分子生物学：细胞周期-研究生课件.ppt

Chapter 7 Cell Cycle,Section 1 Introduction,细胞周期（cell cycle）就是指细胞生长与分裂的周期，即细胞在一次分裂结束开始生长，到下一次分裂完成所经历的过程。,1. Phases of Cell Cycle,细胞周期一般包含下列四个阶段： G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前的一段时期； S期：为DNA复制的时期； G2期：从DNA复制完成到有丝分裂开始的一段时期； M期：从细胞分裂开始到结束的时期。,Phases of Cell Cycle,2. Characteristics of Cell Cycle Phases,G1期： 细胞周期的大部分时相处于G1期，动物细胞一般为612小时。该期主要的生化活动是合成RNA和蛋白质。 S期： 此期一般持续68小时，其长短主要由基因组的复杂度决定。该期主要的生化活动是复制DNA。,G2期： 是最短的时相。该期主要的生化活动是合成一些与有丝分裂有关的蛋白质。 M期： 该期很短，一般持续0.52小时。该期生化合成停止，细胞形态发生改变，一个母细胞分裂成2个子代细胞。,3. Checking Points of Cell Cycle,真核细胞的分裂增殖必须经过两个关键的调控点：即DNA合成开始时的G1S期的转换和有丝分裂开始时的G2M期的转换。 细胞必须在顺利经过这两个调控关键点之后，才可能完成细胞的分裂增殖，即细胞周期。 除此之外，细胞由G0G1期的转换，也涉及另外一个调控点。,细胞周期中各关键点的转换，是通过各种调控因子相互作用，构成级联网络调控系统来实现的。 这一调控系统的核心就是周期素依赖的蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）家族。正是该家族成员的顺序激活和对关键底物的磷酸化促进细胞周期的有序进程，启动并完成G1S期和G2M期的转换。,Section 2 Regulation of Cell Cycle,1. Growth Factors and their Receptors,生长因子，如EGF、PDGF、TGF、FGF、NGF、IL-2等，与相应的靶细胞膜受体结合后，即可通过细胞信号转导，调节相关结构基因的表达，启动细胞增殖过程。,2. Structure and Function of Cyclin,周期素都是CDK的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活CDK，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性。 在高等真核细胞中，周期素至少分为A、B、C、D、E、F、G等几大类。,周期素的家族成员,五大类周期素中都含有由100150个氨基酸残基组成的保守区，称为周期素盒（cyclin box），是与CDK相互作用的活性区域。 此外，还可含有降解盒（destruction box）或PEST序列（脯-谷-丝-苏），可通过定时降解或快速转换来调节周期素的水平。,按周期素表达及作用的细胞周期阶段的不同，可将其分为G1期（D、E）和M期（A、B）两大类。,The Expressional Levels of Cyclins during Cell Cycle,The Relationship of Cyclin Expressional Levels with DNA Replication,是指在G1期或G1S期转换点发挥作用，并能启动细胞周期，促进DNA合成的周期素。 G1期周期素主要包括周期素C、D、E等，这些周期素通常在细胞周期的G1期时活性升高，而在S期以后则逐渐降至较低的水平。,2.1 Cyclins during G1 Phase,周期素C： 周期素C的C-端存在一个PEST序列，其细胞内的水平在G1期中点达高峰。,周期素D： 周期素D至少有D1、D2、D3三种亚型。 周期素D的C-端存在一个PEST序列；N-端含有一个与DNA肿瘤病毒转化蛋白共同的顺序Leu-X-Cys-X-Glu ，是周期素D与p110Rb等蛋白结合所必需。,不同亚型周期素D在细胞内的表达模式不同，但主要是在G1期处于较高的表达水平。,周期素E： 有E1和E2两种亚型，其细胞内的水平在G1/S调控点达峰值。,是指在G2M期转换处发挥作用，诱导细胞分裂的周期素，包括周期素A和B两类。 这类蛋白在其N-端含有一个降解盒（destruction box），在M期通过泛素（ubiquitin）途径降解。,2.2 Cyclins during M Phase,周期素A： 包括三种亚型：A1、A2和A3。 在细胞周期的DNA合成之前出现，并不断增加，与启动DNA复制有关，主要在S期发挥作用。,Cyclin A3,周期素B： 周期素B在人类有两种亚型，B1和B2。 周期素B水平的变化主要由其降解速率来调控。 周期素B在S晚期出现，在细胞进入M期之前，其水平呈线性增高，当达到一定阈值时，促使CDK激活；当细胞进入M期后，周期素B降解速率增加，水平骤然下降，CDK失活。,3. Structure and Function of CDK,人们对CDK的认识，最初是通过研究培养细胞和酵母细胞而得到的。 