核桃蛋白肽的抗氧化活性研究.pdfVIP

A N D F E R ME N T A T 1 0 N I N D US T R 核 桃 蛋 白肽 的抗 氧化 活 性研 究 刘 昭明， 黄 翠姬 ， 孟 陆丽， 黄娟娟 ， 周文武 ( 广西工学院生物与化学工程系 ， 广西 柳州 ， 5 4 5 0 0 6 ) 摘 要 以 Vc为对照， 研究 了分子质量小于 3 O 0 0 u的核桃 蛋 白肽 混合 物的还 原能力、 羟 自由基清除能力 、 超氧 阴离子 自由基清除能力以及二苯代苦味酰基 自由基清除 能力。结果 显示 ， 随着核桃 蛋 白肽 浓度 的增 加， 其还 原 能力、 羟 自由基 的清除能力和超 氧阴离子清 除能力增 大， 在 浓度 为 3 O mg mL 时， 核桃蛋 白肽还原 能力达 到 V 的 5 7 1 ； 在浓度为 5 O mg mL时， 核桃蛋 白肽对羟 自由基( OH ) 的清除率分别 6 9 1 ， 对超氧 阴离子 自由基 的清除率达 到 了8 5 。而对二苯代苦 味酰基 自由基清 除能力则是先 增大后 变小 ， 在 2 0 mg mL时达到最 大值 6 6 。核桃 蛋 白肽 的分子质量分布主要有 2大 区域， 蛋 白肽氨基酸含量达到 8 9 7 4 。 关键词核桃蛋 白肽 ， 抗氧化活性， 自由基 生物活 性肽一 般 由 3 2 O个氨基 酸构 成 ， 其 生理 活性 功能包 括促进 营养 吸收 ， 提高免疫 力 ， 调节 神经 ， 抗氧化 ， 降血压和抗菌等口 。生物活性肽显示的各种 生理 活性功 能 与肽 的氨 基 酸组 成 与 序列 有 关 。在 食品工业中， 脂肪的氧化是影响食 品的风味、 质构和 外观 的主要 因素 3 ， 具有抗 氧化 活性 的生物 活性 肽可 能是潜 在 的天然 、 安全 、 高效 的抗氧 化剂 。此 外 ， 人 体在新陈代谢过程中产生的过量的 自由基会对机体 产生损伤 ， 为避免自由基造成的机体伤害， 防止疾病 ， 在膳 食 中加 入具 有抗 氧化功 能 的外源性 抗氧化 物质 ， 可能会对促进人类健康， 延年益寿有重要的作用。 已有 的研究 表 明 ， 抗氧化 生物 活性 肽具有 清 除体 内 自由基 的功 能 ， 也是 一种 潜在 的可 以利用 的外 源性 抗 氧化物 质 5 。近年 来 ， 有关 食 品蛋 白质 水解 制备 抗 氧化 活性 肽 的研 究 逐 步 增 多 。核桃 仁 是传 统 的保 健 食 品 ， 含 有 2 O 左 右 的蛋 白质 。本 试 验 是 以核 桃 蛋 白为底 物 ， 采用 碱性 蛋 白酶水 解 核 桃 蛋 白 ， 经 超 滤 和 脱 盐工 序后 ， 制得 分 子质 量小 于 3 O O O u的核 桃 蛋 白 肽混合 物 ， 对 其还 原能力 、 羟 自由基清 除 能力 、 超 氧 阴 离 子 自由基清 除能 力 以 及二 苯 代苦 味酰 基 自由基 清 除能力 进行 了研究 。 1 材料 与方法 1 I材料 与试 剂 核桃蛋 白质 ， 自制 ， 蛋 白 质含 量 7 5 ； 碱 性 蛋 白 酶 Al c a l a s e 2 4 L， 丹麦 No v o公 司 ； 大孔 树脂 D A2 0 1 第一作者 ： 硕 士， 副教授 。 *广西区教育厅科研立项项 目( 2 0 0 7 0 8 L X 1 8 4 收稿 日期 ： 2 0 0 8 0 8 1 4 ， 改回 日期： 2 0 0 8 1 1 1 4 5 8 l !： 曼 殳 - ! ! ! ! 一 C， 江 阴市有 机化 工 厂 ； 葡 聚糖 凝 胶 S e p h a d e x G一 2 5 ，S i g ma 公 司 。其它试 剂均 为分 析纯试 剂 。 1 2主要 仪器 与设备 超级恒温槽 ， 上海精密仪器有限公司； 高速离心 分离 机 ， 上 海 手术 机 械 厂 ； 电子 天 平 ， 梅 特 勒一 托利 多 仪器 ( 上 海 ) 有 限公 司 ； L X J I I 型 离 心机 ， 上海 医分 仪器制 造有 限公 司 ； UV mi n i 1 2 4 0紫外 可 见分 光 光 度计 ， 日本 岛 津公 司 ； 氨 基 酸 自动 分 析 仪 ， 美 国 Ag i l e n t 公 司 。 