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大肠杆菌、质粒和噬菌体 郑丽舒 中国疾控中心 病毒病预防控制所 2013.04.15,一、大肠杆菌 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆,主 要 内 容,大肠杆菌,大肠杆菌,大肠杆菌一般特征, 属于原核生物，是革兰氏阴性棒状杆菌(红色) 有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜 其染色体是长约30kb的双链环状DNA分子 生长需求非常简单，在仅含碳水化合物和少量氮源及 无机盐的培养基上即可生长 兼性厌氧 长度大约2um，宽0.8um DNA长度约为体长的1000倍,Escherich在1885年发现大肠杆菌，广泛存在于人和温血动物肠道中，44.5发酵乳糖产酸产气。在相当长时间内认为是非致病菌。20世纪中叶，认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，常引起严重腹泻和败血症。 根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌（EPEC）分为4类： 肠产毒性大肠杆菌（ETEC） 肠侵袭性大肠杆菌（EIEC） 肠出血性大肠杆菌（EHEC） 肠黏附性大肠杆菌（EAEC）,大肠杆菌,大肠杆菌在分子生物学实验中的应用,生物工程用菌株优点： 背景清楚：全基因组测序，共有4405个开放阅读框架。由于该菌株遗传背景清楚，并经过一系列突变筛选，使外源DNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于作为基因操作的宿主菌。 生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，这些菌株由于失去细胞壁的重要组分，在自然条件下无法生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也可避免对自然界造成危害。 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。 目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。,大肠杆菌在分子生物学实验中的应用,缺点： 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5非编码区。 原核：CDNA； 真核：DNA 转录信号不同：真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列 细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子 SD序列（Shine-Dalgarnosequence）： mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游 10个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序 列，能与细菌16SrRNA3端识别，帮助 从起始AUG处开始翻译。,大肠杆菌在分子生物学实验中的应用,缺点： mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达产生的蛋白质不能进行糖基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而产生的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。 表达的蛋白质经常是不溶的，在细菌内形成包涵体，当表达的蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形成包涵体。 细菌的蛋白酶：可以识别降解真核生物的蛋白质产物。,加拿大人Frederick Banting和Charles Best于1921年首先发现胰岛素，1922年开始用于临床，1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日，中国科学家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。,应用实例,胰岛素由A、B两个肽链组成。 A链有11种21个氨基酸， B链有15种30个氨基酸， 共51个氨基酸组成。 其中A7-B7、A20-B19四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B链连接起来。 A链中A6与A11之间也存在二硫键。,大肠杆菌的培养与保存,LB培养基是培养大肠杆菌最常用的培养基。其它培养基都是在此基础上有所加减，可参阅有关手册。LB一般被解释为Luria-Bertani培养基，其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)认为这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。 酵母提取物：碳源，能源，磷酸盐 蛋白胨：氮源 氯化钠：无机盐 液体LB培养基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，高压灭菌15磅30分钟。 固体LB培养基：基本同上，加琼脂15克/升。高压灭菌后，冷却至50左右，可根据需要加入适当的抗菌素或其它试剂，混匀后倒入平皿中。 半固体LB培养基：基本同上，只是琼脂浓度为6克/升。高压后室温保存备用。使用前在水浴或微波炉溶化。,常用培养基, 取2-5毫升液体LB培养基，到无菌培养管中； 用接种环从琼脂培养板上挑取单个菌落，接种到培养基中。注意要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中； 盖上盖子，保证通气。37摇床 60rpm，培养过夜; 1:100转种到培养瓶中。通常250ml培养瓶中加培养液不超过100ml。37摇床（250rpm）培养，直至细菌生长到所需密度。,大肠杆菌的培养与保存,大肠杆菌的液体培养, 用接种环蘸取少许细菌培养液，或从固体培养平板的菌落上蘸取少许细菌，从平板的一侧开始划线； 消毒接种环，从刚划过的部位带过并在旁边继续划线； 如上重复34次，直至划满平板。这样可以确保分离出单个菌落。,在固体培养基上培养,大肠杆菌的培养与保存, 在小玻璃瓶或试管中加入三分之二体积的LB半固体培养基； 用接种针从固体培养板上挑取单个菌落，反复刺入琼脂中； 置37培养8-12小时，直至可看到细菌生长呈雾状； 拧紧盖子，置15-22暗处保存。一般可保存数年； 复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到LB平板上。