由阳离子聚合物诱导的微藻-富油新绿藻絮凝的盐效应的了解

由阳离子聚合物诱导的微藻-富油新绿藻絮凝的盐效应的了解 摘要一种用于微藻的收获的机械的研究用来评估阳离子聚合物絮凝的盐效应。聚丙烯酰胺Synthofloc 5080 h和多糖壳聚糖富油新绿藻的絮凝。在海水条件下，用90毫克/升壳聚糖的用量，得到了66%的最大生物量再生率。相比于synthofloc 5080h的再生率大于90%的30毫克/升的剂量，这种物质大约下降了25%。虽然与絮凝剂得到不同的回收率，聚合物表现出明显的由粘度测定的类似聚合物的长度。在Zeta电位的不同下，絮凝剂在盐度的增加时表现出类似的聚合物的长度。这表明聚合物的电荷在絮凝上占主导地位。随着盐度的增加，阳离子聚合物絮凝剂的功效由于阳离子电荷减少而减小。这种机制是通过SEM分析和其他实验中使用的不同电荷密度的絮凝剂确定的。关键字：海洋微藻，收获，絮凝，机制，阳离子聚合物，阳离子电荷 ABSTRACTA mechanistic study was performed to evaluate the effect ofsalinity on cationic polymeric flocculants, that are used for the harvesting of microalgae. The polyacrylamide Synthofloc 5080H and the polysaccharide Chitosan were employed for the flocculation of Neochloris oleoabundans. In seawater conditions, a maximum biomass recovery of 66% was obtained with a dosage of 90 mg/L Chitosan. This recovery was approximately 25% lower compared to Synthofloc 5080H reaching recoveries greater than 90% with dosages of 30 mg/L. Although different recoveries were obtained with both flocculants, the polymersexhibit a similar apparent polymer length, as was evaluated from viscosity measurements. While both flocculants exhibit similar polymer lengths in increasing salinity, the zeta potential differs. This indicates that polymeric charge dominates flocculation. With increased salinity, the effectivity of cationic polymeric flocculants decreases due to a reduction in cationic charge. This mechanism was confirmed through a SEM analysis and additional experiments using flocculants with various charge densities.KEYWORDS:Marine microalgae, Harvesting, Flocculation, Mechanism, Cationic polymers, Cationic charge1. 引言对絮凝的低能量要求使它作为一个集中微藻的有前途的技术(Uduman et al .,2010)。然而，海水养殖微藻的絮凝仍然是非常具有挑战性的。在海水中，离子阻碍的发生，抑制了微藻与絮凝剂分子的相互作用(Bilanovic et al .,1988,Uduman et al .,2010Vandamme et al., 2010, 2013)。