饲料添加剂用黄芩甙提取工艺条件的优化.pdf

第20卷 第3期 2004年5月 农 业 工 程 学 报 T ransactions of the CSA E Vol . 20 No. 3 M ay 2004 饲料添加剂用黄芩甙提取工艺条件的优化 梁 英1, 2,韩鲁佳1,杨宏志2 (1. 中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验室,北京100083; 2.黑龙江八一农垦大学,大庆163319) 摘 要:为了优化饲料添加剂用黄芩甙提取工艺,采用L9 (3 4)正交试验设计方法, 对浸提和酸沉工艺进行了优化试验研究, 采用紫外分光光度法对提取物黄芩甙进行含量测定。结果表明:浸提较优工艺为A3B3C2,即浸提时间1. 5 h,浸提温度 100,浸提pH 7. 0;酸沉较优工艺为A 2B3C1D 3,即保温时间1. 0 h,保温温度80,保温pH 1. 0,静置时间12 h。 经两次正 交试验设计所得优化提取工艺可行,提取率为91. 56% ,含量为94. 12%。 关键词:饲料添加剂;黄芩;黄芩甙;提取工艺;正交试验 中图分类号: S816. 7 文献标识码: A 文章编号: 100226819(2004)0320205204 收稿日期: 2003206225 修订日期: 2004202219 基金项目:国家 “十五” 科技攻关子课题 “植物免疫增强剂研究与开 发” 资助(2002BA 514A2122 3) 作者简介:梁 英,博士生,从事农产品加工与贮藏工程研究。 通讯作者:韩鲁佳,教授,博士生导师,主任,北京海淀区清华东路 17号 中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验 室, 100083。Email: hanljcau. edu. cn 0 引 言 饲料添加剂是饲料工业的核心。渴望健康,回归自 然,呼吁 “绿色” 已成国际潮流。中草药饲料添加剂是饲 料添加剂的一个独特而重要的系列,它具有纯天然、 安 全等特点,符合 “饲料安全” 、 “绿色食品” 的要求。 中药黄 芩是唇形科植物黄芩(S cutellaria baicalensis Georg i) 的干燥根,是一种常用中草药。黄酮类化合物是黄芩的 主要有效成分,且黄芩甙(Baicalin)的含量最高。 体内外 抑菌试验表明,黄芩黄酮对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 绿脓杆菌均具有抑菌作用1, 2。目前所用的中草药饲料 添加剂多为粗制剂,工艺落后,添加量大,适口性差,饲 用效率低,质量难以监控。中草药饲料添加剂必须符合 微量、 高效、 有效成分确切的要求。 有效成分的提取是稳 定中草药饲料添加剂质量及产业化生产的重要措施,探 索较优的饲料添加剂用黄芩甙提取工艺具有重要的现 实意义。黄芩甙的提取多采用水提酸沉法3, 4或碱提酸 沉法5。近年也有采用醇提酸沉法6、 超声波法7和微 波法8。但微波和超声波提取法对设备要求高,增加了 生产成本;传统提取法黄芩甙收率较低,含量也不甚理 想。虽然关于黄芩甙提取工艺优化的研究报道较多,但 以往研究考察的因素主要是浸提时间、 浸提次数和溶剂 倍数,却忽视了黄芩甙具有酸性的性质,没有将pH值 作为主要考察因素。同时,酸沉工艺是影响黄芩甙的最 终得率和纯度的关键环节,但有关黄芩甙酸沉工艺的研 究却很少。本研究旨在充分利用黄芩资源,进一步解决 原有工艺得率低、 纯度差的关键性问题,最终获得既有 高浸提率又有高纯度的最佳优化工艺。 在合理分析和讨 论各影响因素的前提下,确定了合理的因素和水平范 围,应用两次正交试验分别对浸提工艺和酸沉工艺进行 了优化研究,得到了适合于工业化生产,生产成本低,工 艺简化的生产饲料用黄芩甙添加剂的优化工艺。 1 试验材料与方法 1. 1 主要仪器与试剂 1. 1. 1 材料 黄芩,购自海淀医药经营公司。 1. 1. 