目前已经确定的CDK有：裂殖酵母中CdC2；酿酒酵母中的CdC28、PHO85、KIN28以及人类细胞中CDK110 。,3.1 Types and Characters of CDK,CDK Family in Human,CDK的分子量一般为3540kD，不同CDK的氨基酸组成有40%以上的同源性。 典型的CDK催化亚基的活性中心约由300个氨基酸残基组成，当处于单体或非磷酸化状态时，CDK没有催化活性。,Molecular Structure of CDK2,CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。 在激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素； 而在抑制因素中，CDK的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。,3.2 Regulation of CDK Activity,周期素的激活作用： 周期素中的“周期素盒”结构域直接和CDK的结合，并与CDK的激活相关，周期素是CDK的正性调节剂。 周期素的这两种功能是密切相关的，而这种结合与激活作用主要通过周期素在细胞周期中的浓度波动来调控。,3.2.1 Activation of CDK,CyclinA-CDK2 Complex with ATP Bound,磷酸化修饰的激活作用： CDK的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。,催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，该酶是一种寡聚体，其催化亚基为CDK7，调节亚基为周期素H，另需一组装蛋白因子MAT1以稳定结构。,MAT1CDK-activating kinase assembly factor 1,Complex of CDK7 CyclinH-MAT1,磷酸化修饰的抑制作用： 在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15残基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。 其原因在于上述残基的侧链位于该酶活性中心ATP结合部位的顶端，因而对激酶的磷酸化作用产生了阻碍。,3.2.2 Inhibition of CDK,催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶Myt1 ，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1 。 催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。 因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相对活性，决定CDK1和CDK2的活性高低。,Regulation of CDK Activity,CAK,抑制蛋白的作用： 近年来，已分离并鉴定了若干能够与周期素-CDK复合物特异性结合并抑制其活性的蛋白因子，这些蛋白因子被称为周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）。 大部分CKI都是抑癌基因的编码产物。,在哺乳动物细胞中，目前已经确定的CKI主要有：P21WAF1/CIP1、P27KIP1、P16INK4和P15INK4B，可分别抑制各型CDK的活性。,P21WAF1/CIP1： 是由抑癌基因WAF1/CIP1编码合成的蛋白质，几乎能与所有的周期素-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留在G1期。,P27KIP1： 是由抑癌基因KIP1编码合成的蛋白质，也能与几乎所有的周期素-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。,p27-cyclin-cdk complex,P16INK4A和P15INK4B： 是分别由抑癌基因INK4A/MTS1和INK4B/ MTS2编码合成的蛋白质，能专一性的与CDK4和CDK6结合，并阻止其与周期素的结合反应，从而抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。,P53： 由抑癌基因p53编码合成的蛋白质，是WAF1/CIP1基因的转录激活因子。 因此，P53的表达可促进P21WAF1/CIP1的转录表达，从而抑制CDK的蛋白激酶活性。,Function of P53,PRb： 是由Rb抑癌基因编码合成的蛋白质，有低磷酸化型和高磷酸型两种型式。 低磷酸化型的PRb可与转录因子E2F形成复合体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分裂；而高磷酸化型的PRb则不能与E2F形成复合体。 催化PRb由低磷酸化型转变为高磷酸化型的蛋白激酶就是各型CDK。