《lcms质谱》PPT课件.ppt

液相色谱-质谱联用系统 （LC-MS）,Introduction,气相色谱 在柱温条件下有一定蒸气压且稳定性好的样品都能测定，只要在 196 450 温度范围内有27 1330 Pa蒸气压且不分解的物质原则上都能测定，不论它是气体、液体和固体。 对于挥发性低和受热易分解的物质，若能通过化学衍生方法使其转化为挥发性大、热稳定性好的衍生物，同样可用气相色谱分离和分析。 GC 专长：同系物（其它方法无法测定） GC 主要用于分离和定量，可广泛应用在环保、临床、药物、农药、食品、污染物等方面的测定。,对不宜汽化的高分子，热稳定性差、化学性质极为活泼或强腐蚀性物质不能用GC测定。应用范围受到限制，在所有的有机物分析中只有1520%能用GC进行分离分析。,Introduction,对于挥发性化合物的分析，气相色谱（GC）是关键的分离技术，对于极性和高分子量化合物，液相色谱（LC）则是其关键的分离技术。 与GC不同，LC缺乏灵敏和选择性（乃至特异性）的检测器。大多数通用的检测器或灵敏度不高（例如折光指数检测器，光散射检测器或荧光检测器），或在牺牲灵敏度的情况下有一定程度的选择性（例如二极管阵列检测器）。,要求发展能将这两个特点结合起来的LC联用技术,长期以来，LC与MS联用被认为是“不可能的结合”,传统的HPLC系统中遇到的流量（0.52 mL/min的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。 HPLC缺乏灵敏、选择性和通用的检测器也是HPLC和MS联用的推动力。,为了克服这一明显的不相容问题，在过去20年中已发展了几种不同的接口。 将流量达2 mL/min的液体引进MS的真空系统需要使用一个合适的接口,HPLC-MS接口的主要困难：,或者需要尽可能多的LC流出物引入MS以便获得最大的灵敏度； 或者需让待测物在此接口获得有效的浓缩； MS的差速抽真空系统可容许引入约50nL/s的液体流动相 。,解决方法：,扩大MS真空系统的抽气容量 在引入真空系统之前除去溶剂 牺牲灵敏度分流流出物 使用可在较低流量下有效工作的微型LC柱,这些策略之一或它们的结合可用于LC-MS接口。,LC/MS Interfaces （LC/MS接口）,Background of LC/MS Historical Perspective Reasons for use Interfaces Transport devices Particle Beam Thermospray Atmospheric Pressure Interfaces,1. Historical Perspective,Goldstein 1886 Existence of positively charged particles Wein 1898 Positively charged ions can be deflected in electrical and magnetic fields J.J. Thomson 1913 Demonstrated isotopes of Neon “Father of mass spectrometry” First GC-MS interface - 1960s,Historical Perspective,First LC-MS interface developed - 1969 1L/min flow into an EI source Transport devices applied to LC/MS - 1970s Loss of volatile components Thermally-reactive compound losses Thermospray (TSI) gains popularity - 1983 1.0 1.5 mL/min Mobile phases consist primarily of an aqueous buffer,Historical Perspective,Atmospheric Pressure Interfaces (API) Early 1990s (commercialization) Now most common interface Electrospray (ESI) Initial interfaces required lower flows (1-5 L/min) Able to produce multiply-charged molecules Atmospheric Pressure Chemical Ionization Similar to Thermospray “Solvent-mediated” ionization,2. Why Use Mass Spectrometry?,Spectral resolution is possible Chromatographic coelutions Compound identification from spectral data Mass spectrum is very dependant on the ionization Limited availability of LC/MS libraries High degree of specificity,3. Components of an MS Detector （MS检测器的组成）,Ions Made,Ions Selected,Ions Detected,4. LC/MS Systems,5. Ion Sources （离子源）,Analytes must be charged (ions) Needed to separate and detect Where ionization occurs In the interface In a separate ion source Types of ionization “Hard” - considerable fragmentation “Soft” - molecular ion is main product Ions can be positive or negative,(1) Requirements of LC/MS Interfaces LC/MS接口的要求,Elimination of the mobile phase Most difficult step Can use splitters Volatilized solvent vapor removed under vacuum Often where ionization occurs Vacuum required by mass analyzers,(2) Challenges in Interfacing LC to MS,Flow Rate Concerns Differential pumping can only handle 2 L/min of