纤维素酶法提取山药多糖的工艺研究.pdf

2 0 0 8年第6期 收稿日期:2 0 0 8 - 0 4 - 1 7 作者简介:费玉婷 (1 9 8 6 -),女,浙江人,学士,研究方向:功能食品检测。 *为通讯作者:蒋立勤 (1 9 6 8 -),女,上海人,博士,讲师,研究方向:功能食品研究与加工。 E - m a i l:j i a n g z j t c m . n e t。 第6期(总第1 3 9期)农产品加工学刊N o . 6 2 0 0 8年6月A c a d e m i c P e r i o d i c a l o f F a r mP r o d u c t s P r o c e s s i n gJ u n . 文章编号:1 6 7 1 - 9 6 4 6 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 0 3 1 - 0 3 山药 1 为薯蓣科多年生宿根蔓草植物,山药的块 根又名白苕、土薯、大薯、薯药,具有补脾、益肺、 固肾、益精的作用,首见于 神农本草经,被列为 上品,言其“主伤中补虚赢,除寒热邪气,补中益气 力,长肌肉。久服耳目聪明,轻身不饥延年” 2 。山 药为多年生缠绕草质藤本,药用部分主要是根茎,主 要分布于热带和亚热带地区。全世界有山药品种约 6 0 0种,而我国有9 3种。近年研究发现,山药多糖 具有许多保健功能,如降血糖 3 、抗突变 4 、抗氧 化 5 、增强免疫 6 ,1 1,1 5 等,因此人们研究开发了许多 以山药为主要成分的保健食品,如山药菠萝复合饮 料 7 、山药莲藕饼干 8 、山药果脯 9 等。 植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素和果 胶质,纤维素酶可作用于细胞壁,通过分解纤维素和 木质素等,促进植物细胞内多糖成分的溶出,从而达 到便于提取的目的,纤维素酶已逐渐应用于多糖提取 的研究 1 6 。 傅博强等人用纤维素酶提取茶多糖 1 0 ,相对于水 提法,多糖的提取率增加了6 3 . 3 %,而且采用酶法提 取的茶多糖具有较强抑制-淀粉酶活力、防止多 糖有效成分分解的作用。 本文选用纤维素酶进行山药多糖的提取,通过正 交实验研究纤维素酶的作用时间、p H值、酶用量和 温度对山药多糖提取率的影响,得到了提取山药多糖 的最佳条件。 1材料与仪器 1 . 1材料 山药,购于杭州市滨江区浦沿镇集贸市场,将其 洗净、切碎、烘干、粉碎备用;纤维素酶,酶活 1 00 0 0U / g,肇东国科北方酶制剂有限公司提供;苯 酚、H2S O4、无水乙醇、葡萄糖,均为分析纯。 1 . 2仪器 S 2 2 p c型可见分光光度计,上海棱光技术有限公 司提供;D K S1 6型电热恒温水浴锅,嘉兴市中新 医疗仪器有限公司提供;电子天平。 纤维素酶法提取山药多糖的工艺研究 费玉婷,乔建卫,*蒋立勤 (浙江中医药大学 药学院 食品科学与工程,浙江 杭州3 1 0 0 5 3) 摘要:优选并确立纤维素酶法提取山药多糖的最佳工艺。在单因素试验的基础上,采取正交试验,以山药多糖含量 为指标,对影响多糖提取的4个因素 (酶用量、温度、时间和p H值) 进行优化研究。结果显示,提取温度是影响山 药多糖提取率最重要的因素,其次是酶用量和p H值,在实验范围内,酶提取时间对实验结果的影响较小。纤维素酶 法提取山药多糖的最佳参数为:酶用量为0 . 2 %,提取温度为5 5,提取时间为3h,p H值为7 . 0。 