不幸的是，只有一小部分的海洋物种的絮凝技术是被报道成功的：即PH值增加，无机絮凝，和聚合物絮凝(Wu et al., 2012; Chatsungnoen and Chisti, 2016; t Lam et al., 2014)。PH值增加导致盐的沉淀。这些沉淀物沉淀下来的同时，也会扫过生物量(Wu et al., 2012)。在他们的研究中，几种微藻已成功地通过提高pH值絮凝出来，导致二价镁离子沉淀。无机絮凝剂在海水盐度的使用也有报道(Chatsungnoen and Chisti, 2016)。然而，通过uduman等人提到的在海水盐度普遍需要高剂量的无机絮凝剂的使用相比于高分子絮凝剂大约高510倍。随着聚合物的絮凝，单个细胞之间的聚合物桥联形成，随后，生物量发生聚集(Vandamme et al.,2013; t Lam et al., 2014)。在高分子絮凝剂中，阳离子聚合物被视为成功的，虽然不是所有的在海洋微藻诱导絮凝上都是同样有效的。目前，只有聚丙烯酰胺是被报导成功的(t Lam et al., 2014; Knig et al., 2014;Roselet et al., 2015)。尽管在海洋微藻的收获上，阳离子聚丙烯酰胺成功了，Lam等人报道，市售阳离子聚合物作为絮凝剂，絮凝剂用量的要求是相当高的（40100毫克/克生物絮凝剂），取得了一个较低的经济可行性。此外，作为絮凝剂聚丙烯酰胺在食物和饲料应用上的使用是被禁止的并被报导通常用于制造他们的是有毒的和非食品级的石油加工技术(Lee et al., 2014)。为了克服这些局限性，具有更好性能的其它絮凝剂，并允许在食品工业和饲料工业应该被选择或设计。允许合理选择或设计新型絮凝剂，对有待发现的海洋微藻成功的絮凝作用机理是负责的。由立等人提出的一种机制，通过bilanovic等人吸附主要是由于絮凝剂和细胞之间的电荷吸引。这些研究表明，由于高的离子强度，排斥力在聚合物盐度升高时降低，导致絮凝剂成卷。由于这一卷，絮凝剂在个体细胞之间失去形成聚合物桥联的能力，随后导致其絮凝性能降低(Tenneyet al., 1969; Bilanovic et al., 1988)。在盐度升高时缺少聚合成卷，因此可能是带电高分子絮凝剂如阳离子聚丙烯酰胺成功的一个解释。然而，最近的roselet等人的研究表明对高分子絮凝剂阳离子电荷对生物量的恢复在聚合物的长度是次要的，不是按照先前规定的解释高分子卷的积极作用。因此，它还很难解释为什么某些阳离子聚合物在海水盐度上诱导絮凝是不成功的。本研究的目的是为了更好地了解阳离子聚合物在海水盐度中的絮凝作用提供进一步的信息和可能揭示为什么阳离子聚丙烯酰胺在其它离子聚合物不行的情况下在高盐度下仍保持功能。这种洞察力也可提供应用在絮凝剂的优化设计的信息。在这项研究中，synthofloc 5080h和壳聚糖作为絮凝剂。synthofloc 5080h是阳离子聚丙烯酰在的絮凝海洋微藻上是被报道成功的(t Lam et al., 2014)。壳聚糖是一种天然多糖，是公认的在淡水条件下诱导絮凝成功但在海水盐度和pH中性时变得不太成功(Bilanovic et al., 1988)。明显的聚合物长度和纯净的阳离子电荷彼此在盐度功能上相比都作为絮凝剂。在这项研究中使用的能够生长在新鲜和盐水条件下的微藻Neochloris oleoabundans。它被报道在有压力条件下含有很高的蛋白质含量和高脂肪含量。这使得N. oleoabundans在多个应用上是一个有趣的物种(Popovich et al., 2012;Breuer et al., 2012)。此外，N.oleoabundans是球形绿藻，因此，在絮凝过程中其形状可消除细胞形态可能的副作用。2 材料与方法2.1 生物培养微藻菌株N.oleoabundans utex1185在不同盐度条件下人工海水媒介下培养NaCl:15g/ L(咸水),25g/L(海水),35g/L(盐水);KNO3:1.7g/L;Na2SO4:0.5g/L; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES): 23.83 g/L; MgSO47H2O:0.73g/L;CaCl22H2O:0.36g/L;K2HPO4:0.43g/L;Na2EDTA2H2O:0.03g/L;MnCl24H2O:0.004g/L;ZnSO47H2O:0.0012g/L;CoCl26H2O:0.0003 g/L;CuSO45H2O:0.0003g/L;Na2MoO42H2O:0.00003g/L;NaFeEDTA:0.01g/L。