water For maximum sensitivity, want to use all of the eluent Use of Buffers and Additives Non-volatile buffers a concern Some additives suppress ionization Wide Range of Analytes Many are nonvolatile, thermally labile,(3) Transport Devices 传送装置,One of the first commercial interfaces Sample deposited onto a moving belt or wire Sample passes through multiple vacuum zones Solvent elimination Sample is desorbed into source using heat Electron impact ionization Belt/wire cycles back,Moving Belt Interface,From: Niessen,(4) Particle Beam Interface （PB，粒子束接口）,Column effluent is nebulized Pneumatic or thermospray nebulization Desolvation chamber is under a moderate vacuum A momentum separator is used for analyte enrichment High MW compounds favored Analytes into the EI or CI source as small particles Evaporative collisions with the walls,Particle Beam Interface,Analyte Enrichment in PB Interfaces 分析物在PB接口中富集,Analyte enrichment with a molecular beam approach Heavier molecules are in the core of the vapor jet and are sampled through the skimmer,在常压下（借助气动雾化）产生气溶胶； 气溶胶扩展进加热的去溶剂室蒸发掉残余的溶剂，待测分子在动量分离器与溶剂分离。 释放出的气态待测分子即可用所选的方法（主要为EI或CI）进行离子化。,粒子束（PB）接口,能够获得像气相色谱一样且可用图库检索的EI谱是PB接口的最有价值的优点 PB-LC-MS可产生像气相色谱一样的可用图库检索的EI谱 其效率强烈地依赖于所生成的气溶胶的均匀性 。 因为气溶胶的大小分布越窄，动量分离器工作得越好,粒子束（PB）接口,PB接口虽然应用广泛，但在其它方面的应用中，例如在环境分析中，仍存在一些不足： 检出限不适当（ng绝对范围） 灵敏变化范围大（即便对结构类似的化合物也这样） 缺乏较宽浓度范围内线性响应 两种化合物的协同洗脱会对响应产生不可预测的效应 带PB接口的LC-MS已将GC-MS的应用扩展到了更多极性和较高分子质量的化合物，但这似乎也已被其他的接口取代了。,(5) Thermospray Interface （TSP，热喷雾接口） 溶剂是通过在加热毛细管中形成喷雾的办法而被蒸发的,Nebulization of the eluent from a heated transfer tube Uses a “reagent gas” Mobile phase buffer Added buffer solution Similar spectra to GC/MS CI Reagent gas is ionized Volatilization EI with high energy electrons Charge transfer to the analyte(s),Thermospray Interface,Effectively replaced transport systems Ionization in a medium pressure environment Approx. 1000 Pa or 0.01 atm Inlet flows of 1 to 2 mL/min Can use standard LC column flows Positive and negative ions are possible Temperature optimization is critical Maintain gas phase,Thermospray LC/MS System,From: McMaster and McMaster,HPLC柱的流出物 电阻加热毛细管蒸发器 在毛细管的出口端形成雾滴小于1m的气溶胶，此气溶胶则直接扩展进加热的离子化室。 为了除去引入MS系统的流量达2mL/min的含水溶剂，需有一个容量非常大的抽气系统。,待测物的离子化可通过以溶剂为媒介的化学离子化或通过热喷雾离子化过程来完成 化学离子化：用喷雾电极（或细丝）的电子完成。它先由溶剂分子产生试剂气，再由试剂气将电荷转移给待测物。 热喷雾离子化：以含挥发性缓冲剂的微滴的离子蒸发机理为基础。,Thermospray Modes of Operation 热喷雾运行模式,Solvent-Mediated CI Typical mobile phase: MeOH or MeCN + 0.1M NH4OAc Ionization by ion evaporation (pre-formed ions) or ion-molecule reactions Discharge or Filament On Mode High energy electrons (0.5-1 keV) ionize the reagent gas Ion-molecule reactions,由于两种离子化方式中的任何一种均属软电离，因此只能导致有限的碎裂； 为了从TSP-LC-MS分析中获得特征的碎片谱，常使用串联的四极质谱仪 TSP-LC-MS中进行的离子化是软离子化，碎裂程度较小，因此只能提供有限的结构信息 与单个的四极质谱仪不同，MS/MS仪器允许人们获得被第一个四极选定了的分子离子的碎片谱。该离子被带小孔的截取器取样后直接进入离子化室，这样人们就可获得进行离子分离所需的高真空。,Thermospray Ionization 热喷雾电离,Positive Ion Mode M + SH+ MH+ + S PA(M) PA(S) M + SH+ MHS+ PA(M) PA(S) Negative Ion Mode M + S-H M-H + S gpa(M) gpa(S) M + A MA polar molecules gpa = gas phase acidity,Typical Proton Affinities 质子亲和力,From: Niessen,热喷雾接口（TSP）,再过去几年里，TSP接口已获得了极大的成功。