蔗糖酶的制备和活力测定.pptVIP

蔗糖酶的制备和比活力的测定,酵母蔗糖酶的制备 各级分酶溶液活性的测定 （1）葡萄糖标准曲线的制备 （2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算,实验内容,比色法测酶活性的原理,酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol底物所需要的酶量，或转化底物中1mmol的有关基团的酶量。实际应用是1ml 酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力 酶的比活力: 每mg酶蛋白质所具有的酶活力 在蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适pH值为3.5-5.5。 通过测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖酶的活力，同时测定蛋白含量，从而求得酶的比活力。,制备蔗糖酶 (冰上操作！),研磨水抽提（级分I ）机械破碎，提取水溶性蛋白成分 （留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步） 热抽提（级分II）： 去除部分热变性蛋白杂质 （留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步） 乙醇抽提（级分III）：有机溶剂沉淀浓缩蔗糖酶 等量分装在两个1.5ml的EP管中，4保存，做为下两次实验中的酶,酶分离提纯的总目标是提高回收率及纯度，保持较高的酶比活力（低温操作）,研磨水抽提 （级分I）,将研钵放入冰中，预冷去离子水 称10g 酵母和约5g二氧化硅，放入研钵中 缓慢加入预冷的去离子水30ml ，每次加2ml，边加边研磨；研磨30分钟以上，直至酵母细胞大部分研碎 将混合物转入两个离心管中，平衡，4度10000rpm离心15min 用滴管将上清水相转入另一个清洁离心管中，再次离心15min 上清转入量筒测体积，用1M乙酸调节pH值至5.0 留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步,热抽提 （级分II）,将级分I 水浴50度30分钟，不断轻摇 此时可以开始做 葡萄糖标准曲线 冰浴迅速冷却3-5分钟，4度10000rpm离心15min 将上清转入小烧杯，置于冰上 留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步,乙醇抽提 （级分III）,向烧杯中的级分II 加入等体积 95%乙醇，搅拌，冰浴10min 4度10000rpm离心15min 弃去上清，倒置于抽纸上沥干，沉淀等量分装于两个1.5ml的EP管中，4保存，做为下两次实验中的酶 （级分III）,冰浴和离心的同时， 可以开始做级分I和级分II的 蛋白质含量测定， 酶活测定,葡萄糖标准曲线的制备,以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线,葡萄糖标准曲线的制备,以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线,酶 活 测 定 （注意保留原管酶液，以备*）,以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量,酶 活 测 定 （注意保留原管酶液，以备*）,以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量,蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法）,参照蛋白质浓度标准曲线(预制)，计算出各级分蛋白质含量。 y=0.0035x X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值,样品 0.5ml + 考马斯亮蓝染液 5ml，室温5min， 测OD595,H2O 级分I （1:10） 级分I （1:50） 级分I （1:100）,级分II （1:10） 级分II （1:50） 级分II （1:100）,样品：,实 验 结 果,1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 （每 1ml蔗糖酶溶液产生的还原糖量） 3、级分I和级分II中蛋白质的含量（每1ml 所含的mg） 4、计算级分I和级分II蔗糖酶的比活力： 蔗糖酶的活力 1ml蛋白质的含量 5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（