姜黄素介导NSC-34细胞抗氧化应激 能力的调节

毕业论文(设计)题目：姜黄素介导NSC-34细胞抗氧化应激能力的调节专业药学目 录中文摘要1英文摘要2前言3正文41方法与材料41.1试剂和仪器41.2细胞培养与处理41.3 CCK-8比色法检测细胞活力51.4检测细胞内MDA、GSH水平51.5 Real-time PCR检测细胞内GST、GCLC的表达变化71.6统计学处理72结果82.1细胞存活率82.2姜黄素预处理对细胞内MDA、GSH含量的影响92.3姜黄素调节细胞内GST、GCLC的表达变化113讨论13结论14参考文献16综述19致谢24摘 要目的：利用NSC-34细胞建立氧化应激细胞损伤hSOD1 G93A突变型ALS细胞模型，探讨天然抗氧化剂姜黄素在细胞抗氧化应激中的作用，为开发防治肌萎缩侧索硬化综合症的药物提供坚实的实验基础。方法：CCK-8比色法检测不同浓度梯度的H2O2和姜黄素处理细胞对细胞活力的影响，分光光度计法检测给予姜黄素补充后对用H2O2处理转染hSOD1 G93A突变型NSC-34细胞内丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量变化以及real-time PCR检测细胞内GSH合成酶类GST、GCLC的表达变化。结果：CCK-8结果对比不同浓度梯度H2O2和姜黄素对细胞活力的影响，我们选取终浓度为10 M H2O2和10 M姜黄素作为后续研究条件。与直接给予H2O2(10 M)处理的转染hSOD1 G93A突变型NSC-34细胞相比较，分光光度法显示给予姜黄素(10 M)预处理后细胞内MDA含量明显下降，氧化应激损伤改善明显；H2O2孵育24 h显著降低细胞内GSH浓度，给予姜黄素(10 M)共同孵育可有效升高细胞内GSH的浓度。此外，real-time PCR结果显示姜黄素预处理使细胞内GST和GCLC mRNA的表达升高(P 0.01)。结论：姜黄素可能通过增强对细胞抗氧化物质合成的调节来增强ALS细胞模型抗氧化应激的能力。关键词：姜黄素；肌萎缩侧索硬化综合症；氧化应激；丙二醛；谷胱甘肽21AbstractObjective: The effect of curcumin on the antioxidant stress in the cells was established by using NSC-34 cells to establish a model of oxidative stress injury. It provides a solid experimental basis for the development of drugs for prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis syndrome.Methods: CCK-8 Colorimetric Method were used to detect the effects of H2O2 and Curcumin-treated Cell on cell viability. Spectrophotometer were used to detect the changes of MDA and GSH in hSOD1G93A mutant transfected NSC-34 cells (SOD1G93A NSC-34) treated with H2O2 after pre-treated with curcumin. And the changes of GST and GCLC in the cells were detected by real-time PCR. Results: CCK-8 results were compared with different concentrations of H2O2 and curcumin on the cell viability, we selected the final concentration of 10 M H2O2 and 10 M curcumin as a follow-up study conditions. Compared with the transfected hSOD1 G93A mutant NSC-34 cells treated with H2O2 (10 M), spectrophotometry showed that the content of MDA in the cells pretreated with curcumin (10 M) was significantly decreased and the oxidative stress was significantly improved. After incubation with H2O2 for 24 h, the concentration of GSH in the cells was significantly decreased, and the concentration of GSH was increased by co-incubation with curcumin (10 M). In