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常见化学发光体系简述,连海燕 2015-11-25,目录,化学发光免疫分析基本原理,常见的化学发光体系,化学发光免疫分析法分类,常用进口发光免疫分析产品,化学发光免疫分析基本原理,化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析2个系统,免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。,化学发光分析系统是在免疫反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化学发光物质经氧化剂的氧化后,形成一个处于激发态的中间体,会发射光子释放能量以回到稳定基态,发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测，根据化学发光标记物与发光强度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的含量。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）及其衍生物的发光为氧化反应发光，它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶（HRP）催化，被H2O2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光机制,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 光泽精是第一个被发现有化学发光性质的吖啶类化合物，也是应用最广泛的一种吖啶酯类发光试剂。 吖啶类化合物的发光效率高，量子产率可达0.05，作为标记物用于免疫分析，其发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，也不需要增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,吖啶酯化学发光机制,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, （金刚烷）-1,2-二氧环乙烷及其衍生物的发光体系是目前最重要、最灵敏的一类发光体系，主要代表：ALP-AMPPD发光体系。 该体系中溶液的pH增高会增强发光强度,实验证明最佳pH为9.0，在该体系中加入水溶性的大分子物质牛血清白蛋白(BSA)或十四烷酰氨基荧光素与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)构成的水溶性胶粒,可使发光强度增强400倍。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 3-（2-螺旋金刚烷）-4-（3-磷氧酰）苯基-1,2-二氧环乙烷（AMPPD）。 AMPPD是一种超敏感的AP底物,它首先在AP的特异催化下迅速脱磷酸基生成AMPD-阴离子中间体(半衰期230 min), 此不稳定的中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出发出 max为477 nm的光，并可持续几十分钟。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,AMPPD及其衍生物化学发光机制,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 电化学发光的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌Ru(byp) 32+,三丙胺(TPA)用来激发光反应 在阳极表面,两种物质同时失去电子。在电极板上Ru(byp)32+被氧化成Ru(byp)33+ TPA也被氧化成阳离子自由(TPA+*), TPA+*自发地释放一个质子而变成非稳定分子(TPA*), 将一个电子递Ru(byp)33+, 形成激发态的Ru(byp)32+ *。 Ru(byp)32+在衰减的同时发射一个波长为620 nm的光子,重新回到基态Ru(byp)32+,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 反应机理：化学反应诱导的激发态Mn()的磷光，类似于固态Mn ()4T16A1的转换。 高锰酸钾发光反应分为两类：（1）直接与高锰酸钾反应产生化学发光；（2）利用增敏剂增强高锰酸钾化学发光。 目前提出的高锰酸钾化学发光机理中发光体主要有两类：激发态的锰或锰的配合物；单线态氧的二分子复合物。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience, 北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是著名的生物化学发光体系,它由虫荧光素酶、虫荧光素D-(-)-2-6-羧基-2苯并噻唑-2-噻唑啉-4-羧酸、 ATP、Mg2+及O2所组成。 虫荧光素酶在催化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸(由Mg2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成复合物,然后该复合物放出质子,酶变构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。,常见的化学发光体系,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,另一生物发光体系是水母发光蛋白,它不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+或Se2+便能通过分子内反应而发出 max为470 nm的蓝光。 生物发光体系的特点是发光效率、灵敏度、选择性均非常高。,常见的化学发光体系,2,3,1, N-溴代琥珀亚酰胺发光体系 高碘酸钾化学发光体系, Ce（IV）化学发光体系 过氧化草酸化学发光体系, 铁氰化钾发光体系 罗丹明族化合物化学发光体系,其他化学发光体系,化学发光免疫分析法分类,直接化学发光免疫分析,化学发光酶免疫分析,电化学发光免疫分析,直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。,由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光免疫分析,夹心法,直接化学发光的机制,化学发光酶免疫分析,用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA,化学发光酶免疫分析,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,化学发光酶免疫分析,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,化学发光酶免疫分析,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析,以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。,化学发光酶免疫