,菌株的保存与复苏,穿刺保存, 取新鲜饱和的或生长到对数生长中期的细菌培养液，加入灭菌的甘油至终浓度15%（或7% DMSO），混合均匀。 分装到冻存管中，保存在-70。如条件所限，亦可保存在-20，但保存时间较短。 复苏时，用接种环从上面刮取少许菌液，注意要避免反复冻融。然后划线到LB平板上。,菌株的保存与复苏,冷冻保存,质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子 不具有胞外期 对寄主细胞来说是非必需的,质粒概述,符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个大写字母和数字，如pBV220，pET30。,质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（L DNA）,质粒概述,L,SC,OC,常见质粒种类： 细菌质粒 真核生物DNA质粒 真核生物RNA质粒,质粒概述,质粒概述,细菌质粒,定义：细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子 (cccDNA)，能 独立于细胞核进行自主复制。 大小：其大小在1-1700 kb之间。携带有数个到数十个甚至上百个基因。 功能：进入宿主菌后，带有一些基因，产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 分类：根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒、共生质粒等类型。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等,细菌质粒功能分类 克隆质粒: 克隆一个基因或DNA片断 表达质粒: 用于一个基因的蛋白表达,细菌质粒性质： 1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；,细菌质粒性质： 2、质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把 质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种； 严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随，一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝； 松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。 pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,严紧型,松弛型,细菌质粒性质： 3、可以通过转化、转导或接合作用(通过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换的过程 )由一个细菌细胞转移到另一个细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞； 质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起转移，所以可成为基因工程的载体。,细菌质粒性质： 4、质粒的不亲合性 定义：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。 分子基础:主要是由于复制功能之间相互干扰造成。 有相似的复制子结构，受到同一拷贝数控制系统的干扰，使两种质粒最终拷贝数不同，拷贝数多的质粒在以后的分裂中更占优势。 ColE1、pMB1; pSC101、F、RP4； p15A,衍生质粒,细菌质粒性质： 5、质粒对于细菌的生长不是必须的,代表性细菌质粒（1）,F因子，又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。 F质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成：（1）转移区（2）复制区（3）重组区 重组区中有4个插入顺序（IS），通过和宿主染色体上的IS同源重组或通过转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。由于宿主染色体上IS方向不同，所以整合的方向也随之不同。,F因子（fertility factor）,根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及其在细胞内存在状态可将细胞分为四种类型： F+ 菌株： F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 F- 菌株： 无F因子，无性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）。 Hfr菌株(高频重组菌株)： F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛 F菌株： Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F。,代表性细菌质粒（1）,代表性细菌质粒（2）：,R因子（resistance），抗药因子，带R因子的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌等G-菌，60-90%的G-菌耐药性由R因子转移。 R因子是细胞质性质粒，具有使寄主菌对链霉素、氯霉素、四环素等抗菌素或磺胺剂产生抗药性的基因群。和F因子一样，通过接合进行转移，获得该因子的细菌获得对多种药剂的抗性，给治疗带来很大麻烦。 R因子为环状双链DNA分子，由相连两个DNA片段组成，即抗性转移因子和抗性决定因子，R因子在细胞内的copy数可从1-2个到几十个，分为严紧型和松弛型，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000-3000个/细胞。,R因子（resistence factor）,代表性细菌质粒（3）：,Col因子，产大肠杆菌素因子，编码合成大肠杆菌素, 通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死不含Col因子的其他肠道细菌。 Col因子可分为两类： ColE1：无接合作用，松弛型多copy；广泛地用于重组DNA研究和体外复制系统。 ColIb：与F因子相似，通过接合作用转移，属于严紧型控制，只有1-2个copy。,Col因子（colicinogenic factor）,真核生物DNA质粒,环状DNA质粒：酵母质粒，植物线粒体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，都是不知其功能的隐蔽质粒。 线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。