药学第04章蛋白质.ppt

2007年8月,药学院（药本、中药本）讲稿,蛋白质的化学,第 三 章,Chemistry of Protein,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,第一节 蛋白质是生命的物质基础,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储作用 5）运动与支持作用 6)控制生长和分化作用 7）参与细胞间信息传递 8)生物膜的功能,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,2007年8月,药学院（药本、中药本）讲稿,蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein,第 二 节,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,一、 蛋白质元素组成,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,二、蛋白质结构的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,（一）氨基酸的结构,氨基酸的结构特点：,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（1）脂肪族氨基酸 （2）芳香族氨基酸 （3）杂环氨基酸 （4）杂环亚氨基酸,（二）氨基酸的分类（根据侧链结构）,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（二）氨基酸的分类（根据侧链性质）,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,目 录,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,非极性疏水性氨基酸 甘 Gly G 丙 Ala A 缬 Val V 亮 Leu L 异（亮） Ile I 脯 Pro P 苯（丙）Phe* F,碱性氨基酸 赖 Lys*K 精Arg* R 组 His H,酸性氨基酸 天（冬）Asp*D 谷 Glu* E,极性中性氨基酸 丝 Ser S 苏 Thr T 半（胱） Cys C 酪 Tyr*Y 天胺 Asn*N 谷胺 Gln* Q 蛋（甲硫）Met M 色 Trp*W,表示法（中文、三字符号和单字符号）,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿, 半胱氨酸,胱氨酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,必需氨基酸：机体自身不能合成，必须通过食物摄取的氨基酸。 亮氨酸 色氨酸 缬氨酸 赖氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 苏氨酸 蛋氨酸,梁 先生 借 赖 一两 本 书，关于鸡蛋的书。 梁色蛋借赖一两本书。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,与氨基酸结构方面相关的思考题 1、组成蛋白质的碱性氨基酸有 、 、 和 ；酸性氨基酸有 和 。 2、在下列空格中填入合适的氨基酸名称。 是带芳香族侧链的极性氨基酸。 和 是带芳香族侧链的非极性氨基酸。 是含硫的极性氨基酸 或 是相对分子量小且不含硫的氨基酸，在一个肽链折叠的蛋白质中它能形成分子内氢键。 在一些酶的活性中起重要作用并含羟基的极性较小的氨基酸是 。 3、不具旋光活性的氨基酸为 。 4、带有碳氢支链的氨基酸为 、 、 。,精氨酸,赖氨酸,组氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,酪氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,半胱氨酸,丝氨酸,苏氨酸,丝氨酸,甘氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,缬氨酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,5、下列各类氨基酸中不含必需氨基酸的是 A酸性氨基酸 B含硫氨基酸 C. 支链氨基酸 D芳香族氨基酸 E碱性氨基酸 6、天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A半胱氨酸 B瓜氨酸 C羟脯氨酸 D蛋氨酸 E丝氨酸 7、含有疏水侧链的氨基酸有 A精氨酸、亮氨酸 B苯丙氨酸、异亮氨酸 C色氨酸、精氨酸 D天冬氨酸、谷氨酸 E蛋氨酸、组氨酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,8、下列哪些氨基酸具有亲水侧链 A苏氨酸 B丝氨酸 C亮氨酸 D谷氨酸 E缬氨酸 9、下列哪些氨基酸具有疏水侧链 A亮氨酸 B脯氨酸 C蛋氨酸 D苯丙氨酸 E天冬氨酸 10、下列氨基酸中哪些有分支侧链 A缬氨酸 B异亮氨酸 C组氨酸 D色氨酸 E天冬酰胺,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（三）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,两性电离与等电点 pI=1/2(pK1+pK2),2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,酸性氨基酸和碱性氨基酸pI的计算：写出电离式，取兼性离子两边的pK值的平均值。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,酸性氨基酸和碱性氨基酸pI的计算,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3. 茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,茚三酮反应：蓝紫色，最大吸收峰在波长570nm，氨基酸定性定量分析。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（四）氨基酸的分离与分析,常规方法：层析法、溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀法、离子交换法等。 