HPLC法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度

毕业论文（设计） 毕 业 论 文论文题目HPLC法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度英文题目Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLC专 业药物分析 19HPLC法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度目录摘要2前言4第二章 仪器与试药61.1 仪器61.2 药品与试剂6第二章 方法与结果72.1 色谱条件72.2 溶液的配制72.2.1标准溶液的配制72.2.2内标溶液的配制82.2.3稳定剂的配制82.3 血浆样品预处理82.4 方法专属性（考察血浆内源性物质的干扰）82.5 标准曲线及定量下限102.6 回收率试验112.7 精密度试验132.8 稳定性试验14第三章 讨论153.1 亚胺培南的立体异构153.2流动相组分的选择153.3 蛋白沉淀方法的选择163.4 内标化合物的选择163.5 血浆中亚胺培南的稳定性以及稳定剂的选择16第四章 临床应用17第五章 结论17参考文献18致谢20HPLC法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度学号：1141528 姓名：张雪晶摘要：目的 建立一种快速、简单、可靠、灵敏度高、选择性好的高效液相色谱法来测定人血浆中亚胺培南的浓度，为其临床合理用药和药代动力学研究提供试验方法。方法 以比阿培南(Biapenem ,BIP)为内标，以0.5 mol/L(pH6.0)吗啉乙磺酸(4-Morpholineethanesulfonic acid，MES)作为稳定剂，血浆样品预处理采用沉淀蛋白法：乙腈：含药血浆以3:1的体积比沉淀蛋白，经高速冷冻离心机离心后，取上清液进样。色谱柱为Alltima HP HILIC 5m(4.6 mm250 mm)；流动相为10mmol/L乙酸铵：乙腈（40:60）；流速为1.0mL/min；柱温：35 ；检测波长:298nm。结果 亚胺培南在?50g/mL的浓度范围内线性关系良好，R=0.9997；定量下限为1g/mL；高，中，低，LLOQ浓度点的亚胺培南提取回收率相一致，均在60%左右，并且高，中，低，LLOQ4个浓度点的亚胺培南的提取回收率的RSD均小于15%，具有良好的精密度和重现性；日内、日间RSD 均小于15%。结论 本方法操作简单、快捷、准确、灵敏度高，重复性和选择性良好，适用于临床上对亚胺培南进行血药浓度监测的快速。关键词：高效液相色谱；亚胺培南；血药浓度Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLCAbstract: Objective To establish and optimize a fast, simple, reliable, high-sensitivity and good-selectivity high Performance liquid chromatography method for determining the concentration of imipenem in human plasma for providing a pratical method for pharmacokinetic studies and clinical use of imipenem. Methods: Plasma samples were spiked with 0.5mol/L(pH6.0) MES as the stabilizer solution, biapenem as the internal standard, plasma was precipitated with acetonitrile of 3 times volumn of it, after mixed for 3 mins, they were centrifuged with high speed freezing centrifuge and the supernatant was injected. Separation was achieved on an Alltima HP HILIC column 5m(4.6 mm250 mm). The mobile phase was a mixture of 10mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (40:60,v/v), and the pump flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 35 . The UV detection wavelength was 298 nm. Results: Calibration curves of imipenem showed good linear regression in the range of ?50 g/mL(R= 0.9997). The lower limit of quantification of imipenem was ?g/mL. The extraction recovery between the high, medium, low and LLOQ concentration of imipenem in quality control samples was consistent with each other, and was around 60%. The RSD of the four concentration level QC sample was less than 15% with good precision and reproducibility. Intra- and inter-day variations were MIC)的情况下才能获得。