生物质是种植在100毫升摇动烧瓶有限公司Multitron孵化器。这种养殖是在25下在充满2.5% CO2的大气条件下在120 umol m 2 s 1条件下连续不断的照射。该瓶的摇动设置为90转/分。在接种后培养的生物量部分使用吸管两天后收获。第七天，新养殖为进一步培养接种。通过每七天重新接种新一瓶，经过两天的培养以后，在絮凝实验中我们防止使用有压力的生物质。在此之前的絮凝实验，2个培养周期的九天，让生物量来适应他们的盐度。2.2 絮凝剂据拉姆等人准备了1000 ppm的囤积的溶液。其中被溶解于去离子水中的有低电荷的絮凝剂的synthofloc 5025h，适度带电絮凝剂的synthofloc 5040h ，和高电荷的絮凝剂的synthofloc 5080h 。这个synthofloc 的系列的絮凝剂被德国的Sachtleben Wasserchemie公司慷慨的提供。所有的絮凝剂都是带有不同电荷的大的聚丙烯酰胺并被应用于废水处理中。壳聚糖（从Sigma-Aldrich购买的产品，44886950g）溶解在0.1%（VV）乙酸后，随后其pH值调节至为70.2。絮凝剂是储存在4的黑暗的环境中而且从未存储超过七天。2.3 生物量的再生在收获生物量之后，在已被使用的0.80.01培养基的初始光密度为750nm（相当于一个0.240.07 g / L的干重）。在设定的od750，10毫升的样品被转移到一个烧杯并且搅拌转速为每分钟500转。从原液，絮凝剂添加直到达到所需的剂量（范围在0和90 ppm之间）。在以500转之下的五分钟后，在100 rpm搅拌下10分钟内混合，样品转移至4 mL的聚苯乙烯试管。所使用的混合协议，首先涉及一个剧烈的混合，然后由一个温和的混合时间，按照协议在其他研究报告(Bilanovicet al., 1988)。采用分光光度法（Salim et al.，2012），之后在贝克曼库尔特DU730光度计逐渐生物质复苏。 经过两个小时的沉积,生物复苏测定和计算(Salim et al., 2012)。 所有的实验都是在重复执行:2.4 粘度聚合物溶液的粘度与表面聚合物长度。 研究盐度的影响明显聚合物长度的絮凝剂,絮凝剂的粘度在不同盐度测量解决方案。 絮凝剂浓度范围在0和100 ppm之间。 粘度测量使用自然史MCR 301流变仪。 聚合物解决方案是用各种不同矿化度的NaCl-concentration(清廉g / L氯化钠)。 添加絮凝剂溶液后旋转圆柱,剪切速率下的粘度测量范围从1到100年代1。2.5 -Potential-Potential测量进行网上确定盐度的影响絮凝剂的阳离子电荷。 几种絮凝剂与不同氯化钠浓度准备解决方案。 絮凝剂用量30至200 ppm。 盐度范围在0到4 g / L的氯化钠。 电荷测量使用莫尔文Zetasizer Nano。2.6 扫描电镜成像扫描电子显微镜的对象准备根据萨利姆等人协议中描述。 在这个协议,整除的微藻喜忧参半的絮凝剂。 严重的混合5分钟(500 rpm)其次是十分钟的温和的混合(100 rpm)。 混合后,一滴悬浮絮体被转移到一家poly-L-lysine涂布显微镜盖玻片。 一个小时后,盖玻片是冲洗,在盖玻片和剩余的细胞被固定在3%的戊二醛溶液PBS-buffer一小时。 这些细胞被post-fixated OsO在1%4解决方案一个小时。 之后,固定细胞被冲洗,使用乙醇脱水。 随后,使用临界点公司干2干燥。 干燥后,封面都涂有10 nm使用sputter-coating铱层。3 结果与讨论3.1 絮凝生物量复苏测量在不同剂量Synthofloc 5080 h(图1A)和壳聚糖(图1B)在三个不同矿化度:25岁,35和45 g / L的氯化钠。Synthofloc 5080 h,生物质复苏总是不管盐度高于90%。 低生物量复苏时记录应用壳聚糖作为一种阳离子高分子絮凝剂使用一个类似的剂量。