氨基酸自动分析仪 高效液相色谱法 离子交换层析法 生物质谱 毛细管电泳,2007年8月,药学院（药本、中药本）讲稿,蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein,第 三 节,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),高级结构,空间构象,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,三、肽,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽键与肽链,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)，,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考：自然界组成蛋白质的氨基酸只有20种，为什么构成的蛋白质有成千上万？ 顺序异构体三肽有6种 20种不同氨基酸构成的分子量为2600的蛋白质，其异构体数目为21018 对于分子量34000的蛋白质，含有12种氨基酸，且每种数量相同，其异构体数目约为10300。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（二） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,许多基因工程产品多为生物活性肽 神经生长因子 118个氨基酸 GM-CSF 127个氨基酸 -干扰素 127134个氨基酸 -干扰素 165166个氨基酸 白细胞介素 133个氨基酸 促红细胞生成素 157个氨基酸 VEGF 121189个氨基酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考练习题 1、蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是 A肽键 B半胱氨酸的一SH基 C苯丙氨酸的苯环 D色氨酸的吲哚环 E组氨酸的咪唑环 2、含芳香环的氨基酸是： ALys BTyr CVal DIle EAsp 3、合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是 A脯氨酸 B赖氨酸 C谷氨酸 D，羟脯氨酸 E，组氨酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,4、氨基酸共有的颜色反应是 A双缩脲反应 B茚三酮反应 C坂口反应 D米伦反应 EFolin酚试剂反应 5、蛋白质多肽链书写方向是 A从3，端到5，端 B从5，端到3，端 C从C端到N端 D从N端到C端 E以上都不是 6、下列哪些叙述对一直链多肽Met-Phe-Leu-Thr-Val-Ile-Lys是正确的 A.是七肽，由七个肽键连接 B能与双缩脲试剂反应 C.可被蛋白酶水解 D含一SH基 E其中有D型氨基酸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,7、下列氨基酸在pH=4.8的溶液通电后，移向正极的为 A.天冬氨酸 B.谷氨酸 C.甘氨酸 D.谷氨酰胺 E.赖氨酸 8、下列关于多肽Glu-HiS-Arg-Val-Lys-Asp的叙述，那个是错误的？(作业) A. 在pH12时，在电场中向阳极移动 B. 在pH3时，在电场中向阴极移动 C. 在pH5时，在电场中向阴极移动 D. 在pH11时，在电场中向阴极移动 E. 该多肽的等电点大约在pH8,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（三）蛋白质一级结构测定的原理,蛋白质氨基酸序列测定的意义： 是阐明蛋白质生物活性的分子基础。 是推测蛋白质空间结构的基础，氨基酸序列是联系DNA中遗传信息与作为蛋白质生物功能基础的三维结构之间的桥梁。 根据其序列可以进行疾病分析。 可以研究生物进化。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,1、样品的纯度要求 每种蛋白质都有其特定的氨基酸排列顺序。 因此要求分析的蛋白质必须为： 分子大小均一、电泳时呈现一条带、比活性恒定、能够结晶等。杂蛋白不超过5 用SDS-PAGE等方法测定蛋白质分子量。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2、氨基酸组成分析 每条肽链中的氨基酸的种类和数目是序列分析中不可缺少的一环，可作为蛋白质的一种印迹，判断是否属于同一蛋白质。 酸水解，优点:范围广,操作简单 缺点:部分aa被破坏. 修饰后水解 酶解：外切酶、内切酶、链酶蛋白酶等(1%) 水解产物分析常用：电泳、离子交换层析、 RP-HPLC、aa自动分析仪,GlnGlu AsnAsp Trp被氧化,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3、多肽链氨基酸序列分析： （1）纯化蛋白质水解后测定其组成氨基酸的百分含量或个数： 酸水解、碱水解、酶水解。 电泳、离子交换层析、反向高效液相层析（RP-HPLC）分离鉴定多肽链中氨基酸的种类含量。氨基酸自动分析仪。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（2）多肽链的末端分析： 确定多肽链两端是什么氨基酸，作为整条多肽链的标志。 N-末端分析： DNP法：2，4二硝基氟苯（DNFB）与肽链自由-NH2定量反应生成黄色2，4二硝基苯（DNP）多肽，酸水解后鉴定；该方法亦称为Sanger法。DNFB为Sanger试剂。 丹磺酰氯（二甲胺萘磺酰氯 DNS-CL）法。 Edman降解法：（苯异硫氰酸，PITC）,条件温和，室温即可,6mol/L HCl,利用本方法的特点是生成的DNS氨基酸具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍；DNS-氨基酸可不提取而直接鉴定,以上方法破坏多肽链，因而仅限于N末端残基,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,C-末端分析法：羧基肽酶法。羧基肽酶A、B、C、分别作用于不同氨基酸为C端的肽键；羧基肽酶Y无特异性。 羧基肽酶A对Phe Tyr Trp和Val Leu Ile起作用，对Arg Lys 和Pro不起作用。 羧基肽酶B对Lys Arg起作用，对Pro不起作用。 羧基肽酶C对Pro 起作用，而对其它氨基酸则很慢。 羧基肽酶Y可切断各种氨基酸的C末端肽键。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,4、拆开二硫键 （1）过甲酸氧化法。SHSO3H （2）巯基化合物还原法。巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT) 5、肽链的部分水解 氨基酸序列准确度随着肽链的延长而降低，尤其肽链在50个残基以上的。分析时一般先将其水解为小片段。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（1）多肽链的部分水解：将很长的多肽链切割成适合进行序列分析的小片段。 