微生物课程回顾与复习.ppt

微 生 物 遗 传 学,课程回顾与复习,0. 绪 论,重要概念 表型、遗传、变异 知识点 了解日常描述的遗传、变异现象,一. 微生物的遗传物质,重要概念 复制子、复制起点、半保留复制、先导链、后随链、拟核/类核、 知识点 （1）肺炎双球菌转化实验中转化因子的论证与结论 （2）噬菌体感染实验的结论：遗传物质DNA （3）病毒重建实验的微生物工具与结论：烟草花叶病毒、遗传物质RNA,（4）DNA的一级结构* ：四种核苷酸单体的结构示意、简称 （5） DNA的二级结构：双链反向、碱基互补原则、双螺旋构象*（ B-DNA右手双螺旋结构要点&重要参数） （6） DNA的三级结构：超螺旋现象与拓扑异构酶的功能。 （7） DNA的半保留复制* ：原理与图示 （8）复制叉与复制方向的确定 （9） DNA的主要复制方式：线性dsDNA、 环状dsDNA,（10）原核生物染色体成分：80%DNA+类组蛋白 （11）细菌的DNA复制* ：复制起始（引物）、复制延伸（主要的DNA聚合酶及其功能）、先导链与后随链同时复制。 （12）真核染色体的核小体与组蛋白八聚体。 （13）真核生物与原核生物DNA复制速度的比较。 （14）真核生物的DNA聚合酶（主要酶） （15）基因重叠现象及其类型,Avery等人的转化实验 DNA是转化因子,Bases in DNA,脱氧核糖核苷,脱氧核糖核苷酸,DNA中的碱基配对,核 糖 | 磷 酸 ： 双 螺 旋的 骨 架,例题：以下是两对DNA碱基对的示意图，图中的碱基分别以a、b、c、d表示。请问： a、b、c、d实际分别为何种核苷酸碱基？,Watson-Crick 右手双螺旋结构：B-DNA,要点 （1）主链：脱氧核糖和磷酸以3,5磷酸二酯键交互连接，成为螺旋的骨架即主链，位于外侧，碱基处螺旋内侧，螺旋直径约20； （2）碱基对互补：A-T、G-C； （3）螺距34，包含10对核苷酸，故相邻碱基平面的垂直距离是3.4，相对螺旋轴转动36； （4）双螺旋表面形成大沟和小沟。,例题：大肠杆菌染色体的分子量大约2.5x109Da，核苷酸的平均分子量是330Da，两个临近核苷酸对之间的距离是0.34nm，双螺旋的螺距是3.4nm，计算：分子长度、DNA转数。 DNA的半保留复制,DNA的主要复制方式,线性dsDNA：一般双向复制，形成复制眼。 双向单点复制 双向多点复制 环状dsDNA： 复制 滚环复制 D环复制,细菌DNA的复制起始,DNA聚合酶只能延长而不能开始新的DNA链合成，需要引物短的RNA； 引物：DNA新生链的合成都是以引物酶先合成一小段RNA链为起始的，这一段RNA称为引物。引物通常长1050核苷酸。RNA引物最终被切除并由DNA取代； 引物酶（primase ）：属于RNA聚合酶又不同于转录酶。与解螺旋酶（DnaB）共同作用。,三种DNA聚合酶,DNA聚合酶III：起主要作用的核心酶，先导链和后随链的合成，形成二聚体起作用，具有夹环结构。 DNA聚合酶I： 切除冈崎片段的RNA引物； 填补后随链合成中冈崎片段间的空隙缺口； 53及35的DNA外切酶活性：校读纠错作用 DNA聚合酶II： 35外切酶活性、 53方向DNA的合成； 具体功能尚不清，主要可能在于修复损伤DNA。,DNA聚合酶III,二聚体结构，是起主要作用的核心酶； 夹环（clamp）：可沿DNA滑动，能增强DNA聚合酶III的复制持续性和复制速率。,核小体（nucleosome） 是组成真核生物染色体的基本单位； 是由DNA和组蛋白所构成的“颗粒”。 核心颗粒(组蛋白8聚体)+ DNA缠2圈 + 1分子H1 组蛋白8聚体包括H2A、H2B、H3、H4各2分子。,核小体模式图,140bp + 60bp = 200bp,真核生物DNA的复制速度慢于原核生物，但由于真核生物复制子数量远多于原核生物，两者的总体复制速度难以显著区分；另，由于真核生物复制子比原核生物的小很多，因此两者的单个复制子复制所需的时间，属于同一数量级。,可能原因？核小体结构,真核生物的DNA聚合酶,三. 病毒遗传分析,重要概念 噬菌体、核衣壳、烈性噬菌体、温和噬菌体、溶源细菌、原噬菌体、顺反子 知识点 （1）病毒的基本特征 （2）病毒的五种形状与三类对称 （3）病毒的结构组成：核酸芯、蛋白衣壳、核衣壳、包/被膜的概念。