,真核生物RNA质粒,有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性 无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。,把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,分子生物学实验中常用质粒载体,复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA序列（ori）,也包括复制必需的RNA和蛋白质的编码基因。复制子决定该质粒的复制是严紧型还是松弛型。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 选择标记通常为抗生素耐药基因，如Amp+，Kan+的抗性基因；或产生易于辨认的颜色，如半乳糖苷酶、荧光素酶等的基因。 多克隆位点是含有多个内切酶识别位点的一段DNA序列，便于外源DNA片段的插入，而且不会影响质粒本身的稳定。,按功能分成： （1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。 （2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（如ori，Ampr，Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 在大肠杆菌生产外源蛋白的表达载体要含有适当的原核启动子，转录终止信号。 在真核细胞生产外源蛋白的表达载体除含有适当的真核启动子，转录终止信号外，还应含有内含子剪切序列和polyA加尾信号。,载体分类,载体分类,按进入受体细胞类型分： （1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体（shuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，要含有不同系统可识别的复制起点，因而可以运载目的基因。,质粒载体的选择,构建重组DNA的目的： 克隆扩增：选择合适的克隆载体pGEM-T, pBluescript 蛋白表达：原核细胞表达载体如pBV220, pET等； 真核细胞表达载体pcDNA3, pSV2等。 研究基因功能：overexpression, knock down, knock out 基因治疗：逆转录病毒载体，腺病毒载体 载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力：理想的克隆质粒本身要尽可能小，这样转化效率较 高，同时质粒的容量较大，可以插入较大的DNA片段。 （2）表达载体据受体细胞类型：原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 注意事项： 载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，目的基因与载体应易于连接，不产生阅读框架错位。,质粒载体的选择,选用质粒做载体的4点要求： 选分子量小的质粒，小载体不易损坏，在细菌里拷贝数多； 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束； 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。,常见质粒1：pBR322,优点： 1、具有较小的分子量； 分子量为4363bp，克隆载体的分子量大小不要超过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 共有24种核酸内切酶单一酶切识别位点。 其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000-3000个拷贝（氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成,阻止细胞染色体复制,而质粒本身复制不受影响,增加质粒的拷贝数）。,“P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。,Example: 在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌。 涂布在含青霉素的选择培养基上，可生长 涂布于含四环素的选择培养基上，不能生长。,常见质粒2：pGEM-T,蓝白斑筛选原理： 载体带有LacZ基因的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽 宿主编码的-半乳糖苷酶C端 当这种载体转入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然各自都没有酶活性，但它们可融为一体形成具有酶活性的蛋白质，称这种现象为-互补。 由-互补产生-半乳糖苷酶可使底物X-Gal产生蓝色菌落，因而易于识别。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致无-互补能力的N端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。,-互补, 互补的检测,PUC18/19由pBR322和M13噬菌体改造,常用表达质粒：,质粒DNA的分离与纯化 1、氯化铯密度梯度离心法 2、碱变性法 3、微量碱变性法,1.氯化铯密度梯度离心法原理 质粒DNA占总DNA的1%2%； 在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低（完整的质粒DNA结合EB少，密度大）。,离心流程 离心收集菌体，加入溶菌酶或SDS，促进大肠杆菌细胞裂解，离心收集含质粒DNA的上清。 将EB的CsCl溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中。 在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。,2.碱变性法原理： 原理：cccDNA与线性染色体DNA片断之间，拓扑学上存在差异 在pH12.012.5范围内： 线性的DNA双螺旋结构解开而被变性；共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 恢复pH值中性时： 共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，恢复原来构型，保持可溶性状态。 线性染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。 通过离心，去除线性染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。,挑取单个菌落接种到5ml含适当抗菌素的LB培养基中， 37摇床培养过夜。 