内切酶法： 化学法：,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,从上表可发现，许多蛋白内切酶对底物有很强的专一性，对切点附近的氨基酸序列有严格的要求。这种蛋白酶被称为位点专一性蛋白酶或限制性蛋白酶。 根据某一蛋白酶切后的片段数，可初步分析该肽链中某些氨基酸的个数。或从氨基酸组成分析中某些氨基酸的总数判别相应酶切产生的片段数。 思考：假如一个肽链有5个Lys或Arg残基，用胰蛋白酶处理可得到几个片段？这些片段有何特点？,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,溴化氰（CNBr）是一种高效、特异的肽链裂解剂,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（2）分离纯化每个片段：离子交换层析；双向纸电泳：,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（3）测定各肽段氨基酸的排列顺序： Edman降解法：,可用乙酸乙酯提取,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,6、完整多肽链顺序的确定： 测定了每一个肽段的顺序后，可用肽段重叠法确定整条链顺序。需要不同的裂解法产生的重叠序列。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,肽链序列推测,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,7、二硫键定位： 另取一份蛋白质样品，用同样的酶水解，但不要预先拆开二硫键。肽段被分离电泳后，与原来先拆开二硫键再进行电泳对比，两个原来的肽段会消失而出现一个新的、大的片段。那两个消失的片段代表在完整肽链中被二硫键连接的区域。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,多肽链中氨基酸序列分析程序,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,8、由DNA序列推演氨基酸顺序 由于DNA序列分析的开展、基因密码的阐明和克隆技术的迅速发展，人们可以从基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸序列。而且比化学法测序要快，现已成为常用的蛋白质一级结构测定法。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考题 1、某一蛋白质用胰蛋白酶处理后得到一个五肽，含Arg, Leu, Asp, Ser, Tyr, 为了确定肽的氨基酸顺序，进行Edman降解，每次降解剩下的肽段的氨基酸组成如下： 第一次Edman降解，Arg, Asp, Leu, Ser 第二次Edman降解，Arg, Asp, Ser 第三次Edman降解，Arg, Ser 请给出这个五肽的氨基酸序列。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2、由下列信息求八肽的序列： 酸水解得Ala, Arg,Leu,Met,Phe,Thr,2Val Sanger试剂处理得DNP-Ala 胰蛋白酶处理得Ala,Arg,Thr和Leu,Met,Phe,2Val 当以Sanger试剂处理分别得到DNP-Ala, DNP-Val 溴化氢处理得Ala,Arg,高丝氨酸内酯,Thr, 2Val,和Leu Phe; 当用Sanger处理，分别得到DNP-Ala和DNP-Leu,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,二、蛋白质的构象,蛋白质的构象是指蛋白质分子中各种原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽键的走向。 蛋白质的构象又称空间结构、立体结构、高级结构和三维结构。 蛋白质的构象与功能体现所必需。 蛋白质构象经常包括：二级结构、三级结构与四级结构。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（一）维持蛋白质构象的化学键,维持蛋白质构象的化学键主要是一些次级键，亦称副键。 这些次级键键能较小，稳定性较差。 其种类有：氢键、疏水键、盐键、配位键、二硫键、Van der Waals力。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（二）蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,肽键的特点： （1）键长为0.132nm ,介单键（键长为 0.147nm）与双键（键长为0。128 nm）之间。 （2）具双键的性质，即不能旋转。,蛋白质中氨基酸之间通过肽键相连,1、肽单元,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),2、 -螺旋,氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3、-折叠,氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,平行与反平行片层结构。,氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,4、-转角,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,5、无规线团,蛋白质二级结构中除上述有规则的构象外，尚存在因肽键平面不规则排列的无规律构象，称为自由折叠或无规线团。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,氨基酸残基侧链对二级结构的影响： 妨碍-螺旋的形成：连续的酸性氨基酸或连续的碱性氨基酸，同性电荷排斥；天冬酰胺、亮氨酸大侧链；脯氨酸亚氨基在环中，不能形成氢键。 -折叠要求氨基酸侧链较小，才能允许两条链段互相靠近。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考题 1、一个螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋，计算该螺旋片段的轴长。 2、羊毛衫等羊毛制品在热水中清洗会变长，然后在电干燥内干燥又收缩。丝制品进行同样的处理，却不收缩。如何解释这两种现象。 3、含有500个氨基酸的单一一条多肽链的蛋白质的近似相对分子量是多少,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（三）超二级结构：由相邻的23个二级结构单元相互连接形成有规则的二级结构簇构象。