对于重症患者而言，其病理生理存在特殊性，亚胺培南在其体内药物分布和半衰期等将发生改变，血药浓度个体差异大并且将难以预测。据国外文献报道，在推荐剂量下使用亚胺培南治疗由铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌引起的肺炎，约有15%30%的患者无法达到最佳治疗效果。而当大剂量给予亚胺培南治疗严重感染如感染性心内膜炎、骨髓炎等，又容易引起惊厥、意识障碍等严重中枢神经系统不良反应，因此，在临床治疗中对亚胺培南进行血药浓度监测是十分必要的，特别是对于一些重症监护室患者，严重感染已成为其主要死亡原因之一，对其进行亚胺培南TDM工作意义重大，有利于降低死亡率，改善临床预后。要实现亚胺培南的临床药物浓度监测，就必需建立简便、快速、灵敏、稳定的定量测定人血中亚胺培南浓度的方法，目前，国内外已有文献对建立人血浆中亚胺培南浓度测定的HPLC法进行了研究和阐述，对本实验的开展具有一定的借鉴和指导意义，但是色谱条件不同，所建立HPLC方法学也将存在差异。考虑到不同实验室实验条件的差异性（主要是色谱条件的差异），再加上针对于重症患者在临床上药动学/药效学研究数据相对的缺乏，经典的药动学参数不适用于重症患者，临床急需这类患者的药动学研究数据作为用药依据，所以很有必要结合本临床实验室实验条件，在相关文献的指导下，建立适合人血浆中亚胺培南浓度测定的HPLC-UV 方法，并利用药代动力学原理将其应用于临床患者的血药浓度监测，以获得优化的疗效和产生低细菌耐药性，提供药动学研究数据用以指导亚胺培南临床个体化用药以确保安全性和有效性。图1.亚胺培南的分子结构 第二章 仪器与试药1.1 仪器岛津高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司）：包括LC-20AD泵，SPD-20A紫外检测器，DGU-20A在线脱气单元，CBM-20A系统控制器，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器；十万分之一天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore）；KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；VIicro CL21R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific公司），IKA GENIUS 3涡旋震荡仪（德国IKA 公司，），PHS-25 pH计（上海精密科学仪器厂），移液器（德国Eppendorf公司）。1.2 药品与试剂血浆样品（东南大学附属中大医院提供）；乙腈（色谱纯，TEDIA公司）；乙酸铵（色谱纯，西陇化工股份有限公司）；亚胺培南标准品IMP（公司）；比阿培南标准品BIP（公司）；吗啉乙磺酸MES（Aladdin Industrial Corporation ShangHai China）；氢氧化钠NaOH(上海展云化工有限公司)；超纯水（美国MILLIPORE设备）第二章 方法与结果2.1 色谱条件Alltima HP HILIC色谱柱（4.6mm250mm，5m）；流动相：乙腈-10mmol/L乙酸铵（60:40，V/V）；流速：1mL/min;柱温：35；检测波长：298nm；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：25L梯度洗脱时间程序如下表：时间min单元处理命令值0.010.01泵FlowFlow0.40.66.306.30泵FlowFlow0.40.67.007.00泵FlowFlow0.60.49.009.00泵FlowFlow0.60.49.309.30泵FlowFlow0.40.612.01控制器Stop2.2 溶液的配制2.2.1标准溶液的配制采用十万分之一天平精密称取亚胺培南标准品适量，用稀释液（ACN：MES ，60：40）配制成1mg/mL的亚胺培南标准贮备液，于-20的条件下冰箱保存备用。精密量取适量亚胺培南标准贮备液，采用稀释液定量稀释，配制成质量浓度从高到底依次为500，400，200,100,50,20,10g/mL的亚胺培南系列标准品溶液，系列亚胺培南标准品溶液现用现配。2.2.2内标溶液的配制采用十万分之一天平精密称取比阿培南适量，用甲醇：水（1:2）溶解稀释得1mg/mL的比阿培南内标贮备液，冰箱保存备用。精密量取内标贮备液适量用甲醇：水（1:2）定量稀释，配制成100g/mL的内标溶液在-20的条件下保存，临用时取出。2.2.3稳定剂的配制采用十万分之一天平精密称取吗啉乙磺酸（MES）适量，用超纯水（美国MILLIPORE设备制得）溶解后，采用5Mol/L的氢氧化钠溶液，pH计调pH至6.0，配制成0.5mol/L的稳定剂吗啉乙磺酸MES（pH6.0）溶液，冷藏保存于8的条件下，临用时取出。2.3 血浆样品预处理本实验在临床上所获得的血浆与稳定剂1:1混合均匀后，移液枪精密吸取浓度为100g/mL的比阿培南内标溶液液10L，置于1.5mL的EP管中，再准确加入血浆样品（已与稳定剂混合均匀）100L，涡旋仪上涡旋混匀30 s 后，加入乙腈300L（含药血浆：乙腈，1:3，V/V），涡旋1 min，在高速冷冻离心机中以20000g，4，离心5 min，吸取上清液于进样小瓶中，进样25L。