取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm离心1min，弃上清， 沉淀悬浮于150l溶液（500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0）冰浴5分钟；此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。 加入新配置的200l溶液（0.2mol/L NaOH，1%SDS），混匀，冰浴10分钟。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 加入 150l 溶液（ 3mol/L乙酸钾，pH4.8），冰浴5分钟；碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。 12000rpm离心3分钟，转移上清至新的离心管； 加入等体积酚/氯仿抽提一次；转移上层水相至新的离心管； 等体积氯仿抽提一次。 取上清，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20沉淀30分钟； 12000rpm离心5分钟。 70%乙醇洗涤沉淀一次； 干燥后加入50l含RNA酶（20ug/ml）的TE（10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，pH 8.0），37水浴30分钟。-20保存备用。,质粒的小量提取,碱裂解法,自Qiagen公司推出快速小量提取质粒DNA试剂盒以来，很多公司都开发出类似产品，其原理及实验步骤大同小异。具体步骤如下(天为时代)： 挑取单菌落接种于5ml含适当抗菌素的LB培养基中，37振荡培养过夜； 取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，13000rpm离心1min，弃上清，加入250ul S1 Buffer,最大速度旋涡震荡； 加入250ul S2 Buffer，轻轻颠倒混匀4-6次； 加入350ul S3 Buffer，立即迅速颠倒混匀，可见白色絮状沉淀； 将上清加入纯化柱中，5000rpm离心10min； 弃去收集管中液体，加入500ul除蛋白液PD Buffer，13000rpm离心1min； 弃去收集管中液体；加入700ul PE Buffer，13000rpm离心1min； 弃去收集管中液体；加入500ul PE Buffer，13000rpm离心1min； 弃去收集管中液体；13000rpm离心3min，以彻底去除乙醇； 将柱子放到一只干净的1.5ml Eppendorf管中，加入50l ddH2O； 静止放置2min, 13000rpm 离心1min,收集离心液，-20保存。,质粒的小量提取,碱裂解法（试剂盒）,挑取单菌落接种5毫升含适当抗菌素的LB培养基中，37震荡培养过夜。 将培养物转接200ml含同样抗菌素的LB培养基中，37剧烈振荡培养12-16小时，细菌密度(OD600nm)达到1.0； 5000rpm离心15分钟，弃上清； 重悬细菌于100ml冰预冷STE （0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0）。 5000rpm离心15分钟，弃上清； 加10ml溶液1（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0）重悬，混匀，冰浴10分钟； 加入20ml新配置的溶液2（0.2mol/L NaOH,1%SDS），混匀，冰浴10分钟； 加入15ml预冷的溶液3（3.0mol/L KCl，pH 4.8），混匀，冰浴10分钟； 10000rpm离心15分钟，弃沉淀； 加入等体积的预冷异丙醇，混匀，-20沉淀1小时； 10000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥； 用3 ml TE（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0）溶解沉淀； 加入3 ml冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，10000rpm离心15分钟，弃沉淀； 上清中加入等体积冰预冷的异丙醇，充分混匀，10000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥； 500l含RNA酶（20ug/ml）TE（10mmol/L EDTA，pH8.0）溶解沉淀，转移到Eppendorf管中，室温放置30分钟； 加入500l含13%聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混匀，-20沉淀2小时； 于台式离心机上12000rpm离心10分钟，弃上清； 加入400l TE（pH8.0）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次； 转移水相至新的Eppendorf管，加100l 10M 乙酸铵，充分混匀； 加2倍体积无水乙醇，-20沉淀1小时； 12000rpm离心10分。用冰预冷的70%乙醇洗涤沉淀一次，晾干； 50l TE（pH 8.0）溶解沉淀，储存于-20冰箱。,质粒的大量提取,聚乙二醇沉淀法,分子克隆步骤,转化及感受态细胞, 目前常用的原核细胞转化方法有两类： 电穿孔转化法、化学转化法 电穿孔转化法属于物理方法，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。 化学转化法原理：利用低温（0）和CaCl2低渗溶液的处理，使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence cell）。此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。DNA与Ca2+形成的羟基-磷酸钙复合物黏附于菌体表面，42短暂热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞，在营养丰富的培养基上生长1小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。,挑取单菌落，接种无抗菌素的LB培养基，37摇床培养过夜。 次日按1：100转种新鲜LB培养基，继续摇床培养2小时左右，至菌液OD 600nm值为0.4-0.6时停止培养。 置冰上预冷10分钟，然后4、5000rpm离心10分钟，弃上清； 以10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟； 4、5000rpm离心10min，弃上清； 按每50ml培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15%体积灭菌甘油，混匀，然后分装于Eppendorf管中，-70低温冰箱中保存。