,a) b) c),是介于二级结构与结构域间的一个构象层次,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（四）模体（motif),在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。模序（motif）： 模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能。 模序举例：,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,-螺旋-环- -螺旋（HLH）：钙结合蛋白等蛋白中存在。环中有几个亲水侧链是恒定的，侧链末端的氧原子通过氢键结合钙离子。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,锌指（zinc finger）：一个-螺旋和两个反平行-折叠组成。N-端二个Cys、C-端二个His之间形成的洞穴容纳Zn2+。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,还有其它类型的模序：如亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋（HTH）。 一些蛋白的模序仅由几个氨基酸组成，如纤连蛋白中由Arg-Gly-Asp（RGD）构成受体结合模序。,亮氨酸拉链,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（五）蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,1、 定义,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,肌红蛋白 (Mb),2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,纤连蛋白分子的结构域,2、结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,结构域（domain） ：在超二级结构的基础上较长的多肽链进一步折叠形成相对独立的致密的三维结构实体。短的肽链只有一个结构域即三级结构。分子量大的多肽链可由几个结构域构成三级结构，结构域可以认为是构成三级结构的“砖块”。结构域可以相同也可不同，结构域间由“铰链区”相连。例如Ig的结构：,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,Ig的结构域：CH1H3重链恒定区结构域1、2、3；CL轻链恒定区结构域；VL轻链可变区结构域；VH重链可变区结构域；,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3-磷酸甘油醛脱氢酶三级结构：两个结构域，红色结合NAD；绿色结合3-磷酸甘油醛。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3、分子伴侣（知识扩充，不要求）,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,* 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,* 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,分子伴侣大多为热休克蛋白（heat shock protein，简称HSP) 。因为加热时可在许多细胞中被诱导出来而得名，目前认为热休克蛋白源于细胞内源性保护蛋白。如热休克蛋白HSP70家族、HSP40家族、HSP60家族等。作用时依赖ATP的水解。另外，分子伴侣还可以是一些核酸、磷脂、核糖体及一些小分子物质。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,（六）蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,血红蛋白的四级结构,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考题,1、维持蛋白质一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的主要键各是什么？ 2、关于蛋白质分子三级结构的描述错误的是 A具有三级结构的多肽链都具有生物学活性 B天然蛋白质分子均有这种结构 C三级结构的稳定性主要由次级键维系 D亲水基团多聚集在三级结构的表面 E决定盘曲折叠的因素是氨基酸序列,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3具有四级结构的蛋白质特征是 A.分子中必定含有辅基 B四级结构在三级结构的基础上，多肽链 进一步折叠、盘曲形成 C依赖肽键维系四级结构的稳定性 D每条多肽链都具有独立的生物学活性 E由两条或两条以上的多肽链组成,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,4关于蛋白质的四级结构正确的是 A.一定有多个不同的亚基 B一定有多个相同的亚基 C一定有种类相同，而数目不同的亚基数 D一定有种类不同，而数目相同的亚基 E亚基的种类，数目都不一定相同,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,5.蛋白质的一级结构及高级结构决定于 A亚基 B分子中盐键 C氨基酸组成和顺序 D分子内部疏水键 E分子中氢键,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,三、蛋白质和多肽合成的基本原理,化学合成法、半合成法、生物合成法 1、化学合成法的基本原理 氨基酸的基团保护 氨基保护【苄氧碳酰氯(Cbz-Cl)，H2/Pd或钠-液氨法去除；叔丁羰酰氯(BOC-Cl)，用稀盐酸去除】 羧基保护：常用无水乙醇酯化，以后碱水解除去。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,多肽液相合成 （1）基团保护 （2）用接肽缩合剂缩合（N,N-二环己基羰二亚胺（DCCI） （3）肽化合物的合成,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,CbzHNCHCOOH,H2NCHCOOC2H5,R2,DCU,DCCI,C2H5OH,Cbz-Cl,HCl,H2O,NaOH,从N端向C端延伸,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,多肽的固相合成,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2、采用生物技术合成蛋白质 基因工程 细胞工程 酶工程,2007年8月,药学院（药本、中药本）讲稿,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第 四 节,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一、蛋白质一级结构与功能的关系,例1：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一级结构相似，空间构象及功能亦相似。 