牡蛎疱疹病毒1型检测技术规范巢式PCR法（定稿）

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB 37/T XXXXXXXXX牡蛎疱疹病毒型检测技术规范巢式PCR法Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCRXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/ XXXXXXXXX目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和缩略语13.1 术语和定义13.2 缩略语14 试剂及仪器14.1 试剂24.2 仪器25 采样35.1 采样对象35.2 采样数量、方法和保存运输35.3 样品的采集36 检测36.1 DNA的提取36.2 巢式PCR操作步骤36.3 电泳及测序47 结果47.1 结果判定47.2 结果表述4附录A （规范性附录） 试剂及配制方法5附录B （资料性附录） 检测目的片段的DNA序列及电泳图7前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC 03)归口。本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。7牡蛎疱疹病毒型检测技术规范巢式PCR法1 范围本标准规定了牡蛎疱疹病毒型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7205.1牡蛎包纳米虫病诊断规程3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1牡蛎疱疹病毒型牡蛎疱疹病毒型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）EB：溴化乙啶（ethidium bromide）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）Taq：水生栖热菌（thermus aquaticus）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTA TrisHCl）Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane）4 试剂及仪器4.1 试剂4.1.1 除非另有说明，实验用水均为GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。4.1.2 无水乙醇：分析纯。4.1.3 TE缓冲液按附录A.1的规定。4.1.4 抽提缓冲液按附录A.2的规定。4.1.5 蛋白酶K按附录A.3的规定。4.1.6 10 mol/L乙酸铵按附录A.4的规定。4.1.7 Tirs饱和酚（pH7.8）：分析纯。4.1.8 4.1.8 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：分析纯。4.1.9 4.1.9 氯仿/异戊醇(24:1)：分析纯。4.1.10 50TAE：见附录A.5，也可以直接购买市售产品。4.1.11 1TAE：见附录A.5。4.1.12 70 %乙醇按附录A.6的规定。4.1.13 dNTP（各2.5 mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5 mmol/L的混合物，-20 保存，用于PCR。4.1.14 10PCR反应缓冲液：见附录A.7，也可以直接购买市售产品。4.1.15 MgCl2 (25 mmol/L)：生化试剂，-20 保存。4.1.16 Taq DNA聚合酶(5 U/L)：生化试剂，-20 保存。4.1.17 外引物CF：5-ATTACCCAGATTCCCCTC-3，-20 保存。4.1.18 外引物CR：5-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3，-20 保存。4.1.19 内引物C3：5-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3，-20 保存。4.1.20 内引物C2：5-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3-20 保存。4.1.21 PCR检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒型感染的贝类组织样品，-80 保存。4.1.22 PCR检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒型感染的贝类组织样品，-80 保存。4.1.23 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。4.1.24 琼脂糖：分析纯。见附录A.8。4.1.25 6Loading Buffer：附录A.9，也可以直接购买市售产品。4.1.26 DNA分子量标准。4.1.27 溴化乙锭（EB）：分析纯，10 mg/mL，见A.10，或其他等效产品。4.2 仪器4.2.1 离心机。4.2.2 PCR仪。4.2.3 电泳仪。4.2.4 水平电泳槽。4.2.5 凝胶成像系统或紫外仪。4.2.6 多功能振荡器。4.2.7 水浴锅或金属浴。4.2.8 -20 普通冰箱。4.2.9 80 超低温冰箱。4.2.10 微波炉电炉或其他加热设备。4.2.11 微量移液器：量程0.5 L1 000 L。5 采样5.1 采样对象牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。5.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合SC/T 7205.1的要求。5.3 样品的采集稚贝（附着后2 mm）和幼贝（2 mm3 cm）取内脏团；成贝（3 cm）取外套膜和斧足。样品采集后分别置于1.5 mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20 。6 检测6.1 DNA的提取6.1.1 取30 mg50 mg组织样品，加入抽提缓冲液500 L，充分研磨，37 温浴1 h。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。6.1.2 加入2.5 L 20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度100 g/mL，混匀后置于50 水浴3 h，不时旋动。6.1.3 将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心3 min分离两相。6.1.4 水相移至新1.5 mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心1 min分离两相。6.1.5 水相移至一新1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混合10 min，于10 000 r/min离心1 min分离两相。6.1.6 水相移至一新1.5 mL离心管中，加入100 L 10 mol/L乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20 )混匀，-20 放置2 h。10 000 r/min离心10 min，弃上清。6.1.7 用70 %乙醇洗涤沉淀2次，每次10 000 r/min离心5 min，倾去上清，沉淀于室温晾干。