addition, real-time PCR results showed that the expression of GST and GCLC mRNA was increased by curcumin pretreatment (P 0.01).Conclusion: Curcumin may enhance the ability of anti-oxidative stress in ALS cell models by enhancing the regulation of cell antioxidant production.Key words: Curcumin; Amyotrophic lateral sclerosis; Oxidative stress; MDA; GSH前 言肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种由于在脊髓、脑干、运动皮质的运动神经元发生进行性退变引起的神经退行性疾病。该病发病率随年龄增长，多见于45至65岁，随着人口老龄化，罹患ALS人群将增加，目前ALS中神经元功能障碍的原因仍不清晰，且缺乏有效的治疗药物1,2，还没有有效延长患者寿命的治疗方案。研究资料表明，ALS发病相关机制主要包括：氧化应激、错误折叠蛋白的毒性作用、线粒体功能异常、神经炎症、兴奋毒性等，然而以上因素均与机体氧化还原调节失衡导致的氧化应激密切相关。氧化应激可以导致一系列生物大分子(如酶、蛋白质、DNA等)的氧化损伤3，从而进一步导致神经细胞功能及其完整性遭到破坏，进而使其恶化直至神经元网络功能紊乱，最终引起神经退行性疾病的发生。姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(Curcumalonga L.)中分离出来一种低分子质量多酚类化合物，研究发现其在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等具有广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小4。实验表明姜黄素对超氧阴离子如羟自由基等有强的清除能力，增加细胞内还原性谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平，从而减低H2O2引起的细胞内活性氧(reactive oxygens pecies, ROS)生成，恢复细胞内氧化还原平衡状态。Dong H等人的研究发现使用15 M姜黄素预处理运动神经细胞，可以明显改善家族性(FALS)和散发性(SALS)患者皮质细胞内由氧化应激和线粒体功能障碍导致的超兴奋状态5，以上提示姜黄素在治疗ALS疾病存在一定的潜力。本实验通过研究姜黄素对细胞抗氧化应激能力的调节，探究姜黄素的神经保护作用机制，从而为ALS治疗的药物提供理论依据。正 文1 方法与材料1.1 试剂和仪器姜黄素Cayman Chemical公司H2O2南京XX生物技术有限公司Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)南京XX生物技术有限公司脂质氧化物丙二醛（MDA）检测试剂南京XX生物技术有限公司谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）检测试剂南京XX生物技术有限公司胎牛血清上海依科赛生物制品有限公司DMEM高糖培养基HyCloneThermo Fisher Scientific公司酶标检测仪（Multiskan MK3型）Thermo公司二氧化碳培养箱（HERAcell 150i型）Thermo公司可见分光光度计（V-5000型）METASH公司real-time PCR(CFX96TM Optics型)singapore公司1.2 细胞培养与处理NSC-34细胞由小鼠神经母细胞瘤及胚胎期(1214天)脊髓运动神经元杂交而成的运动神经元样细胞系，具有运动神经元产生动作电位、表达神经丝、合成释放乙酰胆碱等独特性质，广泛用于包括ALS在内的多种中枢神经系统变性疾病的研究，由潍坊医学院人体解剖与组织胚胎学重点学科保存并提供。将NSC-34细胞培养在含有10 %胎牛血清的DMEM培养基中，37 、5 % CO2的培养箱中培养，每隔48 h更换培养基，待单层培养细胞生长至80 % - 90 %融合后传代，选取对数生长期细胞进行实验。将NSC-34细胞以2 106/孔接种于6孔板中，37 、5 % CO2培养箱中培养24 h后以每孔2 g pEGFP-G93A-SOD1质粒进行转染，转染方法参照 Lipofectamine2000 操作说明书进行，后置于37 、5 % CO2培养箱孵育6 h后更换完全培养基培养，转染后24 h用于后续研究。1.3 CCK-8比色法检测细胞活力将转染后的NSC-34细胞以10000 个/孔接种于96 孔培养板，后置于37 、5 % CO2培养箱培养24 h 后给予如下处理：1.3.1 H2O2的最适浓度的确定分别以终浓度为5 M 、10 M 、20 M 、40 M 的H2O2处理细胞，以0 M H2O2组为对照组。每组设置6个平行孔，置于37 、5 % CO2培养箱孵育24 h，采用CCK-8比色法检测细胞活力，重复测定三次，确定H2O2的最适浓度。