学系， 广州 5 1 0 2 2 5 ) ( 3 广州广牧丰生物技术有限公司， 广州 5 1 0 6 6 3 ) 中图分类号 T Q9 2 O 6 文献标识码 C 【 文章编 1 0 0 5 8 6 1 3 ( 2 0 0 8 ) 0 4 - 0 0 2 6 - 0 2 随着人们对饲料中添加抗生素作为生长促进 剂 的弊端认识的加深 ，作为饲用抗生素替代 品的 益 生菌 制剂 受 到 了众 多关 注并获 得 了广 泛 的应 用。由于饲料加工及贮运过程 中对菌体的灭活作 用 ，近年来研究热点都集 中在 如何提高益生菌制 品稳定性上 ， 其 中产芽孢的细菌倍受关 注( F u l l e r R等 ， 1 9 8 9 ) 。我 国农业部第 1 0 5号公告公布 的允 许使用 的饲料添加剂品种 目录 中，产芽孢 的细菌 有枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌两种 。本 文以从 豆豉 中分离 出来 的 K M F 一 6枯草芽孢杆 菌为 出发 菌株 ， 对其液体 生长和生理特性进行了研究。 1 材料 与方 法 1 1菌种 枯草芽孢杆菌 ( B a c i l l u s s u b t i l i s ) K MF 一 6 ， 由广州 广牧丰生物技术有限公司提供 ， 分离 自市售豆豉。 1 2培 养基 斜面培养基 ： 蛋 白胨 2 g ； 酵母膏 0 3 g ； 葡萄糖 0 2 g ； 琼 脂 2 g ； p H7 2 。 种子培养基 ： 葡萄糖 3 g ； 酵母膏 l g ； 蛋 白胨 l g ； Ca SO4 l g； Mg C1 2 2 g。 1 3试 验 方 法 1 3 1 种 子培 养 ： 取斜 面 菌种 ， 加 5 m L无 菌生 理 盐水 ， 制成 菌悬 液 ， 混匀后取 0 3 mL加入 3 0 m L种 子培养基 ， 置于 2 5 0 m L三角瓶中， 3 8 ， 1 8 0 r h n i n ， 振 荡 培养 2 0 h 1 3 2发酵培养： 取一定的种子培养液接入发酵 培养基 中， 3 8 ， 1 4 0 r h n i n振荡培养 ，定时检测发酵 液中的菌体含量 。 1 3 3鉴定方法 ：培养液中菌数测定按G B 4 7 8 9 2 8 4方法 进 行 。芽 孢数 的测定 即将 菌 液 在 沸水 中 收稿 日期1 2 o o s 0 3 1 3 作者简 介 杜；J - - ( 1 9 7 3 一 ) ， 男 ， 博 士后 ， 副教授 ， 主要从 事 益生茵方 面的研究 。 2 6 处理 1 0 ra i n后 ， 再按 G B 4 7 8 9 2 8 4方法进 行 。 1 4菌种鉴 定 菌落形态观察参考 伯杰 氏鉴定手册 及 相关 微 生物 实 验教程 ， 各 项 生理 生 化指标 采 用 细 菌鉴定 的常规方 法 。 1 5菌株 的产酶 活 力 实验 参考相关酶活力测定的方法 ，采用发酵培养 4 8 h经 3 5 0 0 r ra i n离心 3 0 rai n后 的上 清液 ， 测 定蛋 白酶、 淀粉酶及纤维素酶的酶活。 2 结 果与讨 论 2 1 KMF - 6的 生理特 性 2 1 1菌落形态 ： 杆状 ， 两端钝圆 ， 单个排列 ， 偶 尔 2 3个细菌排成短链 ， 经涂片干燥的染色的细菌 0 7 0 8 x 2 3 t x m， 革兰氏阳性 ， 液体发酵 2 4 h后有芽 孢出现 ， 芽孢 中生或端生 ， 椭 圆形 ， 不 明显膨胀 。在 液体基质 中呈均匀混浊 ， 不形成菌膜 和菌环 ， 菌落 圆形 ， 直径 4 7 i n i n ； 低 凸起 ， 规 则 ， 放射状 ， 边缘 叶 状 ； 表面皱褶 ， 无光泽 ， 灰 白色 ， 带有鳞片 ， 不透明。 2 1 2生理生化特征 ： 专性好氧 ， 不具凝乳作用 ， 过氧化氢酶实验、 硝酸盐还原实验 、 V P实验阳性 ： 苯丙氨酸脱氨酶实验 、卵黄卵磷脂酶实验阴性 ； 分 解葡萄糖产酸不产气 ， 能分解 阿拉伯糖 、 甘露醇 、 酪 素、 明胶、 淀粉。 2 1 3代谢 产物 ： K MF 一 6可分泌 大量 的胞外蛋 白酶 ， 而且该菌株 的淀粉酶也较高 ， 能够利用丙二 酸盐 ， 并可以分解蛋 白胨中的色氨酸生成吲哚 2 2 K MF 一 6菌株 的生 长特性 K MF 一 6菌具 有 生 长速 度 快 的特 性 ，在 普通 细 菌肉汤培养基中摇瓶培养 ， 其生长曲线见 图 l 。 