辣椒调味品中黄曲霉毒素B1ELISA检测方法影响因素的研究.pdf

Vol. 28 No. 4 Apr. 2012 赤 峰 学 院 学 报（ 自 然 科 学 版） Journal ofChifengUniversity（Natural Science Edition ） 第 28 卷 第 4 期 （上 ） 2012 年 4 月 黄曲霉毒素 B1 （AFB1 ） 是目前已知的天然强 致癌物质之一， 可以导致人或动物肝脏的坏死出血 和引起肝癌发生， 是食品卫生污染中最重要的污染 物之一1.AFB1 分布范围广泛， 凡是污染了能产生 黄曲霉菌素的粮食、 油料作物的种子、 水果、 干果、 蔬菜、 调味品、 烟草、 肉类、 发酵产品和各种饲料， 都 可能存在黄曲霉毒素.其中， 辣椒作为一种重要的 辛香调料是调味品中的重要组成部份， 广泛应用于 各种调味品产品中.所以为了进一步增加辣椒调味 品的出口， 确保辣椒调味品的质量， 提高 AFB1 检 测方法的准确度和灵敏度非常重要. 目前常见的黄曲霉毒素 B1 的检测方法主要 是薄层层析法 （TLC ） 、高效液相色谱层析法 （HPLC ） 法、 酶联免疫法 （ELISA ） 和荧光光度法 （I- AC/SFB ） 等2,3.其中， 相比其他几种方法， ELISA 方 法操作相对比较简单， 灵敏度和特异度较高， 成本 低廉， 适合大范围筛选4.然而， 其也有一定的缺陷 性， 假阳性和假阴性的结果是其主要的问题.而对 于辣椒调味品来说，因为其属于天然食品原料， 成 分较为复杂， 黄曲霉毒素分布相对不均匀， 给提取 带来一定难度.同时因为其含有多种酸碱离子和一 些盐类和脂肪， 这些成分会对 AFB1 的提取产生干 扰和乳化，导致 AFB1 的提取不彻底，直接影响 AFB1 的检测. 故本研究的主要目的是以市场上具 有代表性的辣椒调味品为样本，考察各种组分对 ELISA 结果的影响，从而消除影响提取的因素， 提 高 ELISA检测方法的准确度和灵敏度. 1材料和方法 1.1 样本来源 本实验所用辣椒调味品均为从芜湖地区市场 购买的辣椒调味品， 根据国家取样相关标准， 采集 有代表性的作品.取 100200g 辣椒调味品样本， 利 用粉碎机粉碎为粉末状，每次准确称取 5.0g 样本 备用. 1.2主要试剂 甲醇 - 水溶液： 50ml 乙醇与 50ml 水配比而 成； 乙腈 - 水溶液： 85ml 乙腈和 15ml 水配比而成； 20%甲醇 - PBS 溶液： 80mlPBS 和 20ml 甲醇配比而 成； AFB1 ELISA 检测试剂盒（购自上海凯博生物 有限公司 ） . 1.3设备 全自动酶标仪 （美国 Thermo 公司） ； 恒温生化 培养箱 （日本三洋公司 ） . 1.4样品处理 辣椒调味品中黄曲霉毒素 B1 ELISA 检测方法影响因素的研究 蔡进 1,赵志刚2 （1.安徽中医药高等专科学校医学检验实验室，安徽芜湖241000；2.皖南医学院药学系，安徽芜湖241002） 摘要：ELISA 方法检测辣椒调味品中黄曲霉毒素 B1 （AFB1 ） 的含量的关键是样品的前处理过程.本 研究的目的是探讨 pH 值、 氯化钠含量和油脂含量对 ELISA 法检测 AFB1 结果的影响.方法： 以市场上具 有代表性的辣椒调味品为样本， 通过添加不同浓度的酸碱、 NaCl 和大豆油脂， 观察不同提取液水平对黄曲 霉毒素 B1 ELISA 结果的影响.结果： 中性的提取液环境和较低的氯化钠含量和油脂含量比较适合 ELISA 检测的准确度和灵敏度.结论： 在 AFB1 ELISA 检测的过程中， 去除油脂和氯化钠的影响， 调节检测液的 pH 趋于中性是保证 AFB1 ELISA 检测准确性的关键， 值得今后对黄曲霉毒素 B1 ELISA 检测方法进行改 进. 关键词：辣椒调味品； 黄曲霉毒素； ELISA； pH 值； 油脂 中图分类号： R735.7文献标识码： A文章编号： 1673- 260X （2012 ） 04- 0025- 03 25- 为了考察各种组分对 ELISA 结果的影响， 准 确称取 5.0g 粉碎的辣椒调味品样本放入 50ml 试 管中， 准确加入甲醇 - 水溶液 25ml， 然后按照不同 方法进行处理. 处理 1 （观察 pH 值的影响） ： 通过添加醋酸和 氢氧化钠， 使得样本的提取液 pH 值为 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 和 10. 处理 2（观察氯化钠含量的影响 ） ：通过添加 NaCl，使得样本的提取液中 NaCl 含量分别为 5%， 10%， 20%， 30%， 40%和 50%. 处理 3 （观察油脂含量的影响 ） ： 通过添加大豆 油，使得样本的提取液中油脂浓度（v/v ） 分别为 5%， 10%， 20%， 30%， 40%， 50%， 60%， 70%， 80%和 90%. 1.5AFB1ELISA检测 将样本按上述方法预处理后， 同以没有处理的 样本的作为空白对照样本，分别用振荡器振荡 5min， 静止 10min 后过滤， 取 50l 滤液， 然后加入 150l 的稀释缓冲液，获的含有 20%甲醇的溶液. 