红景天(Rhodiola+sachalinensis+ABor)提取液在抗氧化和美白方面的初步研究

四川大学 硕士学位论文 红景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor）提取液在抗氧化和 美白方面的初步研究 姓名：龚静 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：乔代蓉 20060513 四J I l 大学硕十学位论文 摘要 高山红景天( R h o d i o l as a c h a l i n e n s i sAa o r ) 在抗氧化和 美白方面的初步研究 微生物专业 研究生龚静指导教师乔代蓉副教授 红景天作为一种天然植物药材，有相当重要的药理学作用，红景天提取液 富含多种有机成分，包括含有抗氧化性的物质和抑制酪氨酸酶的物质存在。黑 色素的产生是皮肤变黑的重要原因，人体中酪氨酸酶是催化酪氨酸形成 L - D O P A ，以及L - D O P A 形成多巴醌的关键酶。自由基是人体内产生的不稳定的 具有强氧化性的物质，与人体的衰老有密切的联系。当自由基大量产生，又得 不到有效的清除时，会导致机体组织不断老化。 本文研究了红景天水提液、不同浓度的醇提取液在抗氧化或荚白方面的功 效。通过红景天提取液对自由基及酪氨酸酶抑制率的清除效果研究，探讨了红 景天在抗衰老和荚白方面的功效。取得的结果如下： 1 、红景天有效成分分别采用水提、醇提2 种提取方法，其中醇提采用了 传统的热浸提取和冷浸渍提取法，并比较了这些提取方法得到的成分对自由基 的清除能力及抑制酪氨酸酶活性能力。结果证明红景天醇提取法种采用热浸提 取方法较好。 2 、红景天醇提取液在抗氧化方面的研究，探讨红景天提取物能清除自由 基的可能性，用C o ”与H 如反应，类似F e n t o n 试剂产生羟自由基( o H ) ， 采用紫外一可见分光光度计测定其AA 值的变化，可间接测定羟自由基的产生 量。测定了不同浓度梯度( 1 0 、3 0 、5 0 、7 0 及9 0 ) 醇热浸提取液、水提取 液及5 0 醇冷浸渍提取液对羟基自由基的清除效率。结果证明红景天5 0 的醇 热浸提取液具有最大的清除羟基自由基的能力，大大降低了羟基自由基的产生 四川大学硕士学位论文 量，具有清除自由基、抗氧化损伤和抗衰老的作用。 3 、对红景天粉末水提液及5 0 醇提取液在美白方面的功效研究，采用酪 氨酸酶多巴速率氧化法体外测定药物干预前后酪氨酸酶活性，求出对酪氨酸酶 活性的抑制率。结果表明，红景天水提液和5 0 0 o 醇提取液中均存在抑制酪氨酸 酶活性的物质，但5 0 醇提液具有更好的抑制酪氨酸酶的效果。 4 、探讨红景天水提液及醇提取液对酪氨酸酶及其黑色素生物合成的抑制 机理。作出相应L i n e w e a v e r B u r k 曲线，初步推断其抑制类型均为非竞争性抑 制。 上述实验证明应用5 0 红景天醇提液具有清除自由基、抗氧化损伤、抗衰 老及抑制酪氨酸酶活的双重功效。有望用于抗衰老型和荚白护肤化妆品中。 关键词：红景天提取液；酪氨酸酶；抑制效果；羟基自由基；抗氧化剂；溴邻 苯三酚红 2 四川大学硕士学位论文 A b s C r a c t P r e p a r a t o r yS t u d y ：E f f e c to ft h ee x t r a c ts o l u t i o nf r o m R h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o ro nt h eT y r o s i n a s e A c t i v i t ya n d a n t i o x i d a t i o n M a j o r ：m i c r o b i o l o g y G r a d u a t es t u d e n t ：G o n gJ i n g T u t o r ：Q i a oD a r o n g R h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o r ，a san a t u r a lm e d i c a lp l a n t ，p l a ya ni m p o r t a n t r o l ei np h a r m a c o l o g y 1 1 l ee x 缸a c to fR h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o rc o n t a i n sm a n y k i n d so fo r g a n i cp r i n c i p l e s ，s u c ha sm a t t e r so fa n t i o x y g e na n do t h e r sw h i c hc a n i n h a b i tt h ea c t i v a t i o no f t y r o s i n a s e A sw ek n o w n ，t h ep r o d u c eo fm e l a n i ni s r e s p o n s i b l ef o rt h ep r o