2 仪器 TU 1800SPC紫外可见分光光度计,北京普析通用 仪器有限责任公司;AB2042E型电子分析天平,瑞士梅 特勒公司。 1. 1. 3 试剂 黄芩甙标准品(中国药品生物制品检定所 ); 乙醇、 氢氧化钠、 盐酸,所用试剂均为分析纯。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 正交试验因素与水平确定的依据 中草药有效成分提取过程的实质是溶质从药材固 体向溶剂中的传质过程。提取过程大致可分为3步:溶 剂向药材内部的渗透和在药材内部的湿润;药材内部溶 质的溶解;溶质在药材内部的扩散和从药材表面向溶液 主体的扩散,其中有效成分的内、 外扩散起主导作用9。 因而影响提取率的主要因素应为浸提时间和浸提温度。 黄芩甙为72葡萄糖醛酸甙, pH值是影响黄芩甙提取率 的又一主要因素。但当溶媒的pH值超过7. 0时,又易 使黄芩甙分子中的 2吡酮环发生分解,温度过高也会 促使黄芩甙发生水解10。又因为黄芩甙分子中羧基易 以成盐的形式存在,在酸沉过程中,加酸后黄芩甙分子 被还原出来。 但这种反应须在较高温度条件下方可顺利 进行,而在低温条件下进行得十分缓慢。 因而,酸沉工艺 中保温温度就十分重要。高温有利于黄芩甙被还原,但 黄芩甙在酸性溶液中,较高温度下长时间作用又可发生 水解。酸性越强,水解程度越大。静置时间过长,杂质随 之增多,含量降低。 基于上述原因,确立了正交试验的因 素和水平。 1. 2. 2 试验设计 试验采用正交设计。浸提试验因素及水平见表1, 酸沉试验因素及水平见表2。 502 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 表1 浸提试验因素及水平 Table 1 Factors and levels of the extraction experi ments 因素 水平 A 浸提时间?h B 浸提温度? C 浸提pH值 10. 5806. 5 21. 0907. 0 31. 51007. 5 表2 酸沉试验因素及水平 Table 2 Factors and levels of the acid deposition experi ments 因素 水平 A 保温时间?h B 保温温度? C 保温pH值 D 静置时间?h 10. 5401. 04 21. 0601. 58 31. 5802. 012 1. 3 黄芩甙的提取分离 称取黄芩粉 (20 目, 60烘干) 10. 00 g,按L9 (3 3) 正交表3安排试验。分别用10倍、8倍溶剂浸提两次, 双层纱布过滤,合并滤液,滤液趁热离心15 m in(1500 r?m in ), 取上清液。在水浴中加热至80,滴加浓盐酸 调pH= 1. 5, 80保温1. 0 h,静置4 h后减压抽滤。沉 淀用蒸馏水洗涤至中性, 60烘干,即得黄芩甙粗品,称 重。 进行黄芩甙的提取,采用综合评分法,其收率与含量 的加权平均值记入综合评判,并以其作为考察指 标5, 11。为了提高统计分析的可靠性,每一条件下都作 了重复试验(n= 2),测定结果取其平均值供统计分析 用。 1. 4 酸沉试验 称取黄芩粉160 g,按上述所得较优提取工艺进行 提取(A3B3C2,即:浸提时间1. 5 h,浸提温度100,溶 媒pH 7. 0)。将上述提取液合并,得滤液2 250mL。将 滤液10等份,每份相当生药16 g。 按L9 (3 4)正交表 4安 排试验。用浓HCl酸化,并加热保温一定时间,然后静 置,减压抽滤,沉淀用蒸馏水洗涤至中性,低温烘干 (60 )。取适量粗品溶解,测黄芩甙含量5。 表3 浸提方案与结果分析 Table 3 Extraction scheme and result analysis 试验 号 A (浸提 时间) B (浸提 温度) C (pH) 各指标试验结果 取样质量 ?g 含量 ?% 色泽 y (提取 率 % ) 11 (0. 5)1 (80)1 (6. 5)0. 806472. 65深黄57. 