1 3实 验方 法 1 3 1核桃蛋 白木 瓜蛋 白酶 水解 物 的制备 称取 一定量 的 核桃 蛋 白 ， 按 照 酶 解 条件 ( 底 物浓 度 4 ， 酶浓 度 1 5 0 0 u g ， p H 值 8 0 ， 温 度 4 0 ) 进 行 水解 。在 水 解 的 过 程 中 不 断 滴 加 0 5 mo l L 的 Na OH 溶 液 ， 使 p H 值 稳定 在 8 0 。水解 4 h后 ， 沸 水 浴 灭酶 1 0 mi n ， 冷却 后用 1 mo l L HC I 调 酶解 液 p H 值 到 7 ， 在 3 0 0 0 r mi n下 离心 1 5 mi n ， 将 获得 的上清 液采用截 留分 子质 量为 3 0 0 0 u的 聚砜 膜进 行 超 滤 ， 收集滤 过 液 ， 再 采 用 大 孔 树 脂 D A2 0 1 C对 滤 过 液 进行脱 盐处 理 ， 最 后 经 真 空浓 缩 和 冷 冻 干燥 ， 得 到分 子质量 分 布在 3 0 0 0 u以下 的核 桃蛋 白肽 产 品 。 1 3 2 抗 氧化 活性 试验 1 3 2 1 核桃蛋 白肽的还 原能 力测 定 6 在 1 mL各 浓度样 品 ( 空 白用 1 mL蒸馏 水 代替 ， 其他试剂依次同下 ) 中， 加入 2 5 mL质量分数为 1 的铁 氰 化 钾 溶 液 和 2 5 mL 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( p H 6 6 ， 0 2 too l L ) ， 混匀 后在 5 0 保 温 2 0 mi n ， 然后加 入 2 5 mL质量 分数 为 1 O 的三 氯 乙酸 ， 混 和 后 以 3 0 0 0 r mi n离心 1 0 mi n ， 取 上清 液 2 5 mL， 加入 2 5 mL蒸馏水 和 0 5 mL质量 分 数为 0 1 的 F e C 1 s ， 混 匀后在 7 0 0 n m 波 长下 比色 ， 记 录 吸 光 度值 。 以 Vc 作为对 照 。吸光 度值越 大则样 品 的还 原能力 越强 。 1 3 2 2 核桃 蛋 白肽 的羟 自由基 ( OH ) 清 除能 力 的测定 采 用 邻 二 氮 菲一 F e 。 氧 化 法 7 。 (1 )取1 5 mmo l L的邻二 氮菲溶 液 1 mL于试 管 中 ， 依 次加 入 磷酸盐 缓 冲液 P B S ( 0 2 mo l L ， p H7 4 ) 2 mL和蒸馏 水 1 mL、 0 7 5 mmo l L硫酸亚铁 液 1 mL， 充分混 匀 ， 加体 积分数为 0 0 1 9 5 的 H。 O 1 mL， 于 3 7 下恒 温 反应 4 5 rai n ， 于 5 3 6 n m 处测 其 吸 光度 ( A ) ， ； ( 2 ) 同 前步 ， 惟其 中用 1 mL蒸馏水 代替 H 0 ， 测得 的 吸光 度称 AB ； ( 3 ) 用试样 液 1 mL代替 ( 1 ) 中的 1 mL蒸馏 水 ， 测 得到 吸光度称 A ； OH 自由基 清除 率 计算 公 式 如下 ： 清 除 率 一 会 S 1 o 0 1 3 2 3 核桃蛋 白肽 的超 氧 阴离 子 自由基 ( o ) 的清除能 力的测定 采用邻 苯 三 酚方 法【 5 。在 一 系 列 的试 管 中加 3 mL 0 0 5 mo l I 的 Tr i s HC 1 缓 冲液 ( p H8 2 ) ， 分别 加入待 测 样 品溶 液 1 0 0 L ， 空 白组 加 入 同体 积 蒸馏 水 ， 再加入 1 0 0 L的 0 4 5 mo l L邻苯 三 酚溶 液 ， 振 荡并计 时 ， 3 rai n时 ， 立 即 加 入 1 0 0 L质 量 分 数 为 3 的抗 坏血 酸 溶 液 ， 振 荡 ， 终 止反 应 ， 在 3 2 5 n m 处 测 吸光度 A。