关键词:山药;多糖;纤维素酶;提取 中图分类号:Q 5 5 6;Q 5 3 9 文献标志码:A T h e S t u d y o nE x t r a c t P o l y s a c c h a r i d e f r o mY a mR o o t b y C e l l u l o s e E n z y m e F e i Y u t i n g,Q i a o J i a n w e i,*J i a n g L i q i n (D e p a r t m e n t o f P h a r m a c y,Z h e j i a n g C h i n e s e M e d i c a l U n i v e r s i t y,H a n g z h o u,Z h e j i a n g 3 1 0 0 5 3,C h i n a) A b s t r a c t:T h e p u r p o s e o f t h i s p a p e r w a s s t u d i e dt h e t e c h n o l o g y o f e x t r a c t i n g p o l y s a c c h a r i d e f r o mC h i n e s e y a mr o o t b y c e l l u l o s e e n z y m e . O nt h eb a s eo f s i n g l et e s t f a c t o r s,w es t u d i e dt h ef a c t o r sa f f e c t e dt h ee x t r a c t i n gp o l y s a c c h a r i d eb yu s i n go r t h o g o n a l m e t h o d,t h e f a c t o r s i n c l u d i n g t h e a m o u n t o f e n z y m e,t e m p e r a t u r e , e x t r a c t i n g t i m e,a n dp H . T h e r e s u l t s h o w e dt h a t t e m p e r a - t u r ew a s t h em o s t i m p o r t a n t f a c t o r a f f e c t e dt h er e s u l t,f o l l o w i n gw i t ht h ea m o u n t o f e n z y m ea n dp H . T h ee f f e c t o f e x t r a c t i n g t i m e w a s n o t o b v i o u s i no u r s t u d y . T h e o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r e x t r a c t p o l y s a c c h a r i d e w e r e 0 . 2 %c e l l u l o s e e n z y m e,5 5,p H 7 . 0a n de x t r a c t e d3h . K e y w o r d s:C h i n e s e y a mr o o t;p o l y s a c c h a r i d e;c e l l u l o s e e n z y m e;e x t r a c t i o n 农产品加工学刊2 0 0 8年第6期 2实验方法 2 . 1山药粗多糖的提取与精制 2 . 1 . 1山药多糖的提取 精确称取1 0g制备好的山药粉末,用体积分数 为8 0 %的乙醇回流1h,经抽滤得滤渣。将滤渣按料 液比为1 2 0加入蒸馏水 1 2 ,调节p H值,加入纤维 素酶,在一定反应温度下,经过一定反应时间后,进 行提取;抽滤得滤液,并在温度6 0的水浴锅中浓 缩至1 0m L左右,向浓缩液中加入无水乙醇 (溶液 中乙醇体积分数超过8 0 %) 醇沉,静置过夜,将抽 滤的残渣烘干,即得粗多糖。 2 . 1 . 2山药多糖的精制 将山药粗多糖用热水复溶,用S e v a g e法除蛋白, 反复操作3次,置于容量瓶中,用蒸馏水定容至 2 5 0m L,测其吸光度。 2 . 2单因素实验 纤维素酶的作用时间分别采用1,2,3h;作用 的p H值分别采用5 . 0,6 . 0,7 . 0,8 . 