1.3.2 姜黄素的最适浓度的确定分别以终浓度为5 M 、10 M 、20 M 、40 M姜黄素处理细胞，以0 M姜黄素组为对照组。每组设置6个平行孔，置于37 、5 % CO2培养箱孵育24 h，采用CCK-8比色法检测细胞活力，重复测定三次，确定姜黄素的最适浓度。CCK-8比色法：(1) 将如上处理细胞培养板中原有培养基小心吸出，后取37 预热的的100 l完全培养基加入到培养板中；(2) 将培养板在培养箱中继续培养24 h；(3) 每孔依次小心加入10 l CCK-8溶液，注意尽量不要在培养板的孔中生成气泡以免影响观测；(4) 将培养板在37 、5 % CO2培养箱内孵育4 h后取出观察。(5) 用酶标仪在波长为450 nm处的测定其吸光度(OD值)，计算细胞存活率。细胞的存活率=各测试孔的OD值本底OD值(完全培养基加CCK-8，无细胞)，各重复孔的OD值取均数SD来表示。细胞的存活率以T/C %表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。细胞存活率%=(加药细胞的OD值/对照细胞的OD值)100 %求出T/C = 50%时的药物浓度1.4 检测细胞内MDA、GSH水平SOD1G93A转染细胞做如下分组，第一组为对照组，第二组为10 M H2O2孵育24 h组，第三组给予10 M姜黄素进行预处理4 h，随后暴露于10 M H2O2浓度下24 h。如上处理后收集细胞并制备细胞匀浆，按照MDA、GSH测定试剂盒说明提取样品并配制试管，用分光光度计在最适波长处测量各管的吸光度值，观察计算细胞内MDA、GSH含量变化，测定方法见表1、表2。空白管标准管测定管对照管10nM/ml标准品0.1无水乙醇(ml)0.1测试样品(ml)0.10.1工作液I(ml)4444工作液II(ml)4表1 MDA含量测定如上配制各管后使用涡旋混悬器混匀，使用保鲜膜将试管口扎紧，然后用针头扎一个小孔，放入水浴锅中95 水浴40 min后取出用冷水冷却。后使用分光光度计在波长532 nm处，比色杯1 cm光径，使用双蒸水调零，测定各管吸光度。MDA含量(nM/mgprot)=(测定OD值-对照OD值)(标准OD值-空白OD值)标准品浓度(10 nM/ml)待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)GSH含量测定：上清液制备：取待测样品0.5 ml加试剂一2 ml混匀，35004000 rpm/min离心10 min，取上清液进行显色反应。表2 GSH显色反应空白管标准管测定管试剂一(ml)1.020 M/l GSH标准(ml)1.0上清液(ml)1.0试剂二(ml)1.251.251.25试剂三(ml)0.250.250.25试剂四(ml)0.050.050.05如上配制各管后用涡旋器混匀，静置5 min,使用分光光度计在波长420 nm处，比色杯1 cm光径，使用双蒸水调零，测定各管的吸光度值。GSH含量(mgGSH/gprot)=(测定OD值-空白OD值)(标准OD值-空白OD值)标准品浓度(2010-3 mM/l)样本测试前稀释倍数待测匀浆蛋白浓度(gprot/l)。1.5 Real-time PCR检测细胞内GST、GCLC的表达变化如上处理后收集细胞并制备细胞匀浆，按照Trizol试剂盒说明方法提取细胞总RNA ，利用Promega逆转录反应体系建立逆转录反应，然后以逆转录产物为模板配置实时定量PCR体系。GST引物序列：上游为GGATGGGGACTTCGTCTTGG，下游为：TCAGGAGGTACGGGCTGTC；GCLC引物序列：上游为GGGGTGACGAGGTGGAGTA，下游为：GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC；-actin引物序列：上游为TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG，下游为：ATAGAGGTCTTTACGGATGTCAACG。PCR反应条件：95 预变性10 min，95 变性15 sec，58 退火1 min，72 延伸1 min，重复40个循环。实验结果采用2Ct法分析。1.6 统计学处理实验结果采用均数标准误(mean S.E.M.)表示，应用GraphPad Prism 5统计软件采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，并以Newman-Keuls法进行组间比较，P 0.05表明结果有统计学意义。2 结果2.1 细胞存活率我们采用CCK-8比色法检测了不同浓度梯度(0 - 40 M) H2O2和不同浓度梯度(0 - 40 M) 姜黄素对SOD1G93A转染NSC-34细胞存活率的影响，进一步筛选出最适浓度。结果表明：2.1.1 H2O2最适浓度的确定由图1可知，与对照组相比较，5 M H2O2对SOD1G93A转染NSC-34细胞无明显损伤作用，3、4、5组分别给予10 M、20 M、40 M H2O2时，细胞相对存活率约为对照组的58 %、37 %及26 %，差别有统计学意义(P 0.01)，最终我们选择10 M H2O2刺激细胞24 h作为后续研究条件。