以空 白的吸光 度 为 A ， 加 样 品溶 液 时 的吸光度 为 A样， 自由基清 除率计算 ： 清除率 一 生 A _ 兰1 0 0 1 3 2 4 核 桃 蛋 白肽 对 二 苯 代 苦 味 酰基 自由基 的 ( D P P H ) 的清除 能力 的测 定 将 2 mL无 水 乙醇 与 2 mL 2 0 retoo l L的 D P P H 乙醇溶液 加入 同一 试 管 中 ， 摇 匀 ， 放 置 3 0 mi n ， 用 无水 乙醇作 参 比于 5 1 7 n m 处 测定 其 吸光 度 A ； 测 定 样 品 清 除 能 力 时 ， 将 2 mL 样 品 与 2 mL 2 O mm o l I 的 D P P H 乙 醇 溶 液 混 匀 于试 管 中 ， 静 置 3 0 rai n后 ， 以同浓 度 样 品 液作 为参 比测 定 其 吸光 度 A样。 自由基清除率 按下 列公式计 算 ： 清除率 一 1 0 0 1 3 3 核桃 蛋 白肽 的分子 质量分 布测 定 采用 S e p h d e x G一2 5凝胶层 析柱 ( 1 2 c m8 0 c m) ， 以 0 1 mo l L， p H 8 0的磷酸盐 缓 冲液洗脱 ， 洗 脱速度为 0 5 mL mi n ， 每管收集 1 mL洗 脱 液 ， 测 定 各 管 的O D。 。 。 。 标 准 分 子 量 物 质 采 用 杆 菌 酶 ( M 1 4 5 0 ) 和谷 胱甘 肽 ( Mw 3 0 7 ) 。 1 3 4核桃 蛋 白肽的氨 基酸组 成分析 在 适量 核桃 蛋 白肽 中加 入 6 mo l L HC 1 溶 液 ， 真空封口， 在 1 1 O下水解 2 4 h ， 冷却后定容、 过滤 ， 采用 氨基酸 自动 分析 仪 进 行氨 基 酸组 成 分 析 。色谱 条件 ： 柱 温 ： 4 O ， 流 速 ： 1 0 mL mi n ， 紫外 检 测 器 ： 3 3 8 nm 。 2 62 n m 2 结果 与讨论 2 1 核桃 肽 的还原能 力 为便 于 比较 ， 将不 同浓度 的核桃蛋 白肽 的还原 能 力 与对应 浓度 的 V 的还原 能力 进 行 比较 ， 结果 见 图 1。 Vc 口核桃蛋白肽 L l 1 0 1 O 5 l 5 1 0 20 3 O 浓度 ra g mL 。 。 图 1核桃 蛋 自肽 的 还 原 能力 从 图 l中可 以看 出 ， 在 试 验浓 度范 围 ， 随着 核 桃 蛋 白肽 浓度 的增 加 ， 其 还原 能 力增 强 。但 是 V 的 还 原 能力 在浓 度达 到 0 5 mg mL 之前 ， 其 还原 能力 随 浓 度 的增加而 增大 ； 0 5 mg mL之后 ， 其 还原 能力 则 有 缓慢 下 降 的趋 势 。在 浓 度 为 3 0 mg mL 时 ， 核 桃 蛋 白肽 还原能力 达到 V 的 5 7 1 。 2 2核 桃蛋 白肽的羟 自由基 ( OH ) 清 除能力 在浓 度 1 O 5 0 mg mL ， 比较 了 核 桃 蛋 白肽 和 V 对羟 自由基 ( oH ) 清除能力 ， 如 图 2所示 。 、 褥 j!弯 图 2 核桃 蛋白肽对羟 自由基的清除能力 从 图 2中可 以看 出， 随着 浓 度 的增 大 ， 核 桃 蛋 白 肽 和 Vc 对 羟 自由基 ( OH ) 清除 能力 均增 大 。在相 生 蔓 查 蔓! 塑 f 璺 曼 墅 塑 ! I 5 9 0 5 O 5 0 5 O 3 2 2 l l O O 一 ；岛f J 一 D AN D F E R ME N T A T 1 0 N I N D U 同 的浓度点 ， 二者 对 羟 自由基 ( 0H ) 清 除能 力 基 本 相 同 。在浓 度为 1 0 mg mL时 ， 核 桃蛋 白肽 和 V 对 羟 自由基 ( OH ) 的清 除率 分别是 4 8 1 和 5 0 0 ， 在浓 度为 5 0 mg mL时 ， 核桃 蛋 白肽 和 V 对 羟 自由 基 ( OH ) 的清 除率分 别 6 9 1 和 6 7 2 。 2 3核桃 蛋 白肽 的超 氧 阴离 子 自由基 ( o ) 的 清 除能力 在浓 度 1 O 5 O mg mL， 比较 了核 桃 蛋 白 肽 和 V 对超氧 阴离 子 自由基 的清 除能 力 ， 见 图 3 。 