,（4）病毒核酸的多种存在类型 （5）病毒的复制周期（或称复制循环） * （6）噬菌体形态的三种类型：有尾、无尾（球形）、丝状 （7）噬菌斑法：原理、目的作用 （8）一步生长曲线法：目的作用，潜伏期、裂解期和平稳期三个时期的判断与分析。 （9）单菌释放法：目的作用,（10）T4噬菌体的重组测验* ：重组率计算 （11）T4噬菌体互补测验*：作用、结果分析 （12）噬菌体进入溶原周期还是裂解周期的决定：关键蛋白CI 和 Cro，其决定结果。,病毒复制的全过程,重组率的计算,重组型噬菌斑数 重组率 = 100 % 总噬菌斑数 大肠杆菌K平板上的噬菌斑数 2 = 100% 大肠杆菌B平板上的噬菌斑总数,互补测验,结果分析：若两个突变表现出互补效应，则证明这两个突变分别属于不同基因；若不表现互补，则证明这两个突变属于相同基因。,（4）在某噬菌体中有A、B两个顺反子，当下列组合的噬菌体同时感染细菌细胞时，哪些组合产生正常型，哪些组合产生突变表型？,解答： 1 2 3 4 5,例题：a1-a5是5个表型相同的突变型。下列结果表明a1-a5分属于几个基因？,四. 细菌基因转移和基因重组,重要概念 转化、接合、转导、 F因子、普遍性转导、转导噬菌体、局限性转导、共转导 知识点 （1）F因子的三种存在状态（E.coli为例）* （2）DNA杂交重组中的双交换与单交换 （3）中断杂交试验*：结果分析 （4）F因子的形成及其突出特点。,F因子的三种状态（以大肠杆菌为例）： 没有F因子，即F-； 一个自主状态F因子，即F+； 一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr菌株。,单交换产生不平衡的线性染色体,双交产生稳定的重组子,b. 基因转移的顺序非随机,a. 以基因出现的时间为标准作E. coli的遗传连锁图。,共 转 导,指两个基因同在一起进行转导。可应用于测定细菌基因间的连锁关系。 例：a 基因和 b 基因的共转导频率很高、和 c 基因的共转导频率也很高；而 b 和 c 基因很少或完全不共转导。那么，这三个基因的相对位置应为： b - a - c。,五. 质 粒,重要概念 质粒、质粒的不相容性、自主转移质粒、可移动 质粒 知识点 （1）质粒的分子结构（通常）：CCC dsDNA （2）质粒的一般特性 （3）质粒编码基因的特性：非必需、特殊条件下 （4）质粒编码的典型遗传表型*,（5）细胞分裂中的质粒分配* ：质粒稳定遗传的两个条件、主动分配体系的par区结构、不含质粒的子代细胞的宿主致死体系（原理、运作） （6）质粒的各种分类：按复制控制形式分（严紧型 & 松弛型）、按宿主范围分（窄宿主范围 & 广宿主范围）、按转移能力分（转移性 & 非转移性） （7）质粒复制的调控：负调控，两种类型（抑制物-靶位调控、重复子-竞争结合调控） （8）质粒作为基因工程载体的突出特点,质粒的一般特性,能自我复制，并稳定遗传 在细胞内的大小和数量不相同 非必要遗传物质 互不相容性 可消除性 具有可转移性及稳定性 可整合性 可重组性 耐碱性,质粒编码的典型遗传表型,多数质粒均控制宿主细胞一种or几种特殊性状，即具有一定的表型。依表型不同，质粒主要分为如下几类： 致育质粒（Fertility factor） 抗性质粒（Resistance factor） 细菌素质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 降解质粒（Metabolic plasmid） 致病性质粒,宿主致死体系,质粒编码致死基因ccdA(解毒剂)和ccdB(毒剂)； 无质粒子细胞：开始时含有CcdA和CcdB，随后这两种蛋白质逐渐消失； 但毒剂CcdB比解毒剂CcdA稳定，CcdA易先被蛋白酶降解，于是CcdB蛋白行使其对宿主细胞的致死作用。,质粒复制的调控,抑制物-靶位调控：依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。目标RNA包括质粒DNA复制的引物、用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。 