然后取出 50l 即为 ELISA 检测溶液，稀释 10 倍 待用.同时从冰箱中取出 AFB1ELISA 检测试剂盒， 平衡至室温， 按照试剂盒要求配置试剂.将备用的 辣椒提取液样本， 按照说明书要求步骤进行 ELISA 检测各组样本中的 450nm的吸光值 A 样本，与不 含有黄曲霉毒素的标准品配置液的吸光值 A 正常 进行比较. 2结果 2.1样本 AFB1 含量测定 （样本本底值检测 ） 抽取辣椒调味品样本 5 份，分别用 ELISA 方 法对其 AFB1 含量进行检测，确定其本底值约为 2.695g/kg. 2.2pH 值对 AFB1 ELISA检测结果的影响 当 pH 值 8 时， A 样本 /A 正常 1，结果显示 假阴性， pH 值 4 时， A 样本 /A 正常 1， 结果显示 假阳性.提示 pH 值较低， 会使酶活性收到抑制， 导 致显色较浅， 出现假阳性， pH 较高， 则会促进酶活 性， 导致假阴性.而 pH 值在较中性的时候， 结果则 较为正常，提示 pH 值 68 可能为 AFB1 检测最适 合 pH 值 （图 1 ） . 2.3氯化钠含量对 AFB1 ELISA检测结果的影响 随着 NaCl 含量的增加， A 样本 /A 正常逐渐减 少，提示 NaCl 含量剂量依赖性的影响 AFB1 ELISA 检测结果， NaCl 含量越高，假阳性率越高. NaCl 含量小于 10%， 结果较接近于正常 （图 2 ） . 2.4油脂含量对 AFB1 ELISA检测结果的影响 通过平行试验发现，大豆油脂的存在影响 样本编号 样本质量 （g ） 样本 A值 样本 AFB1 含量 （g/kg ） 15.0080.5232.456 25.0300.5432.619 35.0900.5762.940 45.0120.5712.932 55.0380.5392.529 平均值5.03560.55042.695 表 1辣椒调味品样本 AFB1 含量检测 26- ELISA检测结果的准确度， 提高大豆油脂的含量， A 样本 /A 正常逐渐减少， 结果越来越趋向于假阳性. 提示大豆油脂含量对 AFB1 ELISA 检测影响较大， 应尽量去除油脂， 才能保证结果的准确性 （图 3 ） . 3结论 黄曲霉毒素是常见的黄曲霉菌与寄生霉菌的 代谢产物， 具有很强的毒性， 是食品安全的严格限 量的指标 5,6. 虽然检测 AFB1 有很多方法，但是 ELISA 方法仍然是最方便简单的方法之一， 具有灵 敏度高、 特异性强、 检测限度大、 重复性好和检测时 间短等优点， 适合大范围筛选和检测7.但是 ELISA 检测也有其一定的缺陷性， 其具有一定的标准线性 范围， 也容易受到样本中一些因素的影响造成假阳 性.其中 ELISA 检测过程中酶的活性， 最容易受到 样本中一些因素的影响.有其对于本研究中所提到 的辣椒调味品这类样本来说，在对其提取的过程 中， 其复杂成分中的一些因素如酸碱度、 氯化钠含 量和油脂含量， 很容易对酶活性产生影响， 出现假 阳性、 假阴性， 造成结果偏差8.所以针对这种情况， 本研究对辣椒调味品提取过程中酸碱度、 氯化钠含 量和油脂含量对 AFB1 ELISA 检测的影响进行了 深入研究，希望可以提高 AFB1 检测准确度， 为 AFB1 ELISA 检测的准确度和灵敏度的提高提供 依据. 通过研究， 我们发现， pH 值、 氯化钠含量和油 脂含量对 AFB1 ELISA 检测具有重要的影响.实验 发现， 偏酸或偏碱都影响 AFB1 检测准确度， 中性 环境 （pH68 ） 更有利于检测结果的稳定和准确.同 时氯化钠含量和油脂含量与 AFB1 检测结果都具 有负相关， 氯化钠含量和油脂含量越高， 假阳性率 越高.原因可能是样品提取液中油脂含量高， 会附 着在 ELISA 抗体板条的四壁，对抗原抗体反应产 生屏蔽作用，阻碍了抗原与 ELISA 板内抗体的结 合， 从而导致结果趋于阴性， 从而导假阳性的发生. 由此给我们提示，在 AFB1 ELISA 检测的过程中， 去除油脂和氯化钠的影响， 调节检测液的 pH 趋于 中性是保证 AFB1 ELISA 检测准确性的关键， 值得 我们今后在工作中趋于注意. 参考文献： 1AOAC(Association Official Analytical Chemist). Natural toxins in official methods of analysis of AOAC intemational s. 16th Ed Gaithersburg AOAC Intemational,1999;22:968-999. 2车畅.黄曲霉素分析的几种方法及其比较J.养 殖技术顾问，2010（3）:8. 3张雪辉,陈建民.高效液相色谱法与荧光光度法 检测中药材中黄曲霉毒素的比较J.药学学报, 2004;39(12):997-1000. 4张洪雁,李意坚.酶联免疫吸附法检测大米中黄 曲霉毒素B1初报J.上海农业科技,2006（4）: 24-25. 5M.J.Albert. Enteric adenoviruses J.Archives of Virology,1986;88:1-2. 6SN/T 0001-1995出口商品中农药、 兽药残留 量及生物毒素检测方法标准编写的基本规定 SSN