高剂量的生物复苏三个盐度降低7%recovery当使用Synthofloc 5080 h作为絮凝剂(t Lam et al., 2015)。 这是在协议与以前的工作中给出的模型有一个最佳flocculant-biomass比。 当超过这个比例,由于restabilization絮凝成为抑制。图1所示 生物质复苏作为絮凝剂用量的函数在盐度25 g / L(),35 g / L()和45 g / L()。 复苏与Synthofloc 5080 h图,获得壳聚糖在图b所有样本代表生物复制成功使用的壳聚糖在淡水条件下曾被报道(表1),获得的结果图1与这些研究B比较。 在所有的研究中提到的表1在营养的条件下,生物质种植(Salim et al., 2013)。可能的生物效应,如胞外聚合物的形成物质由于营养压力,因此被取消。表1 比较了生物复苏与壳聚糖在中性pH值在各研究物种残雪(g / L)pH值剂量(毫克/升)新鲜/海洋复苏参考c . sorokiniana0.270.0775新鲜的 90%徐et al。(2013)c .寻常的17120年新鲜的92%0.4拉希德et al。(2013)n oleoabundans0.57.2100年新鲜的95%海滩et al。(2012)美国obliquus0.54780年新鲜的95%程et al。(2011)n .盐水湖- - - - - -88海洋 90%Garzon-Sanabria et al。(2013)n oleoabundans0.240.07790年海洋66%本研究生物质复苏之间的比较得到壳聚糖在这个研究和其他研究表明,在海水盐度,大大降低生物质恢复仅仅是获得使用壳聚糖(表1)。 虽然Garzon-Sanabria 等人并煽动生物质复苏用壳聚糖在海水盐度升高,尚不清楚是否有可能的酸度影响涉及作为絮凝剂添加后调整到8在他们的研究。 除了低生物量复苏,其他的研究表1使用大量降低絮凝剂用量。 降低絮凝剂的使用剂量较高的生物量复苏意味着,在其他的研究在淡水条件下,壳聚糖是一个更高效的絮凝剂。聚合物性质的差异,观察Synthofloc 5080 h和壳聚糖之间增加矿化度归因于聚合物螺旋的程度(Bilanovic et al .,1988)。 他们得出的结论是,作为一个函数的盐度、聚合物收缩,直到达到最小的尺寸。3.2 粘度测量验证如果聚合物的卷提供了一个解释降低生物质复苏观察壳聚Synthofloc 5080 h相比,粘度测量的与不同矿化度进行絮凝剂溶解在水里。图2所示 粘度Synthofloc 5080 h以每股100年代1。 每一个酒吧群代表了絮凝剂用量。 在每个集群,盐度增加,相应的传说在正确的地点人物图3所示 粘度壳聚糖以每股100年代1。 每一个酒吧群代表絮凝剂用量。 在每个集群,盐度增加,相应图的传说在正确的地点聚合物溶液的粘度与聚合物表观长度(Yamakawa, 1971; Tricot, 1984;Bilanovic et al., 1988)。在图2和图3,这两个条形图说明粘度作为絮凝剂用量的函数和盐度的函数。在图2获得的粘度下降,Synthofloc 5080 h与描述的趋势一致Bilanovic 等人。在他们的研究中,也降低粘度的函数中盐度观测。 尽管观测到大Synthofloc 5080 h悬浮液的粘度降低高矿化度,它仍然产生絮凝(图1)。外,Synthofloc5080h的粘度急剧下降接近水的粘度值已经在中盐浓度低于1 g / L的氯化钠。 这说明Synthofloc 5080 h对周围的离子聚合物非常敏感力和成为盘绕。与壳聚糖(图2),粘度类似于水的粘度不管絮凝剂用量和盐度。 这些结果说明没有发生卷来解释低生物量复苏了图1与壳聚糖相比,Synthofloc 5080 h。 此外,这两种絮凝剂的粘度类似于水的盐度10 g / L氯化钠和絮凝剂用量低于100 ppm。 这个结果说明这两种絮凝剂有着相似的表面聚合物长度在这些条件。虽然高分子绕线显然发生在盐度升高,这并不能解释Synthofloc 5080 h的成功在高盐度和壳聚糖的减少功能增加盐度海水的盐度是大约35 g / L。 这些结果表明,絮凝剂的另一个特点应该负责的成功程度高矿化度的絮凝剂。3.3 -Potential除了明显的高分子链的长度,电荷的阳离子聚合物可能是一个重要的特性。 