重复子-竞争结合调控：质粒在复制起始位点(ori)和复制基因(rep)附近存在着多个重复子序列，它们能与复制起始必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制质粒的复制和拷贝数增加。 转录自体调控 偶联模型,七. 酵母菌遗传分析,知识点 （1）酵母菌基本特性：菌落、代谢型、繁殖 （2）真核生物染色体的三大功能序列（实现染色体功能的三大基本要素）：基本结构 （3）嗜杀现象与嗜杀质粒* （4）单倍体酵母细胞的接合：简要过程 （5）接合型转换的单向性 （6）酵母菌的载体系统（功能分类及各自主要功能）。,嗜杀现象 酿酒酵母中的某些菌株可以产生毒素杀死其他酵母，这种现象即称为嗜杀现象。产生毒素的酵母菌株称嗜杀株，对毒素敏感的菌株称为敏感株，既不产毒素又不对毒素敏感的菌株称为中性株。嗜杀株对毒素有免疫性，敏感株不产生毒素。 一般嗜杀现象是由两种具有自我复制能力的细胞遗传因子线状dsRNA决定的，它们通常以蛋白外壳包裹的粒子状态存在于细胞质中，但与病毒粒子不同不具有体外侵染特性，故称为嗜杀质粒。但因为它们具有蛋白外壳，因此又称为类病毒颗粒。,嗜杀质粒分为L-型和M-型（编码毒素蛋白分泌到胞外）。不同嗜杀酵母株有不同的M型类病毒，从而编码合成不同的毒素蛋白，表现不同嗜杀表型。 只有L型类病毒而无M型类病毒的酵母菌株，不具备嗜杀性，是敏感株；只有同时具备L型类病毒和M型类病毒，酵母才具有嗜杀性。故有人称M型类病毒为嗜杀质粒、L型类病毒为辅助颗粒。 这两种质粒遗传因子不具有细胞外感染能力，但它们可以通过酵母的高频率接合而在酵母中广泛传播。,两个单倍体酵母细胞的接合,接合是由一种接合类型细胞分泌的信息素与另一种接合类型细胞携带的受体相互作用而介导的。 a细胞和细胞的接合通过各自分泌的可扩散a-因子和-因子两种信息素的相互交换而起始。两种信息素的互作可使细胞复制停留在G1 期，然后发生各种形态改变。,接合型转换是单向过程：此过程中有一个接受者(MAT)，却有两个供体(HMR、HML)。但MATa总是与HML进行重组，MAT总是与HMRa重组。,酵母菌的载体种类很多，依功能分为三大类： （1）克隆载体：用于基因克隆。依质粒载体的构成和复制方式，可分为整合型载体(YIp)、 附加体载体(YEp)、复制型载体(YRp)、着丝粒载体(YCp)、酵母人工染色体(YAC)五类。 （2）表达载体(YXp)：包括酵母菌的强启动子+多克隆位点+终止子。外源结构基因插入多克隆位点的适当酶切位点，在强启动子的调节下，外源基因进行高效表达。 （3）分泌载体(YSp) ：一类将基因产物分泌到胞外的载体，除必须含有表达载体的启动子和终止子外，还需在表达载体的起始密码子上游有分泌信号序列。,八. 丝状真菌的遗传分析,重要概念 顺序排列四分体（代表菌）、非顺序排列四分体（代表菌） 、准性生殖 知识点 （1）丝状真菌基本特征：菌落、繁殖 （2）粗糙脉孢菌遗传分析*：第一次分裂分离和第二次分裂分离的判断；计算着丝粒距离 （3）准性生殖与有性生殖的主要区别 （4）准性生殖过程*：包括异核体的形成（异核体的证实）、体细胞二倍体的产生、体细胞中染色体的交换和单元化。,无 交 换,发 生 交 换,因为每1个第二次分裂分离子囊中只有一半是重组的子囊孢子，另一半子囊孢子是非重组的，所以基因座位和着丝粒之间的距离应该是： (1 / 2)第二次分裂分离子囊数 着丝粒距离= 100图距单位 总 子 囊 数,异核体的证实 排除“互养”将原养型菌落上取下的少量菌丝接种于养料贫乏的培养基上，在放大镜下将从接种处向外长出的菌丝尖端连同小块培养基切下，放在基本培养基上。若原养型菌落的出现是由于互养，那么单个菌丝尖端就不会生长。可是只要割取的菌丝尖端不是太短而妨碍生长，往往可以得到一个新的培养物，因此可以排除“互养”这一解释。,排除二倍体或单倍重组体将leumet+ 菌株和leu+ met菌株的分生孢子混合接种在基本培养基上，取其上长出的菌落的单个菌丝尖端，接种于基本培养基；收集由单个菌丝尖端长成的培养物的孢子，分别接种于基本培养基、含亮氨酸培养基和含蛋氨酸培养基上；经培养发现在前一种培养基上没有菌落，而在后两种培养基上可出现菌落。（由于构巢曲霉的分生孢子是单核，所以异核体的分生孢子