,Rb function is linked to other tumor suppressors,细胞周期的调控机制,Smad3/4 Mothers against decapentaplegic homolog 3/4 ATM Serine-protein kinase ATM ATR Serine-protein kinase ATR SKP2 S-phase kinase-associated protein 2 SCF Skip1-cullin/cdc53-F-box protein GSK3 Glycogen synthase kinase 3 HDAC Histone deacetylase DP-1 Transcription factor Dp-1,Chapter 8 Cell Apoptosis,Section 1 Introduction,细胞死亡也是一种重要的生命过程。目前，经“细胞死亡命名委员会(NCCD)”确认的细胞死亡类型至少有10余种。 其中，由NCCD明确鉴定的细胞死亡类型包括：细胞坏死(cell necrosis)、细胞凋亡(cell apoptosis)和细胞自噬(cell autophage)。,1. Concept of Cell Apoptosis,细胞凋亡（cell apoptosis）是指细胞自杀机制被活化而引发的一种以细胞固缩为主要形态学改变的程序性细胞死亡。 细胞凋亡的发生受凋亡相关基因的调控。 凋亡细胞的形态学改变主要发生在细胞核。凋亡时，由于细胞膜保持完整，无内容物溢出，故一般不会引起炎症反应。,2. Morphologic and Biochemical Characters of Cell Apoptosis,凋亡细胞出现特征性的形态学改变： 染色质密集，呈边缘化； 核固缩； DNA链断裂； 出现凋亡小体。,2.1 Morphologic Characters,Processing of Cell Death,Comparison of Necrotic with Apoptotic Cells,normal cell,apoptotic cell,necrotic cell,Apoptotic Cell and Macrophage,凋亡细胞的典型生化改变是将其基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳时，DNA片段表现为间隔180200bp的阶梯状条带。,2.2 Biochemical Characters,3. Physiological Significances of Cell Apoptosis,细胞凋亡是多细胞生物生命活动过程中的重要内容。 细胞凋亡贯穿于动物全部生命周期中，是保证个体发育成熟所必需的过程。,Section 2 Genes and Their Proteins Related to Apoptosis,1. Ced Gene Family,Ced基因家族是线虫的细胞凋亡相关基因，包括Ced-3、Ced-4、Ced-9等。 其中，Ced-3基因编码产物与人半胱氨酸蛋白酶（如ICE）同源，Ced-4基因编码产物与人Apaf-1蛋白同源，Ced-9的编码产物与人的bcl-2有同源性。,Ced基因家族的表达产物中，Ced-3和Ced-4能促进细胞凋亡；而Ced-9能与Ced-3和Ced-4形成复合物并抑制其活性，从而抑制细胞凋亡。,Regulation of Ced Proteins for Cell Apoptosis,2. rpr Gene,rpr基因是果蝇的凋亡相关基因，该基因编码一种与Fas的DD结构域同源的小分子多肽，以Fas介导凋亡类似的方式激活ICE/Ced-3样蛋白酶，促进细胞凋亡。,3. bcl-2 Gene Superfamily,bcl-2基因定位于人第18号染色体上，与线虫的ced-9基因同源，能编码26kD的Bcl-2和22kD的Bcl-2两种蛋白。 bcl-2基因为凋亡抑制基因，其表达产物是膜整合蛋白。,Bcl-2（Bcl-XL）蛋白具有下列抗凋亡作用： 能抑制线粒体PT孔（通透性转变孔）开放，减少Cyt c和凋亡诱导因子（AIF）的释放； 能结合和灭活Apaf-1，阻断其对caspase-9活化； 能特异地结合Cyt c，阻止其诱导细胞凋亡。,现已发现至少存在29个bcl-2基因的同源物，它们在线粒体介导的凋亡途径中起调控作用。 Bcl-2蛋白家族成员都含有14个Bcl-2同源结构域（BH14），并且通常有一个羧基端跨膜结构域（transmembrane region，TM）。,一般说来，BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3则是与促进凋亡有关的结构域。 因此，根据结构不同，bcl-2家族成员中，有些具有抗凋亡活性，有些则具有促凋亡活性。,根据功能和结构可将Bcl-2家族分为两大类： 抗凋亡的（anti-apoptotic）：如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等。 促凋亡的（pro-apoptotic）：包括多结构域的（如Bax、Bak、Bok）和只有BH3结构域的（如Bad、Bid、Bim、Bik等）两种亚类。,Molecular Structure of Bcl-2 Protein Family,Bcl-2蛋白家族成员,Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜，可与促凋亡蛋白形成复合体，抑制其作用，因而具有拮抗促凋亡蛋白的功能。 