随着盐度增加,聚合物的纯净的阳离子电荷应该减少由于周围阴离子。 -Potential测量进行测量的影响,盐度增加净电荷的阳离子聚合物(图4)。 为絮凝剂,聚合潜在的盐度测量作为一个函数。 氯化钠的盐度增加了一个客人。 这些测量进行各种剂量(图4)。图4所示 -potential(氯化钠)的函数(g / L)。 Synthofloc 5080 h,势以:5080 mg / L()和200 mg / L()。 壳聚糖,势以:30 mg / L(),60 mg / L()和90 mg / L()。 误差是重复的与这两种絮凝剂,-potential会随着盐度的函数。 当-potential Synthofloc 5080 h的盐度是的函数与-potential相比壳聚糖(图4),5080年Synthofloc-potential h通常是两倍以上无论盐度。 两种絮凝剂演示初始-potential与盐度急剧减少,但Synthofloc 5080 h总是至少有20 mV或收取高于壳聚糖。观察到的差异的结合阳离子电荷对絮凝剂与观察到的相似粘度与盐度表明阳离子电荷是影响絮凝效率的一个主要参数n oleoabundans在盐水条件下。3.4 扫描电镜成像除了粘度-potential测量,扫描电子显微镜(SEM)进行验证是否区别两种絮凝剂和盐度对絮凝的微藻的结构可以观察到。 目的是想象如果絮凝剂确实是细胞壁的吸附。 此外,照片也可以揭示单个细胞如何相互连接:桥接,打补丁,组合,或另一种可能性。在图5,细胞,形成聚集在微咸盐度进行描述(25 g / L,图5A,C和E)和在高盐度(45 g / L,图5B,D和F)后增加60 mg / L(Synthofloc 5080 h。图5说明了细胞没有微咸盐度的絮凝剂。 根据图,细胞聚集引起的脱水在准备样品。 然而,尽管这个集群,细胞有光滑的表面,不绑定到每个其他纤维网络的絮凝剂。 在咸水环境添加絮凝剂后,Synthofloc 5080 h强烈相互作用单一细胞(图5C和E)。聚合物吸附到表面,形成纤维网络之间的单个细胞。 因此,大絮体形成的聚合物。 此外,似乎所有的絮凝剂吸附细胞,没有观察到non-absorbed絮凝剂。图5B显示了单个细胞也有一个表面光滑的盐水条件。 根据图5D和F,大团聚体形成正如微咸的条件。 然而,在这种高盐度,Synthofloc 5080 h似乎经历一个较弱的相互作用与细胞之间的大型聚合物纤维网络没有观察到单个细胞。 看来,絮凝剂仍然是表面吸附(图5F),然而,他们在本地覆盖细胞表面允许细胞相互作用,形成小的桥梁。在图6,絮凝后的60 mg / L的壳聚糖。图6A、C和E这些照片拍摄于咸水盐度(25 g / L)图6B、D和F在非常盐水条件(45 g / L)。控制图在图6一个是相同的控制在微咸盐度照的照片图5。图6C展览,尽管60 mg / L的壳聚糖添加,没有大聚合是在微咸的条件下形成的。 有几个小聚集形成,但这些包含大约不超过三到四个细胞。 相比,图6C相对大量non-adsorbed观察絮凝剂的白色小骨料之间的藻细胞。图5所示 扫描电镜成像,控制在25 g / L盐度。 B:控制在45 g / L盐度。 C:絮状物与Synthofloc 25 g / L。 D:絮状物与Synthofloc 45 g / L。 艾凡:放大Synthofloc 25 g / L的桥梁。 F:放大的桥梁与Synthofloc 45 g / L。 使用絮凝剂浓度是60 mg / L有类似的观测非常盐水条件。 在图6B中描述的相同的控制图5显示。 另外，小藻絮体中描述图6D和f .在咸水环境,相对大量的non-absorbed絮凝剂仍在小絮体。在这两种盐度,阳离子聚合物壳聚糖似乎更多的相互纠缠比Synthofloc 5080 h。 尽管如此纠缠,聚合物吸附细胞壁。 这是根据观察到的生物复苏获得与壳聚糖(图1B)。观察(图5和图6)与-potential测量的结果相对应。 这是假设必须吸收高分子絮凝剂诱导絮凝前的细胞壁。 混合15分钟之后,似乎所有的Synthofloc 5080 h聚合物吸附自白色总量不再检测。 然而,随着壳聚糖,一个相对大量的non-absorbed聚合物还观察到在絮体。