0;纤维素酶用量 分别采用0 . 1 %,0 . 2 %,0 . 3 %,0 . 4 %;温度分别采用 4 5,5 0,5 5,6 0,进行单因素实验。研究这4个 因素对山药多糖提取率的影响。 2 . 3正交实验 在单因素实验的基础上,进行L 9( 3 4 )正交实验, 确定提取山药多糖的最佳工艺参数。正交实验因素与 水平设计见表1。 2 . 4多糖含量的测定 采用苯酚硫酸法测定多糖含量 1 3 ,1 4 。 2 . 4 . 1标准曲线的制备 吸取1 0 0 g / m L葡萄糖标准液 0 . 5,1,2,3,4,5,6m L,分别置于1 0m L容量瓶 中,稀释至刻度,摇匀待用。在上述7个容量瓶中, 各精确吸取2 . 0m L分置于具塞试管中,再加质量分 数为5 %的苯 酚 液1 . 0m L, 摇 匀 , 迅 速 加 浓 硫 酸 5 . 0m L, 摇 匀 后 放 置5m i n, 置 沸 水 浴 锅 中 加 热 1 5m i n,取出迅速冷却至室温。另以蒸馏水2 . 0m L, 加苯酚和硫酸,同上操作做空白对照,在最大吸收波 长 (4 9 0n m) 处测定吸光度值。以葡萄糖质量浓度 为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得回 归方程为: Y = 1 . 3 3 6X - 0 . 0 0 37 9,R 2 = 0 . 9 9 96 . 2 . 4 . 2山药多糖含量的测定 精确吸取山药多糖样液2 . 0m L,置于具塞试管 中,加质量分数为5 %的苯酚液1 . 0m L,摇匀,迅速 加浓硫酸5 . 0m L,摇匀后放置5m i n,置沸水浴中加 热1 5m i n,取出迅速冷却至室温。以蒸馏水作空白 对照,在4 9 0n m处测定吸光度值,根据标准曲线得 出多糖含量。 3结果与讨论 3 . 1山药多糖提取的单因素实验 3 . 1 . 1温度对山药多糖得率的影响 酶解p H值为7 . 0,料液质量比为1 2 0,加酶量 为0 . 1 %,于4 5,5 0,5 5,6 0下分别酶解2h,温 度对多糖得率的影响见图1。 由图1可知,随着温度的升高,多糖得率也随之 升高,当温度超过最适温度5 5,得率反而随之下 降。因为当温度升高,活化分子数增多,酶促反应速 度加快,但由于酶是蛋白质,当温度升高直至超过最 适温度,使酶逐步变性,导致酶活力的减少或失去, 从而影响酶对山药的水解效果,不利于多糖的提取, 使得率随着温度的升高迅速下降。因此,纤维素酶水 解的最适温度为5 5。 3 . 1 . 2 p H值对山药多糖得率的影响 料液比为1 2 0,加酶量为0 . 1 %,选择p H值 5 . 0,6 . 0,7 . 0,8 . 0,在温度为5 5的水浴锅中分别 酶解2h,p H值对多糖得率的影响见图2。 由图2可知,多糖得率随p H值的增加而增加, 而高于最适p H值之后随之降低。过高或过低的 表1正交实验因素与水平设计 水平 A酶用量 / % B提取温度 / C提取时间 t / h Dp H值 1 2 3 0 . 1 0 . 2 0 . 3 5 0 5 5 6 0 1 2 3 5 6 7 图1温度对多糖得率的影响 图2 p H值对多糖得率的影响 3 2 2 0 0 8年第6期 p H值会影响酶蛋白构相,使酶本身变性或失活; p H值会影响酶分子侧链上极性基团的解离,改变它 们的带电状态,使酶活性中心的结构发生变化,从而 影响酶活力;p H值还会影响底物分子的解离,从而 影响酶反应速度。所以纤维素酶的最适p H值为7 . 0。 3 . 1 . 3提取时间对山药多糖得率的影响 酶解p H值为7 . 0,料液比为1 2 0,加酶量为 0 . 1 %,于温度5 5水浴下分别酶解1,2,3h,提 取时间对多糖得率的影响见图3。 由图3可知,随着提取时间的延长,多糖得率也 随之升高。反应时间越长,酶解程度越高,从而促进 山药多糖的溶出和提取,本次实验最适提取时间为 3h。 3 . 1 . 4加酶量对山药多糖得率的影响 酶解p H值为7 . 0,料液比为1 2 0,加酶量分别 为0 . 