c e s so fs k i nb l a c k e n i n g B e s i d e s ，t y r o s i n a s ei sak e ye n z y m e w h i c hc a n c a t a l y z e t y r o s i n e t o D D O P A ，a n dc a t a l y z e D D O P At o d i o x y p h e n y l a l a n i n eq u i n o n e F r e er a d i c a l s ，am a t t e rp r o d u c e di nv i v o , w h i c hi sc l o s ec o n n e c t i o nw i t ha g e i n g , i si n s t a b l eb u tp o w e r f u li no x i d a t i o n I fp l e n t yo ft h ef r e er a d i c a l sp r o d u c e dw i t h o u t e f f i c i e n tc l e a n i n g , t h eo r g a n i s mw i l lb ea g e i n gu n i n t e r r u p t T h i sp a p e rd o , s o m e r e s e a r c ho nt h ee f f e c to ft h ee x t r a c to fR h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o ro nt h e a n t i o x y g e na n dc o s m e t o l o g y F r o mt h e 化s e a r c ho ft h ee f f e c to nt h ei n h i b i t i o nr a t i o o ft h et y r o s i n a s ea n dt h ec l e a n i n go ff r e er d i e a l s , w eg e tt h ef o l l o w i n gr e s u l t s ： 1 W eu s e dt w oa p p r o a c h st og e tt h ee x t r a c to ft h eR h o d i o l as a c h a l i n e n s i s A B o r o n ei st oe x t r a c ti nw a t e r t h eo t h e ro n ei st oe x t r a c ti na l c o h 0 1 E x t r a c t a p p r o a c h si na l c o h o l i si n c l u d i n g ：c i r c u m f l u e n c ee x t r a c ta n dm a r i n a t i n g e x t r a c t 3 四川大学颂十学位论文 2 I nt h er e s e a r c ho f1 0 、3 0 、5 0 、7 0 、9 0 a l c h o lc i r c u m f l u e n c ee x t r a c t m a r i n a t i n ge x t r a c ta n dw a t e re x t r a c to ft h eR h o d i o l as a c h a l i n e n s i s 丸B o ro n a n t i o x i d a t i o n 。a n t i o x i d a t i n na b i H t yo fR h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o r 5 0 e t h a n o lc i r c u m f l u e n c ee x t r a c tm a t e r i a l sw a sr e s e a r c h e da n di t s a b i l i t yi nf r e e r a d i c a le l i m i n a t i o nw a sv a l i d a t e d C 0 2 + r e a c t e dw i t hH 2 0 2 ，s i m i l a rt ot h e r e a c t i o no fF e n t o n , t op r o d u c ef r e er a d i c a l s ( 。