世代 时 间为 2 9 rai n ，进 行摇 瓶 发 酵液 体 培 养 ， 3 8 o C， 2 4 h 后达到对数生长期末期 ， 菌体浓度达 1 0 1 z c f u m L 。 2 3 KMF 一 6菌株 的耐热 性研 究 将发酵液离心干燥后获得的菌粉经不同时间 维普资讯 广东饲料第 1 7卷第 4期 2 0 0 8年 4月 不 同温度 的湿热和干热处理后 ，检测其活菌数 ， 结 果 如 图 2和图 3 所 示 。从 中可 以看 出 ， K MF 一 6菌经 1 ( ) ( ) ， 6 0 mi n的湿 热处 理 和 1 2 0 ， 6 0 mi n的干热 处 理 ， 其活菌数只下降了一个数量级。显示了 K MF 一 6 菌具有 较强 的耐 热性 。 = E 鲁 嶷 兰 牺 E+1 2 E 十1 0 E+08 E+0 6 E +0 4 E+02 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 0 2 培彝时问( 图 1 K MF 一 6菌在肉汤培 养基 中的生长 曲线 S L 3 涮 樯 0 l O 2 0 3 0 4 0 6 0 时间 ( mi n ) 图 2湿热对枯草芽孢杆菌 K MF 一 6活性 的影响 2 0 0 E +1 3 羞1 5 0 E + 1 3 鼎 1 0 0 E + 1 3 魍 5 0 1 E+ 1 2 1 0 0 g+ 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 o 6 0 加热 时间 ( mi n ) 图 3干热对枯草芽孢杆菌 K MF 一 6活性的影响 2 4 K MF 6菌株 对不 同 p H 的 耐受性研 究 般 动物肠道内 p H多为 2 3及 5 7两个 范 围。 益生菌对动物肠道这两个范围的 D H值有强的 耐受性， 是它进入肠道后增值和发挥作用的前提条 件 。用柠檬酸和磷酸氢二钠配制不 同 p H 的溶液 ， K MF - 6浸泡在不 同 p H溶液中， 冰箱保存不同时问 后， 取样测定菌体存活率， 结果如表 1 。 从表 1 可以 看 出， K MF 一 6菌对不 同的 p H有较好 的适应性 保 存 3 0天 后 ， 其 活 菌数 的下 降不超 过 一个数 量级 可 推测对动物的胃肠道 ， 有较好的适应性 2 5 K MF - 6菌株的急性毒性实验f L D 表 1 K MF 一 6菌在不同 p H溶液 中的存活率 ( ) 、p H 2 1 3 2 4 3 5 1 6 6 6 7 1 76 8 7 将干燥后获得 的菌粉按卫生部 食 品安全性毒 理学评价程序 中 K a r b e r 氏法灌服小鼠 ， 测定小 鼠 经 口 L D 。 。选用 1 8 2 2 g健康昆明小 鼠 5 0只 ， 随机 分为 5组 ， 每组雌雄各半 ， 将菌粉按 1 0 g k g 、 5 g k g 、 2 5 g k g 、 1 2 5 k g 、 0 6 2 5 #k g体重 5个剂量分别给小 鼠灌 胃染毒 ， 灌 胃后观察并记录一周内各组实验动 物的症状及死亡情况 ， 观察发现各组小 鼠均无异常 表现 ， 亦均未发生死亡 ( 见表 2 ) 。表 明该样品小 鼠 经 口L D 卯 1 0 0 g k g活体重 ，按急性毒性分级标准 属无 毒 物质 表 2 小鼠急性毒性实验 结果 2 6 KMF - 6菌株 产 酶活 力 实验 分别将 K MF 一 6及市售 的一种进 口益生菌产 品中 离到 的枯草芽孢杆菌接种到细菌 肉汤培莽 基 中摇瓶培养 ， 2 4 h后离心取上清液进行蛋 白酶 、 淀粉酶及纤维素酶的测定 ， 结果如表 3所示 从 中 可以看 出 K MF 一 6菌具有更好的产消化酶 的能力 表 3 K MF 一 6茵产酶能力 比较 3 小 结 本实验筛选到的枯草芽孢杆菌 K MF 一 6除具有 普通芽孢杆菌抗外界不 良环境的能力外 ， 还具有生 长速度快 ， 产酶能力高等特点 ， 将该 菌粉制剂作为 饲料添加剂开发应用 ， 具有 良好的市场前景。 2 7 4 6 4 3 8 4 7 7 6 8 4 4 8 8 5 6 7 6 1 3 6 8 6 2 6 6 2 3 6 1 9 9 8 6 7 8 2 3 6 4 7 7 !昌 刀 6 1 5 2 6 5 8 1 5 8 6 8 9 9 5 6 7 7 8 8 6 9 6 4 8 1 2 2