89 21 (0. 5)2 (90)2 (7. 0)0. 988985. 40红褐83. 45 31 (0. 5)3 (100)3 (7. 5)1. 013781. 92灰黄82. 06 42 (1. 0)1 (80)3 (7. 5)0. 796374. 15红褐58. 34 52 (1. 0)2 (90)1 (6. 5)1. 014580. 22黄色79. 46 62 (1. 0)3 (100)2 (7. 0)0. 992991. 65浅黄89. 92 73 (1. 5)1 (80)2 (7. 0)0. 984291. 71深黄89. 19 83 (1. 5)2 (90)3 (7. 5)0. 810293. 93黄色75. 20 93 (1. 5)3 (100)1 (6. 5)0. 960895. 22浅黄90. 41 K1223. 40205. 42227. 76 K2227. 72238. 11262. 56 K3254. 80262. 39215. 60 k174. 4768. 4775. 92 k275. 9179. 3787. 52 k384. 9387. 4671. 87 Rj10. 4618. 9915. 65 T= 705. 92 y= 78. 44 较优水平A3B3C2 因素主次BCA 注:提取率% =粗品质量含量?10 g黄芩含黄芩甙的量。 表4 酸沉方案与结果分析 Table 4 A cid deposition scheme and results analysis 试验号 A (时间) B (温度) C (pH值) D (静置时间) 各指标试验结果 取样质量?g含量?%色泽 得率 ?% 11 (0. 5)1 (60)1 (1. 0)1 (4)0. 662388. 45深黄3. 66 21 (0. 5)2 (70)2 (1. 5)2 (8)0. 799289. 76深黄4. 49 31 (0. 5)3 (80)3 (2. 0)3 (12)1. 266890. 48灰黄6. 60 42 (1. 0)1 (60)2 (1. 5)3 (12)1. 240793. 58红褐7. 25 52 (1. 0)2 (70)3 (2. 0)1 (4)0. 986291. 31深黄5. 62 62 (1. 0)3 (80)1 (1. 0)2 (8)1. 357795. 21深黄8. 07 73 (1. 5)1 (60)3 (2. 0)2 (8)0. 894194. 44深黄5. 28 83 (1. 5)2 (70)1 (1. 0)3 (12)1. 367996. 59黄色8. 26 93 (1. 5)3 (80)2 (1. 5)1 (4)1. 193997. 75红褐7. 29 K114. 7515. 8919. 9916. 57 K220. 9418. 3719. 0319. 85 K320. 8321. 9617. 5022. 11 k14. 925. 306. 665. 52 k26. 986. 126. 346. 62 k36. 947. 325. 837. 37 Rj2. 062. 020. 831. 85 T= 57. 04 y= 6. 34 较优水平A2B3C1D3 因素主次ABDC 602农业工程学报2004年 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 1. 5 样品中黄芩甙含量测定 1. 5. 1 标准曲线制作 精确称取恒重的黄芩甙标准品5. 0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入50%乙醇约8 mL , 5060水浴加 热使其完全溶解,冷却至室温,再加50%乙醇至刻度, 摇匀。用移液管分别准确移取溶液100、200、300、400、 500、600、700L于25 mL容量瓶中,用50%乙醇定 容,摇匀。用紫外分光光度计在波长为 (278 1) nm处 测定吸光度,以浓度为纵坐标,吸光度为横坐标,绘制标 准曲线。