0 H ) ，a n dt h e n t a k i n g s p e e t r o p h o t o m e t e rt ot e s tt h ec h a n g i n go f Av a l u e F r o mt h er e s u l t , w ec a n i n d i r e c t l yt e s tt h ea m o u n to ff r e er a d i c a l s T h eC 0 2 + - H 2 0 2 - B P Ra n a l y z i n g s y s t e mW a ss e tu pt ot e s tt h ee l i m i n a t i o na b i l i t yo ff i e er a d i c a l s W ef i n dt h a t t h ee x a c tc a ns l o wt h ef o r m i n gs p e e do fh y d r o x i d er a d i c a l A n dt h ey e i l do f h y d r o x i d er a d i c a la l s ol o w e r e dm u c h W h i c hd e m o n s t r a t e st h ee x a c th a st h e s e e f f e c t s ，s u c ha s ，a n t i o x i d a t i o n ，c l e a n i n gt h ef r e er e d i c a l sa n da n t i a g e i n g 3 T 1 l er e s e a r c ho fw a t e re x t r a c to ft h eR h o d i o l as a c h a l i n e n s i s L B o ro n w h i t e n i n g A s s a y t h e a c t i v i t y o ft y r o s i n a s eb e f o r ea n da f t e rm a d i c i n e i n t e r f e r i n gi nv i t r ow i t ht h et y r o s i n a s ed i o x y p h e n y l a l a n i n ev e l o c i t yo x i d a t i o n m e t h o d ，t h e n , w eg e tt h ei n h i b i t i o nr a t i oo ft h et y r o s i n a s e 1 飞er e s u i ti n d i c a t e s t h a tt h ee x t r a c to fR h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o rc o n t a i n sm a t t e r sw h i c hC a l l i n h a b i tt h ea c t i v a t i o no f t y r o s i n a s e 4 D i s c u s st h em e c h a n i s mo fi n h a b i t i o no nt h ep r o d u c eo fm e l a n i na n dt h e t y r o s i n a s e t h e nt h eL i n e w e a v e r - B u r kc n I v I i sa v a i l a b l e ，a n dw ei n i t i a l l y d e d u c et h ei n h a b i t i o nt y p ei sn o n c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n T h ea b o v e m e n t i o n e dr e s e a r c hd e m o n s t r a t e st h a tR h o d i o l as a c h a l i n e n s i s A B o rh a st h ee f f e c to nw h i t e n i n ga n da n t i a g e i n g S oi ti sp r o m i s i n gh eu s e di n s k i np r o t e c t i o nc o s m e t i c s K e yw o r d s ：e x t r a c ts o l u t i o nf r o mR h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o r ；t r y o s i n n s e ； i n h i b i t i o ne f f e c t ；h y d r o x y lr a d i c a l ；a n t i o x i d a n t ；b r o m o p y r o g a l l o lr e d 4 四川大学硕士学位论文 红景天( R h o d i o l as a c h a I j n e n s i sA B o r ) 在抗氧化和 美白方面的初步研究 前言 红景天系景天科( C r a s s u l a c e a e ) 红景天属( R h o d i o l aL ) 植物，为多 年生草本或亚灌木植物，主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部和北 美洲等地区，大多数都生长在海拔3 5 0 0 - 5 0 0 0 米左右的高山流石或灌木丛林 下。