6.1.8 加入100 L灭菌双蒸水溶解DNA。6.1.9 若DNA样品需要保存，可溶解于100 L TE缓冲液中并保存于-20 。6.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。6.2 巢式PCR操作步骤6.2.1 第一步反应体系及反应扩增程序PCR反应体系如表1所示（25 L反应体系）。阳性样品：牡蛎疱疹病毒型DNA；阴性样品：健康双壳贝类组织DNA；空白对照：超纯水；检测样品：待检测样品组织DNA。PCR反应条件为：94 预变性5 min；94 变性30 sec、46 退火30 sec、72 延伸1 min，32个循环；72 延伸10 min，4 保温。表1 25 L反应体系所加试剂名称浓度体积PCR反应缓冲液10.02.5 L表125 L反应体系所加试剂（续）名称浓度体积dNTPs2.5 mM2.0 LCF25.0M0.5 LCR25.0M0.5 LTaq DNA 聚合酶5.0 U/L0.5 L基因组DNA100.0 ng/L1.0 L超纯水18.0 L合计25.0 L6.2.2 第二步反应体系及反应扩增程序取6.2.1中PCR扩增产物稀释100倍作为模板，以内引物C3、C2为引物进行PCR扩增，反应体系成分同第一步扩增反应。PCR反应条件为：94 预变性5 min；94 变性30 sec、48 退火30 sec、72 延伸35 sec，32个循环；72 延伸10 min，4 保温。6.3 电泳及测序6.3.1 配制1.5 %的琼脂糖凝胶，加入10 mg/mL EB 至终浓度0.5 g/mL，摇匀。制备琼脂糖凝胶。6.3.2 将5 L PCR反应产物与1 L 6载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。6.3.3 在1 V/cm5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2 2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。6.3.4 如果观察到结果阳性，对PCR扩增产物进行测序。7 结果7.1 结果判定阳性对照在657 bp处出现条带，阴性对照在657 bp处不出现条带，空白对照不出现任何条带，判断为本批检测结果可靠（如图1所示）。阳性对照未在657 bp处出现条带，或阴性对照在657 bp处出现条带，判断为本批检测失败，需查找原因，重新取样检测。检测样品在657 bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录B）进行比较，若序列符合可判断待测样品为牡蛎疱疹病毒型PCR阳性；当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，报告结果为阴性。7.2 结果表述阳性结果报告为该贝类样本中存在牡蛎疱疹病毒型DNA。阴性结果报告为该贝类样本中不存在牡蛎疱疹病毒型DNA。AA附录A （规范性附录）试剂及配制方法A.1 TE缓冲液(pH8.0)1 mol/L TrisHCl(pH8.0)10 mL0.5 mol/L EDTA (pH8.0)2 mL加水定容至 1 000 mL高压蒸气灭菌，4 贮存。A.2 抽提缓冲液1 mol/L TrisHCl(pH8.0)1 mL0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL1 mg/mL 胰RNA酶2 mL10 % SDS5 mL加水定容至 100 mL混匀，室温贮存。A.3 20 mg/mL 蛋白酶K蛋白酶K20 mg水 1 mL溶解后分装于无菌离心管中(0.25 mL/管)，20 下保存。A.4 10 mol/L 乙酸铵乙酸铵77 g水30 mL加水定容至100 mL，经0.45 mm滤膜过滤除菌。4 贮存。A.5 50和1 TAE缓冲液50 配制方法：称取242 g Tris碱、37.2 g Na2EDTA2H2O 于锥形瓶中，然后加入800 ml去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1 mL冰醋酸，充分混匀后定容至1 L，室温保存。1 TAE缓冲液：取100 mL 50TAE缓冲液，加900 mL去离子水混匀，室温保存。A.6 70 %乙醇无水乙醇70 mL加水30 mL，混匀，定容至100 mL分装后，室温贮存。A.7 10PCR反应缓冲液10PCR反应缓冲液配制方法：称取Tris-HCl 31.52 mg，置于15 ml塑料离心管中，向离心管中6 ml去离子水，充分搅拌溶解。加入KCl 74.55 mg，加入MgCl2 2.86 mg，充分搅拌溶解，最终用去离子水定容至10 ml，-20 冰箱保存备用。A.8 琼脂糖凝胶在电泳区用1TAE电泳缓冲液配制1.2 %的琼脂糖凝胶，建议于三角烧瓶中配制，在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明(为避免煮沸时液体外溢，胶液体积应少于容器体积的1/4)。待溶液冷却至60 左右，加入10 mg/mL溴化乙锭(EB)(有毒)至终浓度0.5 g/mL，摇匀。将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳和防漏条/套的水平放置的凝胶船，胶液厚度0.6 cm0.8 cm。样孔梳底部水平深入凝胶层约0.3 cm0.5 cm，并距凝胶底部0.2 cm，以免穿透。待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳，去掉防漏条/套，即可用于电泳。A.9 6Loading Buffer6Loading Buffer配制方法：称取溴酚兰25 mg、二甲苯腈蓝FF 25 mg，置于15 ml塑料离心管中，向离心管中6 ml去离子水，充分搅拌溶解。加入3 ml甘油混匀，最终用去离子水定容至10 ml，室温保存。A.10 10 mg/mL 溴化乙锭(EB)贮存液溴化乙锭(EB)10 mg水 1 mL磁力搅拌数小时以确保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中。BB附录B （资料性附录）检测目的片段的DNA序列及电泳图B.1 扩增目的片段的DNA序列Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaagatgaaacaaaatattatgcaacgaggaaattatacgtcaacatacaacatcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaacaggtgtgaagagaaaccaaatgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatctttttctaggatatggagctgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggcaagatgaatggcaagatacacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatctaaaattaaaaacccacatgggggccaaggaatttaaagccccggggaaaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagaatcatacccacactcaatctcgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctttcacagaattttgcaccttgaccaaagccatcacatcagccagcaacgactttttcatcaaccagacgaggttaaca