由于可使用通常的流量和大多数常用的缓冲剂（只要它们是挥发性的），因而通常的HPLC方法都容易被采用。 然而，似乎较新的常压离子化法正在逐渐取代TSP，这是因为前者较耐用且往往具有较高的灵敏度。,(6) Atmospheric Pressure Ionization常压离子化（API）技术,在讨论过的所有接口中，存在一个共性，即离子化发生在低压区 TSP或CI: 典型压力11000Pa； EI: 典型压力10-2Pa 在下面讨论中所提出的技术中，离子化在常压下发生。 在所有常压离子化（API）技术中，离子化均发生在常压区,常压离子化（API）技术,这是为LC和MS联用而发展起来的最初技术之一，但在常压离子化（API）技术发展成很可能是最通用的一组接口和样品引入技术之前，它整整花了20多年的时间。 API这一术语意味着三种不同的技术，其区别主要在于它们的喷雾原理，即加热雾化、电子喷雾和离子喷雾接口。,a. Electrospray Interface 电喷雾接口,High electric potential applied to eluent from transfer capillary Atmospheric pressure Droplet formation Ionization in the solution phase Orthogonal sampling of ions Reduces contamination of the sampling orifice Z-Spray devices,Electrospray Interface,Higher flows now possible Pneumatic + thermal nebulizers Applicable to volatile and nonvolatile analytes Need to be ionizable Can create multiply-charged ions Allows for analysis of large molecules,Electrospray LC/MS System,From: McMaster and McMaster,Electrospray Interface,Electrospray Needle Design 电喷雾针构造,Example of an electrospray needle design (coaxial flow) The nebulizer gas disrupts the liquid surface so that small droplets are formed and then dispersed by the gas,Theory of API Electrospray API电喷雾理论,Agilent 1100 LC/MSD Electrospray,Courtesy of Agilent Technologies,Electrospray Interface,Best vaporization with higher % organic and lower flow rates Cluster ion formation possible Solvent clusters Analyte/salt clusters Salts and sample impurities can affect the response TFA causes signal suppression TFA anion masks the analyte ion,电喷雾接口（ESI）,可在相当低的流量下工作，其典型流量为1 10 L/min 电喷雾接口通过使用强电场去溶剂和使待测物离子化，常常可产生大分子的多电荷离子 离子化过程：包括将液流雾化成高度带电微滴的气溶胶以及在此带电微滴去溶后待测分子的离子化,来自色谱柱的样品经分流后引入常压去溶剂室，或经过一注入器件（不锈钢皮下注射针头）直接引入常压去溶剂室。 针头接地后，把一个强电场（2 5kV）加到圆柱型对电极上，该电极就可对从针头中流出来的液体表面进行充电，产生带电微滴的细雾。 受电场驱动，微滴通过氮气干噪气帘。该气帘具有保持溶剂蒸发的能力，也可阻止未带电荷的物质进入离子源。 借助于气帘的膨胀，离子被带过一个毛细管进入第一级抽气泵的真空中，再进一步通过各级抽气泵和透镜系统，最后进入质量分析器。,ESI系统中离子形成的机理仍在讨论中。 简单的解释为：气溶胶被充电到一定程度后，微滴实际上可被库仑排斥力炸碎成更小的微滴，此小微滴最后蒸发而产生高度带电荷的分子。 自从观察到生物分子（肽和蛋白质）可形成多电荷离子以来，电喷雾LC-MS系统已受到了很大的注意。 因此有可能用简单的、可传送离子达2000质荷比的四极质谱仪，以测量分子质量达100000u以上的蛋白质。,ESI的主要缺点： 只能接受非常小的液体流量（110L/min）,b. 离子喷雾接口（ISP）,这一缺点已被1987年研制出来的离子喷雾接口（ISP）所克服 离子喷雾接口是一种借助气动的电喷雾接口，它可适应较高的流速 ISP接口是将电喷雾器雾化和气动雾化结合在一起，因此常被称为气动协助或高流速电喷雾。 最初，流速只能扩展到约50 L/min。改进后（例如使用干噪气帘），可引入达2 mL/min。 能够处理具有高含水量的流动相，并且可用梯度洗脱系统进行工作。,c. APCI Interface,Atmospheric Pressure Chemical Ionization Initially investigated in 1974 Popular in late 1980s Uses an API (ESI) source Column effluent nebulized into heated vaporizer tube Solvent vapor acts as a reagent gas Charge transfer to the analytes Can be very sensitive,APCI Interface,Results in a chemical ionization spectrum M+H+ or M-H Products depend on equilibrium (concentration) conditions Analytes must have sufficient proton affinities May be simplest interface to operate Liquid flow rates of 0.2-2.0 mL/min Solv+H+ + M Solv + M+H+,APCI Interface,APCI Probe (Heated),The vaporizer tube temperature is optimized for complete transfer to the vapor state,Theory of APCI,Agilent 1100 LC/MSD - APCI,Agilent 1100 LC/MSD APCI Ion Source,Corona Needle,Vaporize into the gas phase and ionize the gas with a discharge,API-ES vs. APCI for Triamterene,在加热雾化器或常压化学离子化（APCI）接口中，离子化机理与中压化学离子化的机理相同，试剂气离子通常利用电晕放电形成 在APCI中，电晕放电维持了通过溶剂分子的化学离子化 正离子或者通过质子转移、加合物的形成而形成，或者通过电荷抽出反应而形成。 