全世界红景天植物大约有9 0 多种，我国红景天种类较多，有7 0 多种。主 产于华北、东北、西南、西北和华中等地，其中西藏占有3 2 种，2 个变种。红 景天主要以根和根茎入药，全株也可入药，民间常用于止血、清肺止咳、跌打 损伤、烧烫伤及糖尿病等病症。从红景天的成分来看，具有各种生理活性的成 分种类繁多。其中所含的红景天甙和甙元酪醇为人参型兴奋剂，所含的没食子 酸、伞形花办酯、东莨菪素、山萘酚等具有抗菌消炎作用，同时山萘酚、东莨 菪素还有止咳祛痰作用。主要有效成份有红景天甙( S a l i d r o s i d e ) C 。4 I 。0 7 酪 醇( T y r o s o t ) C J I 0 0 ：，此外含有淀粉、蛋白质、脂肪、鞣质、黄酮类化合物、酚 类化合物及微量挥发油，还含有具有生物活性的微量元素铁、铝、锌、银、钴、 镉、钛、铝、锰等，叶与茎中含有少量生物碱。红景天的现代研究始于2 0 世纪 5 0 年代，人们发现红景天具有与人参，刺五加类似的“适应原样”作用，广 泛应用于抗疲劳、抗衰老和提高脑力和体力机能等方面。而且不会出现人参的 过度兴奋作用和剌五加致便秘的作用，因而越来越受到人们的广泛重视。 高山红景天( r h o d i o l as a c h a l i n e n s i sA B o r ) ，又名库叶红景天， 是一种生长在世界高山高纬度地区的珍贵药用植物，在我国主要分布在东北的 长白山区。由于其生长环境极其恶劣，如缺氧、低温于燥、狂风、受紫外线照 射，昼夜温差大等，具有很强的生命力和特殊的适应性。民间主要以其根茎入 药，具有滋补强壮，抗疲劳，抗衰老，抗寒冷等药效：8 0 年代又发现其具有镇 静，提高脑力和体力等功效。但它对酪氨酸酶的抑制作用或抗氧化方面迄今 仍少有报道。美国加州B e r k e l e y 大学的K u b o 教授对酪氨酸酶抑制剂的研究最 5 四川大学硕士学位论文 为前沿。为进一步阐明高山红景天的药理作用，本文研究高山红景天的水提液、 醇提取液在抑制酪氨酸酶活性作用或清除自由基的作用，旨在对高山红景天植 物的开发和利用提供实验数据。 6 四川大学硕士学位论文 论文 第一章红景天有效成分的提取 中草药的有效成分的提取方法很多，常见的就有溶剂萃取法，沉淀法，盐 析法，透析法，结晶、重结晶和分步结晶法等方法。但最常见的，用得最广的， 效果较好的还是溶剂萃取法，溶剂进入药材组织中，溶解其中的化学成分，并 将其从组织中逐渐提出的过程。红景天有效成分提取常用热浸渍提取和冷浸提 取2 种方法，本实验对红景天有效成分的提取采用2 种方法并比较2 种方法的 有效性。 溶剂提取过程； 充盈的新鲜药材一干燥失水一细胞萎缩、组织空洞一化学成分沉积于干缩的组 织和细胞中。 药材粉碎一表面积增大、孔洞外露一溶剂接触，渗透、浸润、溶胀一颗粒内外 高浓度差一自动扩散、主动渗透一颗粒内外有效成分浓度相同( 提取平衡) 提 取平衡一更新溶剂( 打破平衡) 一连续提取一最大程度提取。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 材料 高山红景天( R h o d i o l as a c h a l i n e n s i s 彳B o r ) 采自四川阿坝红原县，无水 乙醇为国产分析纯。 1 1 2 仪器 陶瓷锅，组织破碎机，旋转蒸发仪，4 0 目筛子，真空抽滤泵，热浸提取器。 7 四川大学硕士学位论文 1 2 方法 1 2 1 红景天材料的处理 将红景天根茎一破碎一烘干( 8 0 ) 一粉碎( 4 0 目) 一红景天粉末 1 2 2 水法提取工艺 先将红景天粉末用重蒸水浸泡l h ，再移入热浸提取器中进行提取。 提取过程：红景天粉末一用水加热浸渍( 分3 次进行，3 次加水量分别为红 景天重的1 0 、6 、4 倍；提取温度为8 0 ，每次浸提时间l O O m i n ) 一合并3 次 提取液一抽滤( 真空度为0 0 8 5 M P a ) 一离心( 1 0 0 0 0 r p m ，l O m i n ) 一得到红景天水 提液一旋转蒸发一定容。所得的提取物用于后面的实验。 1 2 3 醇法提取工艺 热浸渍：红景天粉末分别用不同l O 、3 0 、5 0 、7 0 、9 0 浓度梯度酒精浸泡 1 h 后，移入提取器中进行提取。8 0 水浴中浸提，重复3 次，每次乙醇加入量 与红景天重之比为1 0 ：1 ，每次浸提时间为l O O m i n - * 合并3 次浸提液一用4 0 0 目筛绢过滤一抽滤( 真空度为0 0 8 5 M P a ) 一离心( 1 0 0 0 0 r p m ，l O m i n ) 一得到红景 天醇热浸提液一旋转蒸发( 真空度为0 0 8 5 M P a ) 一定容。 冷浸渍提取g 红景天根茎粉末一常温下5 0 醇冷浸渍3 d ( 每d 更换1 次溶 剂) 一过滤一合并3 次滤液一离心( 1 0 0 0 0 r p m ，l O m i n ) 一旋转蒸发( 真空度为 0 0 8 5 M P a ) 一定容。 所得的提取物用于后面实验。 1 2 4 计算每单位体积中所含生药含量 提取物中所含生药量浓度的确定可采取材料总质量与最终所得提取液体 积的比值来衡量。 