图1 H2O2诱导SOD1G93A转染NSC-34细胞损伤的作用每个条表示平均值S.E.M。n = 4，* P 0.01(与对照组相比)Fig1 Effects of H2O2 induced cell insult in SOD1G93A transfected NSC-34 cellEach bar represents the meanS.E.M. n=4, *P 0.01 compared with control2.1.2 姜黄素最适浓度的确定由图2可知，与对照组相比较，5 M、10 M、20 M 姜黄素对SOD1G93A转染NSC-34细胞损伤作用不明显，差异无统计学意义；40 M姜黄素组细胞存活率约为对照组的72 %，显示在此浓度下细胞存活率显著降低，差别有统计学意义(P 0.01)。最终我们选择10 M作为姜黄素的最适浓度。且经分光光度法检验经姜黄素10 M预处理时，细胞内MDA含量明显降低同时GSH含量有所升高(P 0.01)(图3、4)。后续实验中选取10 M作为姜黄素处理浓度图2 姜黄素诱导SOD1G93A转染NSC-34细胞中损伤的作用每个条表示平均值S.E.M。n = 4, * P 0.01(与对照组相比)Fig2 Effects of curcumin induced cell insult in SOD1G93A transfected NSC-34 cellEach bar represents the meanS.E.M. n=4, *P 0.01 compared with control2.2 姜黄素预处理对细胞内MDA、GSH 含量的影响2.2.1 细胞内MDA含量的变化由图3可知，与对照组相比较，直接给予10 M H2O2处理的SOD1G93A转染NSC-34细胞中MDA的含量升高约一倍，差异具有统计学意义(P 0.01)。10 M姜黄素预处理4 h后与10 M H2O2共同孵育24 h后，与直接使用10 M H2O2组比较细胞内MDA含量明显降低，氧化异常现象显著改善，差异具有统计学意义(P 0.01)。图3 姜黄素对H2O2诱导的SOD1G93A转染NSC-34细胞中MDA含量的影响每个条表示平均值S.E.M。n = 4, * P 0.01(与对照组相比)；#P 0.01(与H2O2组相比)Fig3 Effects of curcumin on H2O2 induced MDA production in SOD1G93A transfected NSC-34 cellEach bar represents the meanS.E.M. n=4, *P 0.01 compared with control; #P 0.01 compared with the H2O2 group2.2.2 细胞内GSH含量的变化由图4可知，与对照组相比较，SOD1G93A转染NSC-34细胞直接使用10 M H2O2处理使细胞内GSH浓度降低(P 0.05)，对转染细胞给予10 M姜黄素进行预处理4 h，随后暴露于10 M H2O2下24 h，分光光度法结果显示使用10 M姜黄素预处理细胞之后可以逆转这一过程，升高细胞内GSH的浓度(P 0.01)。图4 姜黄素对H2O2诱导的SOD1G93A转染NSC-34细胞中GSH含量的影响每个条代表平均值S.E.M。n = 4, * P 0.05, * P 0.01(与对照组相比)，#P 0.01(与H2O2组相比)Fig4 Effects of curcumin on H2O2 induced GSH production in SOD1G93A transfected NSC-34 cellEach bar represents the meanS.E.M. n=4, *P 0.05, *P 0.01 compared with control; #P 0.01 compared with the H2O2 group2.3 姜黄素调节细胞内GST、GCLC的表达变化由图5可知，Real-time PCR结果显示，与对照组相比较，SOD1G93A转染NSC-34细胞直接使用10 M H2O2处理使细胞内GST (A)、GCLC (B)浓度降低(P 0.05)，实验结果表明姜黄素预处理可以逆转这个过程，升高了细胞内GST、GCLC的浓度，差异具有统计学意义(P 0.01)。图5. 姜黄素对H2O2诱导的SOD1G93A转染NSC-34细胞中GST, GCLC mRNA表达的影响。每个条形代表平均值S.E.M。n = 4, * P 0.05, * P 0.01(与对照组相比)；P 0.01(与H2O2组相比)。Fig5. Effects of curcumin on H2O2 induced GST, GCLC mRNA expression in SOD1G93A transfected NSC-34 cell.Each bar represents the meansS.E.M. n=4, *P 0.05, *P 0.01 compared with control; #P 0.01 compared with the H2O2 group.3 讨论ALS是成人最严重的运动神经元疾病之一，伴随着身体机能的下降并有致命的危险6，其发病机制不详，且缺乏有效的治疗药物7，所以寻找一种可以治疗该疾病的药物是非常重要的。