而大多数Bcl-2家族的促凋亡蛋白则主要定位于细胞浆，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，即可向线粒体膜转位。,这些促凋亡蛋白通过寡聚化，在线粒体外膜形成跨膜通道 ；或者开启线粒体的通透性转变孔（permeability transition pore，PT），促使线粒体内的凋亡因子（cyt c）释放，激活蛋白水解酶caspase，引发细胞凋亡。,Anti-apoptosis and Pro-apoptosis Effects of Bcl-2 Related Proteins,4. Caspase Gene Superfamily,哺乳动物中存在的白介素-1-转化酶（ICE）是细胞凋亡蛋白酶，与线虫的Ced-3同源，都属于胱-天蛋白酶家族（cysteine aspartate-specific protease，caspase）。 这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。,在人类细胞中已发现13个ICE同源物，分为2个亚家族： ICE亚家族包括caspase-1、4、5、11、12、13等，主要参与炎症反应； CED-3亚家族包括caspase-2、3、6、7、8、9、10等，主要参与细胞凋亡。,Types of ICE Related Proteins,目前已经鉴定的caspase的水解底物包括： 多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）； 纤层蛋白（lamins）； caspase依赖的DNA酶抑制蛋白（ICAD）； 小核蛋白体蛋白（HnRNP proteins）等20多种。,The Substrates of Caspases,多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一种与DNA损伤修复、基因完整性监护有关的聚合酶，其作用是将NAD+分子中的ADP转移到与DNA修复相关的酶分子上，提高其催化效率。 当细胞凋亡启动时，PARP被caspase剪切，导致受PARP负调控的核酸内切酶活性增高，进而裂解核小体之间的DNA，引发细胞凋亡。,纤层蛋白（lamins）属于中间纤维丝蛋白家族，参与构成支撑核内膜的网架结构，同时对染色质的定向和组织起作用。 小核糖体蛋白（HnRNP proteins）则参与构成小核蛋白体，与hnRNA的成熟加工有关。,5. Apaf-1 Gene,Apaf-1基因表达的Apaf-1蛋白为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），与线虫的Ced-4蛋白同源，在线粒体介导的凋亡途径中起重要作用。,Apaf-1含有3个不同的结构域： CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9； Ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP； C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。,Apaf-1具有激活caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。 Apaf-1-细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。,凋亡体的形成,凋亡体与caspase级联反应,Fas基因，定位于人第10号染色体上，其编码产物为45kD的跨膜受体，属于TNF受体家族。 Fas受体（又称APO-1或CD95）的分子结构可分为三个区，即具有三个富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区和具有死亡结构域（Death domain， DD）的胞内区。,6. Fas and FasL Genes,Fas的胞内区DD结构域可与接头蛋白FADD （Fas associated death domain protein）偶联，然后再通过FADD的死亡效应结构域（death effecter domain，DED）与Pro-caspase-8偶联，从而将胞外的凋亡信号传递到细胞内。,Fas的分子结构,DD death domain DED death effector domain FADD Fas associated death domain,Fas与其配体（FasL）的相互作用，是引发细胞凋亡的主要途径之一。 Fas与其抗体或FasL结合后，可迅速激活caspase级联反应，裂解DNA，诱发细胞凋亡。,FasL基因定位于人第1号染色体上，主要在活化的淋巴细胞表面表达，产生凋亡信号；也可在T细胞激活过程中被诱导表达。 Fas与FasL的协同表达，对胸腺中T淋巴细胞的发育、分化与凋亡以及细胞毒活性起调节作用。