例2：哺乳动物胰岛素只有个别氨基酸差异，功能相同。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,例3：ACTH和促黑激素共有一段相同序列， ACTH也有较弱的促黑作用。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,例4：细胞色素C，物种的亲源关系越近，一级结构、空间结构、功能越相似。,人：102 Tyr 猕猴：102 Arg,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,（一）一级结构是空间构象的基础,二、蛋白质空间结构与功能的关系,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,2007年8月,药学院（药本、中药本）讲稿,第五节,蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定,蛋白质是高分子化合物，分子量11041106D或更高。 形状，在溶液中形状常为球形、椭球形和纤维状。 分子量测定方法： 分子筛层析法 SDS-PAGE电泳 生物质谱,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,二、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,三、蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,四、蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质沉淀的种类 盐析 有机溶剂沉淀法 加热沉淀反应重金属盐沉淀反应 生物碱试剂的沉淀反应,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,五、蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,六、蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3. 酚试剂反应 在碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可与酚试剂（含磷钨酸与磷钼酸化合物）生成蓝色化合物。 4. 其它显色反应,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,七、蛋白质的免疫学性质,1、抗原 2、抗体 3、蛋白质免疫行政的应用,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,思考题： 1、有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的PI为4.6、5.0、5.3、6.7、7.3，电泳时欲使其中的四种泳向正极，缓冲液的PH应该是多少。 A. 4.0 B. 5.0 C. 6.0 D. 7.0 E. 8.0 2、血浆蛋白质的PI大多为PH56，它们在血液中的主要存在形式是： 兼性离子 B. 带负电荷 C 带正电荷 D. 非极性分子 E. 疏水分子,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,3、蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是 A肽键 B半胱氨酸的一SH基 C苯丙氨酸的苯环 D色氨酸的吲哚环 E组氨酸的咪唑环(异吡唑环),2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,4、变性蛋白质的特点是 A黏度下降 B丧失原有的生物活性 C颜色反应减弱 D溶解度增加 E不易被胃蛋白酶水解 5蛋白质变性是由于 A蛋白质一级结构改变 B蛋白质空间构象的改变 C辅基的脱落 D蛋白质水解 E以上都不是,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,6、已知卵清蛋白pI=4.6，乳球蛋白pI=5.2，糜蛋白酶原pI=9.1，上述蛋白质在电场中的移动情况为 A缓冲液pH为7.0时，糜蛋白酶原向阳极移动，其他两种向阴极移动 B缓冲液pH为5.0时，卵清蛋白向阳极移动，其他两种向阴极移动 C缓冲液pH为9.1时，糜蛋白酶原在原地不动，其他两种向阳极移动 D缓冲液pH为5.2时，p乳球蛋白在原地不动，卵清蛋白向阴极移动，糜蛋白酶原移向阳极,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,第六节,蛋白质的分离纯化 The Separation and Purification of Protein,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一、蛋白质的提取,材料的选择（含量、方便） 组织细胞的捣碎（研磨、匀浆器、超声波仪） 提取（溶媒选取、防止蛋白酶）,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,二、蛋白质的分离和纯化,（一）根据分子大小不同的分离纯化方法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,* 分子排阻层析（分子筛层析、凝胶过滤） 其原理是利用分子量的差异（分子大小的差异）进行分离。 匍聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 * 密度梯度离心。利用蛋白质大小和密度的差异进行分离。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,* 超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,2007年8月,药学院（药本、中药本、制药工程、药物制剂）讲稿,一些蛋白质的分子量和沉降系数 蛋白质 分子量 S 细胞色素c（牛心） 13370 1.17 肌红蛋白（马心） 16900 2.04 糜蛋白酶原（牛胰） 23240 2.54 -乳球蛋白（羊奶） 37100 2.90 血红蛋白（人） 64500 4.50 血清白蛋白（人） 68500 4.60 过氧化氢酶（马肝） 247500 11.30 脲酶（刀豆） 482700 18.60 纤维蛋白原 339700 7.60,2007年8月