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09级工技一班 吕满枝 吴伟岸 张日兴,“创新与实践”华南师范大学生命科学学院第七届生物化学实验技能大赛参赛作品,紫苏油的提取及其对 大蒜SOD活性探讨,一、实验题目 紫苏油的提取及其对大蒜SOD活性探讨 二、摘要 本次试验主要通过对紫苏油的提取，通过不同浓度的紫苏油对大蒜SOD活性的影响，得出最适合浓度。对现实生活中大蒜和紫苏混合吃法提供依据，在化妆品添加SOD的方面提供新思路。 三、实验目的 对紫苏油进行提取，并研究其对大蒜SOD活性影响。,四、实验材料及试剂 大蒜细胞SOD酶液，紫苏籽， 正己烷，蒸馏瓶，试管， 碳酸缓冲液0.05mol/L， EDTA溶液0.1mol/L，蒸馏水， 肾上腺素液0.5mol/L， 离心机，分光光度计,五、实验操作步骤 5.1紫苏油的提取 用搅拌机将50 g苏籽研成末状，放入蒸馏 瓶中，加入正己烷100mL,于55恒温，回流1h,过滤、蒸馏可以得到深黄色油状液。,5.2 大蒜细胞SOD的提取 5.2.1 SOD的提取 取30g左右的大蒜蒜瓣，用搅拌机打碎并加入2倍3倍的0.05mol/l pH7.8 的磷酸缓冲液，搅拌10min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后3000r/min离心15min，弃沉淀，得提取液。,5.2.2 除杂蛋白 提取液加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂搅拌15min，3000r/min 离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。 5.2.3 SOD的沉淀分离 将上述酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，3000r/min 离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液中，得到SOD酶液。,5.3 紫苏油对大蒜SOD活性研究 取5根小试管，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5mL的紫苏油，再同时加入0.6mL大蒜细胞 SOD 酶液，充分振荡5min，再静止5min，重复操作30min。待其分层。按下表加入,在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30C水浴中预热5min。加入肾上腺素，然后立刻测定各管480nm的光密度。每30s读一次数，读10min。 结果与计算：SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力（单位）。即： 酶活力（单位）= 2(A对照-A样品)N / A对照 式中：N样品稀释倍数； 2抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数 （100% / 50%） A自氧化速率,实验数据,结果分析,曲线并没有在1min后出现线性相关，而是在30s的时候就达到了最大的吸光值，而且平均持续了3min左右。在平均3min后，光密度开始急速下降，在610min开始平缓下降.,从实验原理来看，肾上腺素在碱性条件下先自氧化释放出O2.-随后生成红色的肾上腺素红(R)这时溶液颜色变成淡红色。肾上腺素红在空气中并不稳定，会进一步氧化成其它化合物，此时溶液的颜色由淡红转为黄色。因此，要求我们测定时间严格控制在初始阶段，在这段时间内，肾上腺素红的积累在滞后一分钟左右后与时间基本成线性关系,问题分析,我们在查阅资料后发现： 影响肾上腺素自氧化因素很多，其中pH、 肾上腺素的浓度、温度尤为重要。 我们认为肾上腺素的浓度过大是导致实验失败的主要原因。,新的改进方法,将pH10.2, 50 mmol/L的Na2CO 3-NaHCO3缓冲液在300. 5水浴中保温20 min，取2. 9mL加入到1 cm比色杯中，然后注入100 uL 1.2 mm