l 2 0 堡 8 0 爵 蜒4 0 图 3 核 桃 蛋 白肽 对 超 氧 阴 离 子 的 清 除作 用 从 图 3可见 ， 在试验测定的范围内， V 对超氧阴 离子 自由基 的清除率基本一致， 达到 了 9 9 。随着 浓度 的增 大 ， 核桃 蛋 白肽对超 氧 阴离子 自由基 的清 除 能力 逐步增 大 ， 在 浓度 为 5 0 mg mL 时 ， 核 桃 蛋 白肽 对超 氧 阴离 子 自由基 的清 除率 达 到 了 8 5 。 2 4核 桃 蛋 白肽 的二 苯 代 苦 昧 酰基 自由基 ( D P P H ) 清 除能力 在浓 度 l O 5 0 mg mL， 比较 了核桃 蛋 白肽和 V 对 二苯代 苦味 酰基 自由基 ( D P P H ) 的清 除能 力 ， 见 图 4。 80 60 堡 篓4 0 蜒 2 0 0 0 20 40 浓度 mg mL 图 4 核桃蛋 白肽对 D P P H 自由基 的清 除作用 由图 4可知 ， V 对 D P P H 自由基 的清 除 率 基 本保持不变 ， 其清除率在 7 3 左右。核桃蛋 白肽对 DP P H 自由基的清除率先是随浓度升高而增大 ， 但 在 2 0 mg mL时达 到 最 大 ， 为 6 6 。然 后 ， 随浓 度 的 升高， 其对 D P P H 自由基的清除率减小。 2 5核 桃 蛋 白肽 的分子 质量分 布 I 6 0 2 0 0 9 V O 1 3 5 N o 1( T o t a l 2 5 3 ) I 采 用 S e p h d e x G 一 2 5凝 胶 层 析 ， 得 杆 菌 酶 ( Mw 1 4 5 0 ) 和谷 胱 甘肽 ( Mw 3 0 7 ) 的洗脱 体 积分 别 为 2 3 mL和 4 4 mL， 质 量浓度 为 1 核桃 蛋 白肽 的凝 胶 层 析 图谱 见 图 5 。 2 0 30 40 50 60 7 0 洗脱体积 m L 图 5 S e p h a d e x G一2 5 凝胶层析测核 桃 蛋 白肽的分子质量分布 从图 5可知 ， 核桃蛋 白肽在洗脱体积 3 8 mL和 5 3 mL有 最大 的洗脱 峰 ， 说 明核桃 蛋 白肽 的分子 质量 主 要 分 布 在 2个 范 围 。与 标 准 分 子 量 的 杆 菌 酶 ( Mw 1 4 5 0 ) 和谷胱 甘 肽 ( Mw 3 0 7 ) 的洗 脱 体 积 比较 可 知 ， 核 桃蛋 白肽 的分 子质 量 在 1 4 5 0 u以上 的有 一 部 分 ， 而分子 质量在 3 0 7 u和 1 4 5 0 u之 间 的则 占 了稍 大 比例 。 2 6核桃 蛋 白肽 的氨基 酸组成 采用 氨基 酸 自动分 析 仪 测 定 核桃 蛋 白肽 氨基 酸 组成 ， 结果 见表 1 。 表 1 核 桃 蛋 白肽 的 氨 基 酸 组成 g 1 0 0 g 氨基酸种类 含量 氨基酸种类 含量 天冬氨酸 5 5 9 异亮 氨酸 3 4 6 苏氨酸 7 4 5 亮 氨酸 6 3 4 丝氨酸 4 2 8 酪氨酸 2 1 1 谷氨酸 1 7 8 8 苯丙氨酸 9 1 2 甘氨酸 3 0 9 赖氨酸 4 5 6 丙氨酸 3 2 2 组氨酸 2 5 4 胱氨酸 1 3 5 精氨酸 5 8 1 缬氨酸 3 2 9 脯氨酸 7 2 5 蛋氨酸 2 4 0 合计 8 9 7 4 从 表 1中可 知 ， 核桃蛋 白肽 中的氨基 酸含量 达到 8 9 7 4 ， 说 明水 解 制得 的蛋 白肽 中 的氨基 酸 或 肽含 量 较高 ， 纯度较 好 。 3 结论 采 用碱性 蛋 白酶水解 核桃 蛋 白质 ， 获得分 子质 量 小 于 3 0 0 0 u的核桃 蛋 白肽 具 有 一 定 的抗 氧 化 能力 。 