,7. IAP Gene Superfamily,细胞凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis，IAP）超家族的成员较多，如c-IAP1，c-IAP2，XIAP，NIAP 和Survivin等，新的成员仍在不断被发现。 IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个70个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。 c-IAP1、 c-IAP2和XIAP还含有环指状结构域（RING）。,Molecular Structure of Human Cellular IAPs,BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构域（RING）则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-3和-7的泛素化降解作用。,p53基因定位于人的第17号染色体上， 是一种多功能基因，其表达产物P53能在G1期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成；如受损DNA不能修复，则诱导细胞进入凋亡程序。,8. p53 Gene,P53作为一种转录因子，是Bax的正调节因子，Bcl-2的负调节因子。 当细胞受到射线照射后，P53可迅速上调Bax的表达，从而促进细胞凋亡。,c-myc基因也是一种多功能 基因，定位于人第8号染色体，编码分子量为62kD的蛋白质。 c-Myc蛋白位于细胞核内，具有转录因子活性，一方面能激活控制细胞增殖的基因，另一方面也能激活促进细胞凋亡的基因表达，故具有促进细胞增殖和凋亡的双重效应。,9. c-Myc Gene,c-Myc与Bcl-2之间存在协同作用。 Bcl-2能抑制c-Myc所致细胞凋亡，但不影响其促有丝分裂作用，即当生长因子存在、Bcl-2表达时，c-Myc促进细胞增殖，反之则细胞凋亡。,c-Myc蛋白的作用机理与另一种转录因子Max形成异源二聚体有关。此复合物可与特定的DNA序列相结合，发挥调节基因表达的作用。 已知这两种转录因子可形成Myc-Max和Max-Max两种不同的二聚体，但它们都能与同一DNA序列相结合，产生不同的调节效应。 当缺乏生长因子时，更多的形成Myc-Max复合物，从而诱导细胞凋亡。,Complexes of Myc, Max and Mad,Regulating Roles of Myc,Section 3 Molecular Mechanisms for Cell Apoptosis,目前已知，细胞凋亡可分为caspase依赖和caspase不依赖两种机制，而caspase依赖的细胞凋亡又包括三种方式： 受体介导的细胞凋亡（外源通路）； 线粒体介导的细胞凋亡（内源通路）； 内质网介导的细胞凋亡（内源通路）。,由存在于细胞膜上的死亡受体介导，将外源性凋亡信号传递到细胞内，引发细胞调亡。 常见的死亡受体包括：TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等。,1.1 Cell Apoptosis Mediated by Death Receptor,1. Caspase-dependent Cell Apoptosis,Process of Cell Apoptosis Mediated by Death Receptor,死亡受体与配体结合，使受体三聚化,受体胞内DD区构象改变，与接头蛋白FADD的DD区结合,FADD的N端DED区与caspase-8（或-10）前体蛋白结合，形成凋亡诱导的信号复合体（DISC）,caspase-8、10自身剪切激活，启动caspase级联反应,caspase-3，-6，-7激活,降解CAD抑制蛋白（ICAD/DFF-45），释放出caspase依赖的DNase（CAD）,降解DNA，引发细胞凋亡,Death Receptor Apoptotic Pathway,FADD（Fas-associated death domain）； DD（death domain）； DED （death effector domain）。,1.2 Cell Apoptosis Mediated by Mitochondria,物理或化学凋亡信号,激活Bax、Bad、Bid等促凋亡蛋白，线粒体PT孔开放或形成,线粒体凋亡因子（Cyt c等）渗透出线粒体,Process of Cell Apoptosis Mediated by Mitochondria,Cyt c与Apaf-1及pro-caspase-9组成凋亡体,caspase-9激活并启动caspase级联反应,降解ICAD及细胞功能或结构蛋白，引发细胞凋亡,Mitochondrial Apoptotic Pathway,1.3 Cell Apoptosis Mediated by Endoplasmic Reticulum,内质网在维持细胞内钙离子内环境稳定、膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面有关键性作用。 Caspase-12 位于内质网膜，是内质网应激诱导凋亡所必须的。 内质网应激导致Ca2+释放进入胞浆，激活Calpain（钙激活的中性蛋白酶），水解并激活ca