得回归方程为 C= 18. 399A -0. 2146,R 2 = 0. 9983 1. 5. 2 黄芩甙含量测定 精确称取干燥样品5. 0mg,置于10mL容量瓶中, 加入50%乙醇约8 mL , 5060水浴加热使其完全溶 解,冷却至室温,再加50%乙醇至刻度,摇匀。用移液管 准确移取溶液0. 3 mL溶液于25 mL容量瓶中,用 50%乙醇定容,摇匀,测定方法同1. 5. 1,平行测定2 次。 1. 6 黄芩中黄芩甙含量测定 精确称取黄芩粉1. 25 g,置锥形瓶中,加乙醇212 mL ,加热回流1. 5 h,放冷,连同沉淀一并移置 250 mL 容量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀。用干燥滤纸滤过,弃去 初滤液,精密量取续滤液2. 5 mL ,置于25 mL容量瓶 中,加乙醇至刻度,再精密吸取5 mL ,置25 mL容量瓶 中,加乙醇至刻度,摇匀。测定吸光度12。 1. 7 水分含量测定 采用烘干法。 1. 8 验证试验 按所得较优浸提工艺和较优酸沉工艺进行验证试 验。取黄芩粉1. 0 kg进行黄芩甙的提取分离,重复两 次。 2 结果与分析 2. 1 浸提工艺正交试验结果与分析 从正交试验结果可知,在所设水平条件下,提取率 随温度的升高而增大。主要是在较短的浸提时间内,黄 芩甙难以被溶媒充分浸提出来,但随温度的升高,可加 速有效成分的溶出,所以,温度对提取率影响最大。pH 值的影响次之,黄芩甙为7葡萄糖醛酸甙,在偏碱性 溶媒中溶解度增大。但当溶媒的pH值超过7. 0时,易 使黄芩甙分子中的 2吡酮环发生分解,温度过高也会 促使黄芩甙发生水解,所以,pH值不宜过高。浸提时间 影响最小,浸提时间越长,溶质溶出越多。 随浸提温度的 升高,浸提时间的影响变小。 同时由表3可看出, 9号试验提取率高且样品外观 也好。为了验证上述结果的准确性,重复较优浸提工艺 A3B3C2试验,黄芩甙的提取率为91. 02% ,略高于正交 表中提取率,样品呈浅黄色粉末。 2. 2 黄芩中黄芩甙含量及水分含量测定结果 测得黄芩中黄芩甙含量为11. 01% (烘干样品)。符 合药典要求(不小于9. 0% )。未烘干黄芩中黄芩甙含量 为10. 12%。测得水分含量为8. 09%。 2. 3 酸沉工艺正交试验结果与分析 由表4分析可知,相同黄芩甙含量的黄芩水提液, 采用不同的酸沉条件,所得黄芩甙收率相差较大,极差 为4. 41% ,说明黄芩甙在酸沉过程中损失较大。因此, 采用正交试验确定黄芩甙酸沉较优工艺条件是非常必 要的。 正交试验结果显示 ,R A RB RD RC, 4个因素 对得率影响的主次顺序为:保温时间保温温度静置 时间 pH值。保温时间是决定得率的最主要因素,其 次是保温温度和静置时间,影响最小的是pH值。从各 因素的影响水平看,保温时间K2A K3A K1A,说明保 温时间长,可使黄芩甙被充分还原,提高得率。 但在酸性 条件下,保温时间愈长,黄芩甙水解愈多,得率降低。对 于保温温度 , K 3B K2B K1B,温度越高,越有利于黄芩 甙的还原。 因为黄芩甙分子结构中葡萄糖醛酸上的羧基 易以成盐的形式存在,在酸沉过程中,加酸后黄芩甙分 子被还原出来。 但这种反应须在较高温度条件下方可顺 利进行,而在低温条件下进行得十分缓慢。 所以,酸沉工 艺中保温温度就十分重要。从静置时间看 , K 3C K2C K1C,静置时间的延长有利于黄芩甙还原,得率提高。但 静置时间过长,将会有一定量的杂质随之沉降下来,使 含量降低,静置时间12 h较为适宜。在所设计的pH值 范围内, pH值对提取率的影响最小,且各水平之间影 响差异不大。在实际操作中pH值可取1. 01. 5。在水 溶液中,pH值对黄芩甙的稳定性影响较大,最适pH值 为5. 5。黄芩甙在酸性溶液中,较高温度下长时间作用 可发生水解,酸性越强,水解程度越大。在pH值为5. 