,感受态宿主菌的制备,氯化钙法,1前夜接种受体菌（DH5、DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜； 2取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6； 3将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 54下3000g冷冻离心5分钟； 6弃去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 74下3000g冷冻离心5分钟 8弃去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 94下3000g冷冻离心5分钟 10加入20l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11立即使用或迅速置于-70C超低温保存。,感受态宿主菌的制备,电转化法,感受态宿主菌的制备,注意事项,1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml）； 2 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；,转化（transformation）, 重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。 宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。 原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。 在基因克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。,转化的方法,化学的方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。, 取100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，加入适量质粒DNA。 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DNA-Ca2+吸附于细胞表面；（3）防止DNAase降解DNA，于42水浴中保温1-2min使细胞摄入吸附于其表面的DNA，然后迅速冰上冷却2min。立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约60min，使受体菌恢复正常生长状态。 各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀。 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。,转化步骤,转化结果分析,噬菌体,噬菌体概述,噬菌体概述,结构：无尾部结构的二十面体型 具尾部结构的二十面体型 线状体型 核酸类型：双链线性DNA 双链环形DNA 单链环形DNA 单链线形DNA 双链RNA 单链RNA,分子量： 不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的 大分子量的噬菌体生命周期比较复杂，对寄主的依赖性较低 碱基组成： 有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的 T4噬菌体DNA没有C，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC） SP01噬菌体DNA中没有T，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）,噬菌体概述,噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还可保护自己的核苷酸分子（DNA/RNA）免遭环境化学物质的破坏,噬菌体:基因组,一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12nt 5-突起，称为cos位点，被编码的末端酶所识别，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。 46个基因，分为四类： 调控基因：C、N、CI、Cro、C，决定进入溶源化或裂解状态 DNA复制：O、P、Q 重组：int、xis、red和gam 噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S & R （细胞裂解）、中部约1/3的DNA(b2)与存活无关。,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb), phage,12bp,溶菌阶段 (复制和释放),噬菌体溶源阶段,溶源性（lysogeny）：噬菌体在大肠杆菌体内可以呈环行分子存在于细胞质中，也可通过整合酶的作用而整合到寄主染色体上成为原噬菌体状态，并与寄主染色体一起复制并随细菌的分裂而传代，这种现象称为噬菌体的溶源性。 只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。,在某种刺激下会从宿主DNA中剪接出来，利用宿主细胞内的酶系和蛋白进行自我复制，产生许多子代噬菌体，裂解并从宿主细胞中释放的过程称裂解性循环。,噬菌体基因组中部约占全长三分之一的区域是噬菌体复制的非必需区，外源DNA替代这一区域不会影响噬菌体的复制。用作克隆载体的噬菌体的衍生物包含有非必需区两侧的限制性内切酶识别位点。,噬菌体载体,Lytic phase (Replicate and release),Lysogenic phase (integrate into host genome),外源DNA插入载体DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，后者可感染宿主菌并大量复制。 噬菌体载体的优点：克隆容量大，可插入较大片段。包装后的噬菌体就是具有感染性的完整病毒颗粒，感染效率非常高。 噬菌体包装时对基因组的大小有一定限制，头部只能容纳自身DNA的78-105%，即39-52.5 Kb。天然仅可插入3Kb外源DNA片段，除去所有与裂解无关的基因和空白区，最大可插入22Kb。因而要根据目的DNA片段的大小选择不同的噬菌体载体。,噬菌体载体,噬菌体载体的主要类型 1.插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的载体。 2.替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。,插入式载体 cI基因插入失活：如gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。 