2.4 方法专属性（考察血浆内源性物质的干扰）采用“2.1”项下的本实验的色谱条件，考察空白血浆（6个不同个体的空白血浆和6个不同个体的空白血浆的混合血浆），空白血浆加入亚胺培南标准品溶液及内标溶液，以及给药后临床患者的血浆样品色谱图，结果，注射用亚胺培南的保留时间在5.1左右，内标化合物比阿培南的保留时间在5.5左右，二者分离度R1.5达到定量要求，而且二者峰形对称性良好，血浆中的内源性物质以及西司他汀钠均在1.5-4.5min内出峰，对亚胺培南及内标物的测定不存在干扰，并且本实验色谱条件能够抑制亚胺培南构象异构体的分离，有效避免亚胺培南色谱峰形的列分或者展宽。高效液相色谱图如下：A. 空白血浆B. 空白血浆+亚胺培南标准溶液+内标物C. 给药后临床患者血浆色谱图+内标物图2. HPLC色谱图. 1为亚胺培南，2为内标物比阿培南2.5 标准曲线及定量下限取1mg/mL的亚胺培南标准贮备液，用稀释液定量配制系列标准溶液。取解冻后的空白血浆90L，置于1.5mL的EP管中，分别精密加入500,400,200,50,20,10g/mL的亚胺培南系列标准品溶液各10L于90L空白血浆中，涡旋仪上混合均匀，使得血药浓度相当于50,40,20,5,2,1g/mL，精密量取100L的稳定剂吗啉乙磺酸MES（pH6.0）涡旋混匀后，按照“2.3 血浆样品预处理”项下方法同法处理后，进样25L,记录色谱图，记录亚胺培南与比阿培南的保留时间和峰面积，以亚胺培南血浆浓度为横坐标，亚胺培南与内标物比阿培南的峰面积之比为纵坐标，对亚胺培南血药浓度进行线性回归，所得到的线性回归方程为：Y=0.0523X+0.0318，=0.9997，结果表明，亚胺培南在150g/mL的浓度范围内，浓度与峰面积具有良好的线性关系，标准曲线上的最低浓度点1g/mL的RSD1.5。3.3 蛋白沉淀方法的选择 亚胺培南属于碳青霉烯类抗生素，在血浆中是很不稳定的，溶液的pH 偏酸或偏碱均会加快其降解。目前实际工作中常用的血浆样品预处理方法有：去除蛋白质法，液液萃取法（LLE），固相萃取法（SPE）等。其中去除蛋白质的方法常用的有：溶剂解法，加入中性盐，加入强酸，超滤法等。采用10%的三氯醋酸去除蛋白质在本实验中不适用，因为强酸直接沉淀将会使亚胺培南快速降解，使得提取回收率大大降低。查阅文献资料后考虑使用乙腈一步沉淀蛋白，与甲醇，丙酮相比乙腈沉淀效率最高，含药血浆与乙腈体积比为1:3，可将90%蛋白质沉淀除去。3.4 内标化合物的选择检索查阅已报道的国内外文献，整理总结后得知目前测定亚胺培南血药浓度所采用的内标化合物有：5-溴脲嘧啶，5-羟基吲哚-3-醋酸，以及培南类系列抗生素同时测定时相互彼此作为内标化合物。考虑使用培南类系列抗生素作为本实验的内标物，重点考察了法罗培南与比阿培南，在2.1项下的色谱条件下，法罗培南标准品溶液直接进样后发现其保留时间为2.552min,而血浆中的内源性物质也在此处出峰，血浆内源性物质将会对法罗培南峰面积造成影响，因此法罗培南不能作为本实验的内标物。将比阿培南标准品溶液直接进样后发现，比阿培南保留时间为5.40-5.50min之间，在流动相为乙腈：乙酸铵（60:40，V/V）的条件下，比阿培南与亚胺培南色谱峰能达到基线分离，分离度R1.5,满足色谱峰达到分离的指标，最终本实验选择比阿培南作为本实验的内标化合物,浓度为100g/mL。3.5 血浆中亚胺培南的稳定性以及稳定剂的选择亚胺培南系具碳青霉烯环的thienamycin类衍生物,其稳定性较好; 但在血浆中却极不稳定,温度对其稳定性影响较大，温度升高，含量很快下降，其降解具有温度依赖性。这种现象在 -内酰胺类抗生素中极少见。需要加入稳定剂来增加其在血浆中的稳定性。检索查阅国内外文献报道，采用HPLC法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度所采用的稳定剂有2-吗啉乙磺酸，3-吗啉丙磺酸（MOPS），N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸( HEPES)等，结合本实验所使用的色谱柱及色谱条件，选择使用吗啉乙磺酸作为本实验的稳定剂，参考使用3-吗啉丙磺酸作为稳定剂的文献报道，将稳定剂吗啉丙磺酸配制成0.5Mol/L的水溶液，用5Mol/L氢氧化钠调pH至6.0，作为本实验的稳定剂，稳定剂需在8冷藏，临用时取出。第四章 临床应用在临床治疗过程中，ICU重症感染患者使用注射用亚胺培南西司他丁钠第五章 结论 本实验采用比阿培南作为内标物，吗啉乙磺酸作为稳定剂，建立了测定人血浆中亚胺培南的血药浓度的高效液相色谱-紫外分光光度法，血浆样品预处理步骤简单，方法准确度好，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，选择性好，可用于快速测定人血浆中亚胺培南的浓度。目前该方法已经应用于临床上重症感染患者亚胺培南治疗药物浓度监测，结果表明，该方法能够满足临床亚胺培南血药浓度的快速监测，为个体化给药方案的制定提供技术检测依据，指导临床合理用药，同时也为进行亚胺培南重症感染患者的药代动力学研究提供了实验室依据。参考文献1 黄荣飞,沈杰,王沛松. 碳青霉烯类抗生素的作用特点及研制开发背景J . 中国医学研究与临床,2003 ,1 (12) :46 - 48.2张宇. 碳青霉烯类抗生素的研究进展J. 中国新药杂志,2007,14:1078-1082.3 彭司勋. 药物化学回顾与发展M . 北京: 人民卫生出版社,2002 :144.4徐辉,徐玉兰,马红梅. 碳青霉烯类抗生素的研究进展J. 沈阳药科大学学报,2007,06:385-388.5 Ikawa K,Morikawa N,Sakamoto K,et al. 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