8 四川大学硕士学位论文 2 结果 2 1 水法提取 提取液浓度= 提取材料总质量 浓缩液总体积 5 9 红景天在8 0 0 C 热水进行加热浸渍提取后经减压旋转蒸发后定容得5 0 r a l 具有芳香味，粘稠状淡红褐色液体；水提取液所含生药量的浓度为0 1 9 m k 。 2 2 醇法提取 5 9 红景天粉末在1 0 、3 0 、5 0 、7 0 、9 0 酒精中进行连续热浸提取和5 0 酒 精冷浸提取最后定容到5 0 r a l ，得到颜色深浅不一的芳香味的液体。提取液中生 药量浓度均可定容为0 1 9 m L 。后面的实验可根据需要进行稀释。 3 讨论 在采取溶剂提取法提取有效成分时，旋转蒸发一定要蒸到体积小于5 0m L 为宜，在蒸发到一定程度时，就将红景天提取液转移到另一个可定容容器中， 再加溶剂少许于旋转蒸发仪中，以便将其残留物洗出，移入定容容器中，保证 提取物不被损耗。 不同浓度的酒精对红景天进行提取时，酒精浓度越高时，提取的成分颜色 就越深，但是溶液的粘稠度明显降低，而酒精浓度越低时，其溶液就越粘稠， 甚致进行真空抽滤时都不能将其溶液滤下。因此可在过滤前进行1 0 0 0 0 r p m ， l O m i n ，再进行过滤。红景天提取液粘稠性主要是由于含有大量糅质等水溶性 成分，使其提取液具有很大的粘性。从各梯度提取液的颜色可看出，各梯度酒 精提取液所溶解的成分有很大的差别。用冷浸渍方法得到的5 0 红景天浸泡提 取液几乎不具有粘性。 本文应用的是粗提红景天材料，主要是为了鉴定其抗氧化、抑制酪氨酸酶 9 四川大学硕士学位论文 活性的功能是否存在。要确定其具有具体功能的化学成分，有待进一步深入研 究分离纯化其有效成分。 1 0 四川大学硕士学位论文 第二章红景天提取液对羟自由基清除作用的研究 人类皮肤是一个很容易呈现老化的器官，皮肤的衰老是一个复杂的过程， 有关理论很多，其中自由基理论受到人们的广泛关注。近年来，随着自由基生 物学及医学的深入发展，人们对自由基的发生及其对人体所产生的危害有了越 来越多的认识。机体许多代谢过程的氧化还原反应均可产生自由基。自由基是 人体衰老的重要因素之一，抗衰老化妆品就是针对皮肤衰老的特点及原因，添 加一些活性营养物质，以达到延缓皮肤衰老的目的。 自由基是生命活动过程中生物化学反应的中间产物。在正常情况下，机体 内自由基的产生和清除处于动态平衡之中，但它若在体内产生过多或清除过 慢，就会在分子水平、细胞水平以及器官水平给机体造成损伤，并可加快机体 的衰老过程。羟自由基是机体自由基中最活泼的自由基，其反应速度极快，对 机体危害最大，超过了o - 2 和1 0 2 两种活性氧自由基。 近几年来，国内外的一些研究者就植物提取成分的自由基清除能力进行过 相应的研究，发现许多植物提取物或其中的一些成分对羟自由基具有很好的清 除作用，利用天然植物资源来寻找具有抗氧化特性的的保健原料是极有可能 的。 常见的自由基清除剂主要有：维生素E 、抗坏血酸( V c ) 、儿茶酚、p 一胡 萝h 素、半胱氨酸、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶( S O D ) 及其S O D 复合酶、金属 硫蛋白( 町) 等。V c 、儿茶酚作为最常用的抗氧化剂，在国内外对一些D P P H 、 A P P H 等稳定性自由基清除体系中均常采用V c 和儿茶酚作为阳性对照物。羟基自 由基是一种不稳定自由基，F e n t o n 试剂反应体系是一种产生羟基自由基的经典 体系，在这个体系中，国外很少采用V c 作阳性对照，而国内仍有以此作阳性对 照的报道。本文对该两种对照物在类似F e n t o n 试剂反应体系中进行了评价，判 断作为阳性对照的可行性。本文采用的经典F e n t o n 反应，是以H 2 0 2 为氧化剂， 以亚铁盐为催化体系的氧化法，其反应机理如下： F e 争+ H 2 0 2 一F e 3 + + o H + O r 四川大学硕士学位论文 由于C 0 2 可与H ：O ：作用，类似F e n t o n 反应，产生羟自由基，且产率大为提高。 其反应原理可类推如下： C 0 2 + + H 2 仉- - C 0 3 + + O H + O H - 然后，再利用其产生的羟自由基氧化B P R ( 溴邻苯三酚红) ，使B P R 的吸光度 发生变化，从而间接地测定羟自由基的产生量。 采用的经典F e n t o n 反应，参考吴南等人建立的H 2 0 2 一c 0 2 + 产生的羟自由基的 溴邻苯三酚红氧化法检测红景天水提取液，1 0 、3 0 、5 0 、7 0 、9 0 9 6 醇热浸提取 液及5 0 醇冷浸渍提取物对自由基的清除作用。有利于对红景天在化妆品方面 的开发应用打下基础。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 红景天提取液 红景天水提取液； l O 、3 0 、5 0 、7 0 ，9 0 醇浓度梯度热浸提取液； 5 0 醇冷浸渍提取液。 