5 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液中, 50恒温作用24 h, 将会有22. 15%的黄芩甙被水解13,必须将pH值控制 在1. 01. 5。 较优酸沉工艺条件为 :A 2B 3C1D 3,即保温 时间1. 0 h,保温温度80,静置时间12 h,pH= 1. 0。 2. 4 验证试验结果 按两次正交试验设计所得优化提取工艺进行试验, 提取率为91. 56% ,含量为94. 12%。 3 结 论 1) 浸提工艺中,浸提时间1. 5 h,浸提温度100, pH值7. 0时提取率最高,实际操作中为节省能源降低 成本,浸提时间可取1. 0 h。 浸提率可达90. 02%。pH值 控制在7. 0最为适宜。 2) 酸沉工艺中,即保温时间1 h,保温温度80,静 置时间12 h,pH= 1. 0。实际操作中保温pH值控制在 1. 01. 5即可。静置时间过长,含量降低。 总之,采用较优浸提工艺与较优酸沉工艺相结合, 既可提高黄芩甙的得率,又可提高黄芩甙的纯度。工艺 简单可行,成本低,适合工业化生产,产品符合饲料添加 剂的要求,为饲料添加用黄芩甙的生产提供了可行的优 化工艺。 参 考 文 献 702 第3期梁 英等:饲料添加剂用黄芩甙提取工艺条件的优化 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 1 刘云波,郭丽华,邱世翠.黄芩体外抑菌实验研究J .时珍 国医国药, 2002, 13(10): 596. 2 吕小迅,周玉珍,吕华冲.黄精抗真菌作用活性部位实验研 究J .广东医学院学报, 1995, 11(3): 180- 182. 3 阮正国.黄芩苷提取工艺的优选与验证J .中成药研究, 1986, (11): 5. 4 李 展,高微微,林文卫,等均匀设计法优化黄芩提取工艺 J .中草药, 2001, 32(7): 606- 607. 5 胡应权.黄芩甙提取工艺的改进J .深圳中西医结合杂 志, 1999, 9(2): 21- 22. 6 黄祖良,刘胜娟.黄芩苷标准品制备方法研究J .右江民 族学院学报, 2001, 4: 515- 516. 7 郭孝武.超声提取黄芩苷成分的实验研究J .中国现代应 用药学杂志, 1999, 16(3): 8- 16. 8 郭振库,金钦汉,范国强.黄芩中黄芩苷微波提取的实验研 究J .中草药, 2001, 32(11): 985- 987. 9 李有润,郑 青.中草药提取过程的数学模拟与优化J . 中草药, 1997, 28(7): 399- 401. 10 肖宏安.黄芩甙水溶液稳定性考察J .中草药, 1981, 12 (7): 21- 22. 11 胡上达.黄芩提取工艺的优化J .医药导报, 2002, 21(7): 438- 439. 12 韩鲁佳,阎巧娟,江正强,等.黄芩甙提取分离方法及工艺 研究J .农业工程学报, 2000, 16(6): 118- 122. 13 乔金霞.纤维素酶用于萃取黄芩甙及其工艺研究D .沈 阳:沈阳农业大学, 1995, 18. Opti m ization of baicalin extracting technology in Scutellaria baicalensis Georgi Liang Ying 1, 2, Han Lujia 1, Yang Hongzhi 2 (1. K ey L aboratory of M odern P recision A g riculture System Integ ration,M inistry of Education,China A g ricultural U niversity,B eijing100083,China; 2.H eilongjiang A ugust F irst L and R eclam ation U niversity,D aqing163319,China) Abstract:In order to opti m iz