近年研究表明氧化应激参与神经退行性疾病的发生与发展过程，为药物治疗激活内源性细胞保护系统治疗疾病提供了依据8。氧化应激是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间失衡所表现的一种应激损伤状态，机体内活性氧及羟自由基生成量增加而清除量降低，表现为机体的抗氧化防御功能降低，活性氧破坏细胞内蛋白质、脂质、DNA等大分子物质，从而造成细胞损伤，最终将导致细胞的死亡9。在ALS患者及动物模型中均检测到高水平氧化的蛋白质、DNA、膜磷脂等大分子物质的存在10。有研究显示大约20 %的家族性ALS(FALS)患者体内存在着超氧化物歧化酶(superoxidedismutase 1, SOD1)突变，其中以G93A位点突变最常见，通过产生过量的自由基，造成神经系统的损伤7。表明氧化应激在ALS的疾病进程中扮演了重要角色，也提示了抗氧化方案在治疗中的潜力。H2O2是一种参与多种神经系统疾病的活性氧成分，常被用作触发神经元氧化损伤的诱导剂11。本试验中H2O2引起SOD1G93A转染NSC-34细胞中MDA水平升高，GSH含量降低，即H2O2会导致SOD1G93A转染NSC-34细胞氧化水平上升，抗氧化能力下降。MDA是衡量细胞内氧化应激水平的一个重要指标，作为细胞发生氧化损伤后的产物，可以精确的反应细胞氧化损伤的程度12,13。GSH作为一种具有重要生理功能的天然活性肽，在机体内发挥清除活性氧作用。有研究结果表明在给予外源GSH之后，植物细胞中抗氧化保护酶系统中SOD和CAT的活性有增强的趋势，实验检测到细胞膜过氧化水平降低，这种变化是通过诱导增加内源性的GSH，同时降低MDA含量造成的14。机体内参与GSH合成、利用的酶类是体内主要的抗氧化应激成分。主要包括：-谷氨酸半胱氨酸合成酶(-GCS)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)、谷胱甘肽S转移酶(GSTs)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)及血红素加氧酶(haem oxygenases, Hos)系统。其中GCL作为体内GSH合成的限速酶，它的催化亚基(GCLC)可以通过上调GCL活性从而提高细胞内GSH水平和诱导GSH从头合成15。GST作为一种抗氧化酶，可修复自由基引起的膜磷脂损伤、催化还原反应、抑制微粒体的过氧化反应，从而发挥抗氧化作用。Jaroonwitchawan T等人在研究氧化应激在百草枯暴露后神经细胞死亡的实验中认为：姜黄素可能作为治疗剂来治疗与活性氧(reactive oxygens pecies, ROS)的生产过剩和自噬功能障碍有关的神经退行性疾病16。另有研究认为姜黄素可以减轻细胞内线粒体损伤诱导的氧化应激和炎症细胞因子(iNOS和COX-2)的表达，并且可以抑制ALS疾病过程中由于ROS产生过多诱导的COX-2的表达17,18。此外，姜黄素还可以通过诱导降低细胞内活性氧的含量，增强细胞内GSH水平，从而调节细胞内氧化还原状态对抗细胞凋亡和细胞炎症状态19。以上结果表明，姜黄素可能成为一个潜在有效的手段来治疗神经退行性疾病。由于姜黄素可以通过多种机制靶向产生转录因子、膜受体、激酶和细胞因子来诱导细胞死亡20，我们实验对姜黄素对于细胞的内在影响做了研究，与对照组相比较，采用不同剂量的姜黄素测得的细胞存活率呈现剂量依赖性的降低，为避免对后续实验的影响，我们选取了低浓度(10 M)作为姜黄素处理浓度，且经分光光度法检验经10 M姜黄素预处理4 h后细胞内MDA含量明显降低，GSH水平显著提高。Samarghandian S等人在探讨姜黄素在应激模型中诱导的脑、肝、肾氧化应激损伤的保护作用中测定了以上组织内MDA、GSH、SOD、过氧化氢酶(CAT)的表达水平，结果表明应激明显增加，MDA水平增高，但GSH和SOD的活动水平显著降低，使用姜黄素处理后可以逆转以上结果，提示姜黄素可以防止应激诱导的大鼠的大脑、肝脏和肾脏氧化损伤21,22。本实验中分光光度法结果显示给予10 M姜黄素预处理4 h后改善了直接使用H2O2处理后细胞内的氧化异常，明显降低了细胞内MDA含量，升高了细胞内GSH的浓度，real-time PCR结果显示姜黄素预处理使细胞内GST和GCLC mRNA的表达升高。以上结果提示姜黄素通过增加细胞内抗氧化应激成分的含量和其合成途径来发挥其神经保护作用，为开发防治ALS的药物提供了一定的实验基础。结 论本实验通过使用外源H2O2成功诱导转染hSOD1G93A突变型NSC-34细胞来制作氧化应激模型，结果显示给予10 M H2O2可导致细胞内MDA含量增强，GSH的活力下降。通过给予10 M姜黄素预处理4 h后细胞内氧化应激损伤明显改善，逆转了使用外源H2O2对细胞造成的影响，即显著降低了MDA的含量，升高了细胞内GSH的浓度及其合成酶类GST、GCLC的表达。但是姜黄素缓解细胞氧化应激损伤的分子机制和通路靶点还需要后续实验进一步进行研究。参考文献1 Chi A, Logroscino G, Traynor B J, et al. 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