1 1 2 试剂 均为国产分析纯 C O S 0 4 溶液：0 2 t o o l L ，准确称取5 7 6 m g C o S O i 7 H 2 0 晶体用水溶解，定容 于1 0 0 0 m L 容量瓶中： 溴邻苯三酚红溶液( B P R ) ：1 O m m o l L ： P H 9 缓冲溶液：N 心C I I O 8 9 加4 m L 浓氨水加水定容成5 0 0 m L ： 儿茶酚：2 0 姗o l L ： V c ：2 O 皿n 0 1 几： 过氧化氢( H 。0 。) 溶液：1 ，取1 O m L3 0 H ：仉，用水稀释到3 0 I I l L 1 1 3 仪器 U 、，一7 5 4 型紫外一可见分光光度计( 上海分析仪器总厂) 四川丈学颂十学位论文 旋转蒸发仪 电子恒温水浴锅 1 2 方法 1 2 1 羟自由基检测体系建立 采用H 2 砚- c o 产生的羟自由基的溴邻苯三酚红氧化法，在5 m L 离心管中，按 顺序加入试剂，加0 4 m Lc d + 溶液，0 4 m LB P R ，1 2 m Lp H 9 缓冲溶液，0 4 m L H 2 0 2 。补加重蒸水至4 m L ，在3 0 水浴锅罩反应l O m i n 后，用5 m 比色皿，在波 长5 6 0 叫测吸光度，空白参比不加H ：0 2 ，计算其与空白参比A 。之差( A m ) 可作 为表观自由基产生量。 1 2 2 自由基清除体系显色稳定性的研究 依1 2 1 方法加入试剂，将空白参比和产生羟基自由基体系分别混匀后马 上移入比色皿中，每I m i n 澳g 定吸光度值，判断现色稳定性的时间。 1 2 3 抗氧化药清除羟自由基阳性对照物的选取 分别对不同体积抗氧化剂儿茶酚( 2 m m o l L ) 和V c ( 2 m m o l L ) 清除羟自由 基阳性对照物抗氧化比较分析。 表1 反应液的组成和体积 按表1 顺序加入药品，最后以重蒸水补充至4m L ，反应l O m i n 后测A m ( 加 药) ，未加抗氧化药及羟自由基测A 。( 参比) ，加羟基自由基和B P R 不加抗氧 阴J I I 大学硕士学位论文 化药测得的吸光度为A 。( 羟) ，实验重复3 次，以测定的平均值按下式计算表 观羟自由基清除率R ： A 5 伽拗A 5 ( 羟) R = 瓦石磊五；而 1 2 4 红景天提取液清除羟基自由基能力研究 分别对不同浓度的红景天水提取液、红景天1 0 、3 0 、5 0 、7 0 、9 0 乙醇热 浸提取液及5 0 9 6 乙醇冷浸渍提取液清除羟基自由基能力的研究，试剂按表2 顺 序加入，以重蒸水补足为4m L 。 表2 反应液的组成和体积 2 结果 2 1 体系中显色稳定性分析 分别对红景天5 0 醇提取液0 0 0 5 9 m L 、0 0 1g m E 、未加红景天提取液加 了羟基自由基及未加红景天提取液和羟基自由基4 个体系的吸光度值随着时间 的变化关系进行了研究，其研究结果见表3 ； 从表3 中可以看出，随着反应时间的推移，其参比( 未加红景天提取液和H ：0 2 ) 的吸光度值基本不发生变化，而加了也0 2 而没加红景天提取液的样品中吸光度 值下降得很快，并且到达平稳期的时候其吸光度值处于一个较低的水平，和参 比比较差值很大，差值越大表明产生的羟基自由基总星就越多，而这两者之间 的差值可以作为表观羟基的产生总量，任何体系与参比吸光度值进行比较差值 越大，产生羟基总量就越多。加入了红景天5 0 醇热浸提取液( 0 0 0 5 9 m k ) 时 随着时间的推移，其吸光度值略为有所下降，但从同时间来比较，其吸光度 1 4 朋川大学硕士学位论文 值都比不加红景天提取液而加了羟基自由基的吸光度值大，说明加入红景天提 取液后羟自由基的产生量有所下降，在大概l O m i n 后，其羟基产生量基本处于 平稳状态。 因此本实验选择反应时间为l O m i n ，就能保证整个反应体系的显色稳定。 o 司 051 01 5 2 02 5 反应时问( m i n ) 图2 1 不同浓度的红景天提取液与羟基自由基清除速率关系 一 红景夭5 0 醇提取液0 0 0 5 e g m L 未加红景天提取液加r 羟自由基 红景天5 0 醇提取液浓度0 0 1 9 ，m L 未加红景天提取液和羟自由基 由图2 1 可知，随着红景天提取液浓度的增加，其吸光度值也会增大，表 明红景天提取液浓度的加大，其羟基的产生量也会有所减少，并且在浓度为 0 O l g m L 时，很快达到平稳期，说明羟基的产生很快受到抑制。并且产生量也 随着红景天提取液的浓度的增大而明显减少。 表3 吸光度值随着时间的变化关系表 “跖。巧卫坫晒0 0仉0仉0仉0吼 四川大学硕士学位论文 2 2 抗氧化药清除羟自由基阳性对照物儿茶酚、V c 效果比较结果 分别对不同体积抗氧化剂儿茶酚( 2 m m o l L ) 和V c ( 2 m o l L ) 进行抗氧化实 验分析，其实验结果如下： 表4 抗氧化剂儿茶酚体积与A A 5 6 0 及羟基自由基的抑制百分率之间关系表 1 6 四川大学硕士学位论文 从表4 中可以看出，随着儿茶酚体积的增加，A 5 6 0 不断减小，表明羟基 的产生量不断减少，羟基的抑制百分率不断增大，说明其体系的抗氧化能力也 在不断的增强。而抗坏血酸随着体积不断增大而吸光度值的改变量也不断的增 大，表明羟基产生量不但没有被清除，反而有所增加。 将其数据绘制成曲线统计图，图2 2 及图2 3 直观的反应了儿茶酚及抗坏血 酸对羟基自由基的作用有着相反的效果。