1 %,0 . 2 %,0 . 3 %,0 . 4 %,在温度5 5水浴中 酶解2h,加酶量对多糖得率的影响见图4。 由图4可知,当加酶量为0 . 1 % 0 . 2 %时,多糖得 率迅速增加,继续增大加酶量时,多糖得率的上升趋 势平缓。由此可见,酶的添加量会直接影响多糖的得 率。原因在于,在保持体系中其他成分不变的条件 下,随着加酶量的增加,纤维素酶与纤维素分子的接 触机会增加,在同一时间内,细胞壁中的纤维素水解 速度提高,致使多糖更快地分离出来;达到最大值 后,随着加酶量的增加,底物被酶分子所饱和,纤维 素被水解的速度趋于稳定,致使多糖得率也趋于稳 定。因此,加酶量以0 . 2 %最合适。 3 . 2正交实验结果 在单因素实验的基础上,进行L 9( 3 4 )正交实验, 正交实验结果见表2。 由表2极差分析表明,R值越大,对多糖得率的 影响越大。纤维素酶的提取温度B是影响山药多糖 得率的最重要因素,其次是酶用量和p H值,在实验 范围内,酶提取时间对实验结果的影响较小。最佳的 因素组合为:酶用量为0 . 2 %,提取温度为5 5,提 取时间为3h,p H值为7 . 0。 4结论 (1) 通过单因素实验和L 9( 3 4 )正交实验,研究酶 用量、提取时间、提取温度以及p H值对山药粗多糖 得率的影响。实验的结果表明,提取温度是最重要的 影响因素,提取的最佳工艺条件为:酶用量为0 . 2 %, 提取温度为5 5,提取时间为3h,p H值为7 . 0, 在此条件下,山药多糖的得率提高了3 5 . 6 6 %。 (2) 纤维素酶能提高山药多糖的提取率,可缩短 提取时间。 (3) 曾经有学者报道,酶解法提取使所得多糖的 活性作用增强,因此可以进一步研究采用纤维素酶提 取山药多糖的活性。 参考文献: 熊平,蒋灵芝,余俊龙.山药多糖研究述评 J .中医药 学刊,2 0 0 3,2 1(1 1):18 4 7 - 18 4 8 . 乔善义,王立岩,赵毅民,等.山药多糖的提取分离和 结构测定 J .中国天然采购,2 0 0 3,1(3):1 5 5 - 1 5 7 . 胡国强,杨保华,张忠泉.山药多糖对大鼠血糖及胰岛 释放的影响 J .山东中医杂志,2 0 0 4,2 3(4):2 3 0 - 2 3 1 . 阐建全,王雅茜,陈宗道,等.山药活性多糖抗突变作用 的体外实验研究 J .营养学报,2 0 0 1,2 3(1) :7 6 - 7 8 . 表2正交实验结果 实验号ABCD 多糖得率 / % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 4 . 3 7 6 . 7 3 6 . 0 4 5 . 9 2 8 . 1 0 6 . 2 5 5 . 8 2 8 . 0 6 6 . 1 4 K1 K2 K3 5 . 7 1 3 6 . 7 5 7 6 . 6 7 3 5 . 3 7 0 7 . 6 3 0 6 . 1 4 3 6 . 2 2 7 6 . 2 6 3 6 . 6 5 3 6 . 2 0 3 6 . 2 6 7 6 . 6 7 3 R1 . 0 4 42 . 2 6 00 . 4 2 60 . 4 7 0 图3提取时间对多糖得率的影响 图4加酶量对多糖得率的影响 1 2 3 4 ( 下转第6 2 页 ) 费玉婷,等:纤维素酶法提取山药多糖的工艺研究3 3 农产品加工学刊2 0 0 8年第6期 在综合前面单因素试验的基础上,考虑试验条 件,选择提取时间、提取温度和固液比作为影响因 素,指标仍为甘露醇提取量,进行正交试验,正交试 验因素与水平设计见表1,正交试验结果见表2。 由表2可知,固液比对甘露醇提取量的影响最显 著,提取温度次之,提取时间最小。综合试验结果得 出,影响海带甘露醇提取量的因素主次顺序为固 液比提取温度提取时间。最佳参数组合为:提 取温度为2 5,固液比为1 5 0(g m L),提取时 间为3h。这种最佳组合与实际试验中的2号试验的 水平组合相同,理论分析得出的最佳水平组合与实际 得到的最优水平组合是一致的,无需做验证试验,在 此最佳参数组合条件下,海带甘露醇的提取量为 2 . 