若不插入外源基因 溶源 混浊斑 若CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9,EcoR I,Charon 16A,插入式载体 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体感染和复制非必要的片段(小于20kb) 高感染效率(109转化株/ug载体DNA, 比质粒高100倍),替换型载体（取代型载体）,替换型载体克隆外源DNA的步骤 1.应用适当的核酸内切酶消化载体， 除去可取代的DNA片段； 2.将上述所得的DNA载体臂同外源 DNA片段的连接； 3.对重组体的DNA分子进行包装和增殖， 以得到有感染性的重组噬菌体,体外包装 噬菌体DNA体外重组后，先要在体外包装成噬菌体颗粒，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入细胞内。 体外包装需要用包装提取物，即噬菌体感染大肠杆菌的溶菌液。这种溶菌液含有噬菌体的空壳（头部），未吸附的尾部，和包装所需的噬菌体编码的蛋白质。通过cos位点相连成多聚体的DNA逐渐进入噬菌体头部，并在cos位点处切开。然后噬菌体的尾部吸附到已填满的头部，从而完成了一个病毒颗粒的装配。 以感染方式导入细胞的频率可达106-108/gDNA，而以转染方式导入的频率仅为103-105/gDNA。 噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%-105%。,噬菌体的空斑试验 培养基 肉汤培养基：每升含胰蛋白胨10克，氯化钠2.5克，高压灭菌15磅30分钟； 肉汤平板：基本同上，每升加琼脂10克； 顶层培养基：基本同上，每升加琼脂7克。高压后室温保存备用。使用前在水浴或微波炉溶化，然后冷却至45-50，并维持在该温度，可保持溶化状态。,噬菌体的空斑试验 步骤 1、在含2%麦芽糖和10mmol/L硫酸镁的肉汤培养基中培养大肠杆菌至饱和。在微波炉或沸水浴中溶化顶层琼脂培养基，然后冷却并维持在45-50水浴。 2、取5个小试管，每管加入0.3毫升大肠杆菌培养液。将噬菌体溶菌液在肉汤培养基中1：1000连续稀释，然后每个稀释度取0.1毫升分别加到含0.3毫升大肠杆菌的试管中，与大肠杆菌培养液混匀，在室温孵育20分钟。 3、将上述试管移到37水浴中保温10分钟。 4、每管中加入2.5毫升顶层培养基，轻摇混合，然后小心地倒在肉汤平板上。轻轻地倾斜平板使顶层琼脂均匀地铺到整个平板。整个过程要避免产生气泡。 5、置37孵箱培养。一般6-8小时即可看到噬斑，12小时后即可清楚地计数和挑选噬斑。,噬菌体的空斑试验 制备噬菌体裂解液 1、可用毛细吸管或牙签从上述噬菌体平板上挑取单个噬斑，置0.4毫升肉汤培养基中，放振荡器上剧烈振荡以释放出噬菌体； 2、取0.1毫升噬菌体，与0.1毫升过夜培养的大肠杆菌培养液和0.1毫升钙镁溶液（10mmol/L MgCl2, 10mmol/L CaCl2）混合，置37水浴孵育15分钟。然后转移到50毫升NZC肉汤培养基（每升含NZ胺A 10克，氯化钠 5克，MgCl2.6H2O 2克），置37摇床培养。一般6-8小时会出现裂解，一旦培养液变清亮，就立即收获。 3、加几滴氯仿裂解仍存在的菌体。将裂解液转移到离心管内，于4离心10,000 r/min (12000g)10分钟以去除细胞碎片。将上清转移到干净管中，加几滴氯仿，混匀后放4保存。,噬菌体的空斑试验 提取噬菌体DNA 酚/氯仿抽提 1、加等体积的饱和酚至噬菌体液中，温和地搅拌或振摇20分钟。离心5000r/min 10分钟。将上清移到新的管中，再加等体积饱和酚混合。共抽提三次。 2、加入1/10 体积的5mol/L NaCl，2倍体积的无水乙醇（或0.6体积的异丙醇），室温放置20分钟。 3、离心1,500 g 15分钟，弃上清。将沉淀用70%乙醇洗1-2次。低温干燥。 4、重溶于TE缓冲液中。 甲酰胺抽提（更快捷温和） 1、加1/10体积的2mol/L Tris.Cl (pH 8.5)/0.2 mol/L EDTA, 混匀后加入等体积的甲酰胺，混匀，室温放置30分钟。 2、加两倍体积的无水乙醇。室温放置20分钟。 3、离心1,500g 15分钟，弃上清。将沉淀用70%乙醇洗1-2次。低温干燥。 4、重溶于TE缓冲液中。,M13噬菌体载体 M13是一种含ssDNA的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb，90% 以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和以及基因和之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。DNA为正链，按基因至方向合成。 M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白（，和），形态发生蛋白（，和），结构蛋白（、 和 ）。,M13单链DNA噬菌体的生命周期,成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。,RF DNA,感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链复制型，可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。,M13载体 这类载体主要用来获得大量的单链片段，主要用来测序（sanger双脱氧法）、基因的定点突变、异源双链DNA的分析等。 具有MCS，方便克隆。许多M13载体的MCS与质粒载体pUC序列的MCS相同，在克隆位点选择上更为方便。 M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的的方法就是定向克隆技术。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。,M13载体系列的优点 这类载体基因组中有一条饰变的LacZ片段，插入了一段密集MCS；M13载体系列应用基因工程技术成对地构建，可有效克隆双链DNA分子中每一条链。,单链DNA噬菌体载体 M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，以双链环形的DNA为媒介，这种复制形式的DNA简称RFDNA； 2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的制约的，不存在包装限制问题，这一点正好与噬菌体相反。 4.容易测定外源DNA片断的插入取向； 5.可产生含外源片断的单链DNA分子。 缺点： 1.插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降； 2.实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。,载体的种类和特征,重组DN