因此利用F c n t o n 反应产生羟基自由基 的体系不能用V c 作为阳性对照，本实验体系采用几茶酚作为阳性对照而不选取 抗坏血酸。 0 3 0 2 5 。O 2 私1 5 0 1 0 0 5 0 0 511 52 儿女 酚体积数6 正) 图2 2 儿茶酚不同体积对A A 5 6 0 的影响 1 7 四川大学硕七学位论文 ； 爵 笾 磐 g 辋 钼 皿 蝴 斌 0l23 4 5 不同体积的v i t c ( 吐) 图2 3 抗坏血酸不同体积对A 5 6 0 的影响 图2 4 儿茶酚对羟基自由基的清除率与体积的关系 2 3 红景天不同梯度醇提取液的浓度与羟基自由的清除率之间关系 红景天不同浓度梯度乙醇提取液对羟基自由基的抑制效果见图2 5 ，无论是 哪种梯度的红景天提取液，清除率都会随着提取液的浓度的增大丽增大。 从表5 中可以看出，在提取液浓度一定的情况下，5 0 醇提取液清除自由基的 能力最大，水提取液清除自由基的能力较小，而3 0 、7 0 醇提取液对自由基 也有较大的清除作用，9 0 醇提取液的自由基清除效果也有所下降，可以说明 3 0 7 0 醇浓度梯度之问提取的物质具有较多清除自由基活性的物质。 6 5 4 3 2 l 0 0 0 O 0 0 0 0 9 9 q 四川大学硕士学位论文 表5 红景天不同浓度梯度酒精提取液对羟基自由基的清除百分率 0 0 0 50 0 1 0 0 1 50 0 2O 0 2 5 各提取物的浓度( g m L ) 图2 5 红景天不同浓度梯度乙醇提取液对羟基自由基的抑制效果分析 系列1 红景天水提取液系列2 红景天1 0 酒精鹤浸提取液 系列3 红景夭3 0 摺精热浸提取液系列4 红景天5 0 酒精热浸提取液 系列5 红景天7 0 A 精热浸提取液系列6 红景天螂酒精热浸提取液 2 4 热浸和冷浸渍两种提取工艺提取物效果比较 冷浸渍提取工艺和热浸提取工艺都是传统的对中草药有效成分的提取方 法，现对这两种方法对5 0 醇提取液实验结果进行比较： 似加O 静娘阻笾磐g蝴忸皿蚺澈絮 纹身器材http:/www.lr- 网川丈学硕士学位论文 从图2 6 和2 7 中可以看出，用2 种提取方法所得5 0 醇提取液都有清除 自由基的能力，但两者对自由基清除能力差别很大。冷浸渍提取液半抑制效率 为0 0 1 4 9 m L ，热浸提取液对自由基的半清除效率浓度约为0 0 0 8 9 m L 。也就 是说，红景天5 0 醇热浸提取液中所含清除羟自由基的物质比冷浸渍提取液中 所含的羟基自由基清除物质要多得多。因此本实验中其它组分均采用了加热热 浸提取的方法。 00 0 0 5 0 0 1 0 0 1 50 0 20 0 2 5 红景天5 0 堪提取液浓度( 1 缸 图2 6 红景天5 0 ；醇热浸提取液清除羟基自由基的变化关系图 0 8 0T 蓬： 謦o 毂 O O0 0 0 5 O0 1 00 1 5 0 O0 2 5 红景天5 嘴提取浪维度 图2 7 红景天5 0 i 醇冷浸渍提取液浓度与羟基自由基的清除之间的变化关系图 从图2 6 和图2 7 中可以看出，随着红景天5 0 醇提取液浓度的增加，其对 羟基自由基的清除率也不断加大，并且成正比例函数的曲线上升，与儿茶酚有 相似的性质，证明了红景天5 0 醇热浸提取液及冷浸渍提取液都具有自由基的 清除能力，但热浸提取液对自由基的清除效果远远高于冷浸渍提取液。 的o 窘一爵隶旧筮罢醐皿皿硼嫩 纹身器材http:/www.lr- 四川大学硕士学位论文 3 讨论 众所周知国内外常见的抗氧化药物有：儿茶酚、V c 、V E 、甘露醇、苯甲 酸等，但在本实验中却出现了V c 促进羟自由基产生的现象。而国内有些有关 羟自由基的清除的实验却仍选用V c 作阳性对照，据国外有关文献报道，抗坏 血酸虽然是一种抗氧化剂，但在有F e 2 + 、C u 2 + 、C 0 2 + 等过渡金属阳离子存在的 情况下，V c 就会具有氧化增强剂的作用， 而本实验羟基自由基的产生体系就是通过类似F c n t o n 反应的体系演化而 来，体系中存在过渡金属阳离子c o “，就导致了抗坏血酸增加了羟基自由基产 生的能力。因此利用F e n t o n 反应产生羟基自由基的体系不能用V c 作为阳性对 照，本实验体系采用儿茶酚作为阳性对照而不选取抗坏血酸。 儿茶酚是典型的抗氧化性药物，通过不同浓度的儿茶酚与其对羟基自由基 的清除率之间的关系绘制的曲线图2 4 可知，随着儿茶酚的浓度的增加，儿茶酚 对羟基的清除率也在不断的增加，儿茶酚所用体积在1 6 时，其清除率就达到 1 0 0 ，清除率与所加入的儿茶酚的用量呈二次函数的量效关系。也证明了选 用儿茶酚作为阳性对照的可靠性，确认了用这种方法来评估抗氧化能力的可行 性。 由于红景天的提取液浓度的不断增加，其吸光度值也在不断的加大，其吸 光度值越大，说明清除效果可能越好。因为在自由基存在的情况下，会将溴邻 苯三酚g r ( B P R ) 氧化导致吸光度值大大下降，若加入了抗氧化物质后，会对羟 基自由基的产生有所抑制，或者说会对羟基自由基有所清除，会导致吸光度值 增大。若越接近未加入抗氧化剂和H 2 0 2 的情况下的吸光度值，则说明清除效果 就越好。 