3 6 %。 4结论 (1) 提取温度、提取时间和固液比是影响海带甘 露醇提取的主要因素。 (2) 正交试验确定海带甘露醇的最佳提取条件 为:提取温度为2 5,固液比为1 5 0(g m L), 提取时间为3h。甘露醇的提取量为2 . 3 6 %。 参考文献: 黄宗国.中国海洋生物种类与分布 M .北京:海洋出版 社,1 9 9 4:2 0 1 . 吴国荃,聂美丽,罗书凯.我国甘露醇的生产状况与发 展趋势 J .化工技术经济,2 0 0 4(4):4 - 6 . Wh i s t l e r,R o y L . M e t h o d s i nc a r b o h y d r a t e c h e m i s t r y(V o l - u m eVg e n e r a l p o l y s a c c h a r i d e s) M . N e wY o r k:A c a - d e m i c p r e s s,1 9 6 5:2 1 3 - 2 5 4 . N i s h i d eE . S u g a r c o n s t i t u e n t so f f u c o s e - c o n t a i n i n gp o l y s a c - c h c r i d e sf r o mv a r i o u sJ a p a n e s eb r o w n a l g a e J . H y d r o b i - o l o g i a,1 9 9 0(5):2 0 4 - 2 0 5 . 唐微,朱明磊,宋明华.山药多糖对小鼠血清S O D活性 的影响 J .黄冈职业技术学院学报,2 0 0 2,4(2):4 2 . 徐增莱,汪琼,赵猛,等.淮山药多糖的免疫调节作用 研究 J .时珍国医国药,2 0 0 7,1 8(5):10 4 0 - 10 4 1 . 丁筑红,谭书明,丁小燕.山药菠萝复合饮料研制 J . 食品研究与开发,2 0 0 4,2 5(5):8 0 - 8 2 . 魏书信,朱广成.微波山药莲藕饼干的研制 J .农产品 加工学刊,2 0 0 6(1 1):7 3 - 7 4 . 张驰,段路育.山药果脯的加工工艺探讨 J .食品研究 与开发,2 0 0 1,2 2(5):2 9 - 3 0 . 傅博强,谢明勇,周鹏,等.纤维素酶法提取茶多糖 J .无锡轻工大学学报,2 0 0 2,2 1(4):3 6 2 - 3 6 6 . L e eSC,T s a i CC,C h e nJ C,e t a l . E f f e c t s o f“C h i n e s e y a m”o nh e p a t o - n e p h r o t o x i c i t yo fa c e t a m i n o p h e ni nr a t s J . A c t a P h a r m a c o l S i n,2 0 0 2,2 3(6):5 0 3 - 5 0 8 . 刘秀河,吴艳,艾连中.山药水溶性多糖提取工艺的研 究 J .食品与机械,2 0 0 6,2 2(2):2 1 - 2 3 . 孙锋,谷文英,丁霄霖.山药粗多糖的提取工艺 J .食 品与生物技术学报,2 0 0 6,2 5(3):7 9 - 8 3 . S o o n - Y o u n gP a i k,K y u n gS o oR a,I nS e o pC h a n g,e t a l . P u r i f i c a t i o na n dC h a r a c t e r i z a t i o no f C o m p l e m e n t - a c t i v a t i n g A c i d i cP o l y s a c c h a r i d e s f r o mt h eF r u i t s o f C a p s i c u ma n n u u m J . B i o c h e m