我们之前的工作数学上证实了提出了絮状物形成机理(t Lam et al., 2015),正如在其他早期的研究，认为聚合物吸附(Vandamme et al.,2013)。 这个研究支持的SEM分析建议的机制在细胞壁的吸附絮凝剂。图6所示 扫描电镜成像:控制在25g/L。 B:控制在45g/L。 C:絮状物与壳聚糖在25g/L。 D:絮状物与壳聚糖在45g/L。 艾凡:放大与壳聚糖在25g/L的桥梁。 F:放大的桥梁与壳聚糖在45g/L。 使用絮凝剂浓度是60mg/L。可以增强聚合物吸附到表面电荷差异(Bolto and Gregory, 2007)。 之间的电荷差别越大聚合物和细胞壁，聚合物将吸附(Al-Hashmi and Luckham 2010; Tekin et al., 2010)。这些结果在其他研究表明高收费的必要性聚合物和表面之间的区别(在这种情况下,microalgal细胞壁)。 从这个结论,随之而来的结果报道图4表明阳离子电荷的减少造成了阳离子聚合物。在高盐度的效率下降。除了较低程度的细胞壁吸附的聚合物,Tenney 等人表明电荷中和在诱导絮凝过程中发挥作用。 当电荷中和实际上是发生在絮凝,与更高的阳离子聚合物电荷将在当地更有效中和电荷的单个细胞。阳离子电荷的减少导致较低程度的吸附结合中和细胞的壁电荷的能力下降有可能造成高矿化度的降低壳聚糖絮凝(图1)。 它也可以解释观察到的剩余数量的聚合物混合15分钟后(图6)。3.5在不同的阳离子电荷密度下絮凝确认阳离子电荷减少由于盐度增加导致絮凝,减少额外的测试进行的絮凝剂Synthofloc 50-series。 通过保持聚合物结构(和大小)常数和不同的电荷密度低电荷(5025 h)通过一个温和的阳离子电荷(5040 h)到一个高度紧张的阳离子聚合物(5080 h),阳离子电荷的影响可以证实(图7)。 在这个实验中应用的盐度是35g/L。图7所示 生物质复苏作为电荷密度的函数(控制,5025 h;5025 h和5040 h)。 所有的实验都在生物重复执行。 Synthofloc 5080 h是改编自图1。根据图7,絮凝剂剂量30毫克/升,絮凝剂的电荷密度最高(5080 h)是最有效的在海洋条件下收获的生物量。 平均高出9%生物复苏得到比5025 h 5080 h。 这些结果表明,高电荷密度导致更大的生物复苏。 中给出的结果的结合图7与观察到的减少-potential中等盐度的函数(图4)和生物复苏的明显独立的卷度絮凝剂表明,由于高矿化度的降低阳离子电荷,絮凝剂变得不那么实用。 生物量的变化恢复作为电荷密度的函数,类似的结果图7,以前观察到Rosel等人。在他们的研究中,淡水microalga小球藻寻常的和海水microalgaNannochloropsis oculata与阳离子絮凝的聚(丙烯酰胺)的“Flopam”系列。 通过维护一个常数聚合物大小和不同电荷密度从0%提高到100%,阳离子电荷的影响生物质复苏的决心。 生物质复苏从复苏增长低于10%,回收率高于90%与微藻作为电荷密度的函数。4 结论纯净的阳离子电荷的减少高矿化度煽动阳离子聚合物和诱发絮凝的功能下降n oleoabundans。 在高矿化度,由此产生的低电荷造成效率下降形成聚合物单个细胞之间的桥梁。 这一观点导致了这样的结论:阳离子电荷是一个重要的标准在选择阳离子聚合物作为海洋应用明显的絮凝剂聚合物长度是小巫见大巫。 这项研究还显示,在咸水和海洋条件下,聚合物桥接是一个占主导地位的机制为阳离子聚合物絮凝。致谢执行这项工作在TKI AlgaePARC生物炼油厂项目与金融的支持荷兰经济部框架的TKI nr BioBased经济合同。TKIBE01009。 作者感谢食品过程工程系(瓦赫宁根大学),特别是,乔斯Sewalt协助分析絮凝剂。 作者感谢马塞尔吉斯贝斯瓦赫宁根电子显微镜中心的瓦赫宁根大学的支持与扫描电镜成像。 作者感谢收到聚(丙烯酸)amidic絮凝剂从Sachtleben Wasserchemie GmbH(德国)。参考文献1 Al-Hashmi, A.R., Luckham, P.F.,2010. 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