自由基是导致机体组织氧化，有机体功能衰退的重要因素，从自由基的清 除效果分析可知，红景天提取液有羟基自由基的清除能力，而羟基自由基是对 机体氧化性最强，损伤性最强的自由基，是人体衰老的主要因素之一，研究红 景天醇提取液对羟基自由基的清除能力可间接证明红景天5 0 醇提取液具有 抑制衰老的作用。为抗衰老功能提供了有力的证据，说明将红景天有效成分用 于化妆品有望提高皮肤的抗衰老能力。 纹身器材http:/www.lr- 四川大学硕士学位论文 皮肤衰老的主要表现是表皮角质形成细胞的更新代谢减慢、真皮层纤维细 胞增殖分裂速度降低，而氧化损伤是人体组织衰老的重要机制之一，皮肤衰 老与之密切相关。主要是因为自由基与体内不饱和脂肪酸作用，引发脂质过氧 化反应，形成脂质过氧化物( 如M D A ) ，M D A 又可促进胶原纤维的交联，交联过 多，会导致皮肤组织变硬、皱缩进而皮肤衰老。一些化学物质，特别是一些抗 氧化剂能与自由基结合，清除自由基、保护细胞免受氧化损伤。因此，如果化 学物质能对皮肤细胞具有一定的增殖作用，减少皮肤自由基的生成，提高S O D 的活性，就可使皮肤组织更新加快，胶原纤维生成增多，保持皮肤的水分，从 而有效地减缓皮肤衰老。老年人与青年人相比，皮肤表皮变薄，皮肤角质形成细 胞和成纤维细胞明显减少，因此促进衰老皮肤细胞的增殖是护肤品的追求目标 之一。本研究发现红景天5 0 醇提取液对氧化能力最强的羟基自由基有很强的 清除能力，在醇提取液浓度为0 0 0 1 5 9 I n L 时，对羟基自由基的清除率就达到 5 0 ，相当于纯的1 2 m L O 1 m m o l L J L 茶酚的清除效率。但两者的清除效率的高 低不具有可比性，因为红景天提取液是一种粗提液，并未对其中有效成分进行 提取纯化，因此，要对红景天抗衰老作用的进一步研究，必须对提取成分进行 纯化，进行定量分析。 纹身器材http:/www.lr- 四川大学硕七学位论文 第三章红景天提取液对酪氨酸酶抑制效果 的初步研究 正常皮肤的颜色主要取决于以下3 个因素： 1 皮肤内色素含量如黑色素、 类黑色素和胡萝卜素等；E 2 皮肤血液内氧合血红蛋白与还氧血红蛋白的含量； 3 皮肤的厚度及表面对光线的散射作用。其中黑色索含量的多少对皮肤的 颜色起决定作用。 造成皮肤黑色素生成的原因有多种，如遗传因素和环境因素，并且其生成 原因相当复杂。目前研究结果基本上认为其成因在于：皮肤细胞中的酪氨酸在 酪氨酸酶的作用下，受环境中各种因素的影响，逐渐氧化D o p a 、D o p a q u i n o n e ， D o p a q u i n o n e 再经过一系列的代谢反应，聚合为l n d o l e 5 ，6 - q u m m e ，最后逐步转 化为皮肤黑色素。其反应方程式为： 嚣夕谗蕊i l O o I I 一趟_ f 趣l n 纹身器材http:/www.lr- 四川大学硕士学位论文 过作用于皮肤黑色素生成，代谢过程中，抑制黑色素生成且符合安全规范的物 质。 由于酪氨酸酶分别作用于酪氨酸转化为D o p a 和D o p a q u i n o n e 两个过程，目 前的皮肤美自剂就是通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧 化途径，从而减少黑色素的生成达到美白皮肤的效果。 传统的皮肤美白剂，往往采用化学性物质，如过氧化氢、氯化氨基汞以及 各种酚类衍生化合物。这些化合物能使黑色素组织迅速瓦解，达到快速美白之 功效。但因其对皮肤腐蚀性、细胞毒性和过敏性等因素，具有极大的危险性， 在许多国家的卫生规范中，已被禁用。目前要求的皮肤美白剂，不但荚白效果 有效且无毒副作用，一般源自天然植物提取物，如熊果苷、曲酸及其衍生物、 维生素C 及其衍生物、甘草黄酮、B i o w h i t c 以及中草药提取物等。 红景天提取液清除羟基自由基能力的研究中，5 0 醇热浸提取液具有最大 的清除羟基自由基的能力，水提取液对羟基自由基的清除能力最小，但它对酪 氨酸酶的抑制作用方面迄今未有报道。美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率大小成 为衡量这类物质荚白效果的重要依据，可以从研究其抑制酪氨酸酶活性着手， 研究红景天水提取液在美白方面的应用。本实验以常见的荚白药物曲酸作为阳 性对照，进一步探讨5 0 醇提取液、水提取液是否具有抑制酪氨酸酶效果，比 较两者抑制能力的大小，为红景天在美白化妆品方面的开发利用提供依据。 1 材料与方法 1 1 材料 红景天水提取液； 红景天5 0 醇热浸提取液： 红景天5 0 醇冷浸渍提取液： 酪氨酸酶( 用P B S 配制成相应浓度单位) 购自s i g m a 公司： L - D O P A 购自s i g m a 公司( 用P B S 配制成所需浓度单位) ； 曲酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等试剂皆为国产分析纯。 7 5 2 型紫外分光光度计，旋转蒸发仪，电子水浴锅，真空减压泵。 纹身器材http:/www.lr- 四川大学硕七学位论文 1 2 方法 1 2 1 酪氨酸酶活性抑制的测定 采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测，在M a t s u d a 等报道的酶学测定方法上 作了适当的修改，按表6 顺序加入药品并进行反应，