负离子则通过质子抽出、阴离子附着或电子捕获反应生成。,传统（中压）CI和APCI所得到的质谱稍有区别 解释： APCI中离子的形成是一个平衡过程，而在中压CI中，离子的形成是一个被动力学控制的过程。 与中压CI相比，APCI过程中一个重要优点是可获得理论上的灵敏度。由于在较高的压力下离子分子相互作用具有较高的反应效率。 然而，APCI并未能获得34个数量级灵敏度的增加，这是由于在较高压力下，离子通过质谱分析器的传送效率明显降低。,典型的加热雾化器接口由同心的气动雾化器组成，从这里气溶胶直接进入石英管和不锈钢管。借助附加的辅助气流气溶胶被带过加热管，然后进入API源，在那里被电晕放电引发，发生APCI过程。 另一种设计采用逆流的干噪气，导致对流。据说这些系统可使用非挥发性缓冲剂，因为不带电荷的（非）挥发性材料可被逆流的干噪气带走。即便此离子源需经常清洗，但清洗操作可在不切断真空的情况下进行。 与热喷雾接口相比，APCI也相当耐用且操作简便，因为它可处理流量达2mL/min的水溶液流出物。,d. Optimizing Mobile Phases for API-MS API-MS流动相的优化,Ion-Pair Agent Alternatives Use highly bases-deactivated silica columns Use low pH (3-4) to reduce tailing Use columns that retain based on polar interactions (e.g. CN, IBD) Using Ion-Pair Reagents Use low amounts (0.02%) Use post-column addition to negate the effect of the ion-pair agent,(7) Sample Considerations for LC/MS 样品的要求,The Analyte Must Have Ionizable Groups Amines Carboxylic Acids Ketones, Aldehydes For Best Sensitivity, Work at a pH Where the Analyte is Ionized Neutral to basic pH (7-9) for acids Acidic pH (3-4) for bases,Sample Considerations for LC/MS,Positive Ion Mode Analyte = (M+H)+ Negative Ion Mode Analyte = (M-H) Basic Compound Sensitive in Positive Ion Mode Acidic Compound Sensitive in Negative Ion Mode,(8) Selecting an Interface 接口的选择,“Advances in LC/MS”, Waters Corporation, Milford, MA.,Electron Ionization (EI),Analytes Suitable for EI Small molecules with rings and double bonds Compounds that would need derivatization for GC/MS Pesticides, PAHs, natural products Compound Identifications Fragmentation is possible Poor Detection Limits Will Not Tolerate Non-Volatile Buffers,Comparison of API vs. EI, Atmospheric Pressure Ionization (API) MW confirmation Good for fragile compounds Able to fragment in the source Low (ppb) LODs in SIM mode, Electron Ionization (EI) Ionization occurs in a vacuum Standard libraries are available Classical EI spectra (similar to GC/MS) Higher LODs (ppm to high ppb),Atmospheric Pressure Ionization (API),Electrospray Ionization (ESI) Uses Solution Phase Ionization Atmospheric Pressure Ionization (APCI) Uses Gas Phase Ionization Products are M+H+ and M-H, adducts Suitable for Analyzing Drugs, Small Molecules, Dyes, Peptides Good Sensitivity Thermal Degradation is Possible (APCI),Adduct Formation with API 加合物的生成,Adducts can form between polar molecules and sample or solvent components. For example, adducts with Na+, K+, NH4+, MeOH, MeCN, and H2O are common.,Electrospray Ionization,+ Good molecular weight information, including high MW compounds + Can be used for volatiles, nonvolatiles, ionic/polar compounds + Good sensit