随着核桃蛋白肽浓度的增加， 其还原能力 、 羟 自由基 的清除 能力 和 超 氧 阴离 子 清 除 能 力 增 大 ， 在 浓 度 为 3 0 mg mL 时 ， 核 桃 蛋 白 肽 还 原 能 力 达 到 V c 的 m 吣 嘶 琶 j O 0 0 O O O 0 O O 5 7 1 ； 在浓 度 为 5 0 mg mL时 ， 核 桃蛋 白肽对 羟 自 由基( OH ) 的清 除率 为 6 9 1 ， 与 V 的清 除效 果 相当 ， 对超 氧阴离 子 自由基 的清 除率 达到 了 8 5 ， 此 时 ， 与 V 的清 除能力 为 9 9 。核桃蛋 白肽对二 苯代 苦 味酰 基 自由基 清 除能 力 则是 先 增 大后 变 小 ， 在 2 O m g mL时 达 到 最 大 值 6 6 ， 而 V 的 清 除 能 力 为 7 3 左 右 。核桃 蛋 白肽 的分 子质 量 分 布 主要 有 2大 区域 ， 其 氨基酸含 量达到 8 9 7 4 。 参 考 文 献 1 Ch e n J ， S u e t s u n a K ，Ya ma u c h i F I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f i mmu n o s t i mu l a t i v e p e p t i d e s f r o m s o y b e a n l J J o u r n a l o f Nu t r i t i o n Bi o c h e mi s t r y ，1 9 9 5 ( 6 )： 3 1 0 3 1 3 2 J e J a eYo u n g ，Qi a n Z h o n g J i ，B y u n He e - Gu k ，e t a 1 P u r i f i c a t i o n an d c h ar a c t e r i z a t i o n of a n a nt i ox i da nt pe p t i d e ob t a i ne d f r om t u na b a c k bo ne p r ot e i n by e n z y ma t i c hy dr ol y s i s I- J q P r o c e s s B i o c h e mi s t r y ，2 0 0 7 ，4 2 ： 8 4 0 8 4 6 3 Ra j a p a k s e N，Me n d i s E，By u n H G，e t a 1 P u r i f i c a t i o n a n d i n vi t r o an t i ox i da t i v e e f f e c t s o f g i a nt s qu i d mu s c l e p e pt i de s o n f r e e r a d i c a l me d i a t e d o x i d a t i v e s y s t e ms E J J o u r n a l o f Nut r i t i o n Bi oc he mi s t r y，2 00 5， 16：56 2 56 9 4 L i Ya n h o n g，J i a n g B o，Z h a n g Ta o ，e t a 1 An t i o x i d a n t a nd f r e e r a di c a l s c a v e ng i n g a c t i vi t i e s of c hi c k pe a pr ot e i n h y d r o l y s a t e( C P H) J F o o d C h e mi s t r y ， 2 0 0 8 ， 1 0 6 ： 4 4 4 45 O 5 吴建 中 大豆蛋 白的酶法 水解及产 物抗氧化 活性的研究 D 广州 ： 华南理工大学博士学位论文 ， 2 0 0 3 6 He Ye n hunFe r e i d o on Sh a hi di Ant i ox i da n t a c t i v i t y o f g r e e n t e a a n d i t s c a t e e h i n s i n a f i s h me a t mo d e l s y s t e m E J J Ag r i c F o o d Ch e m， 1 9 9 7 ， 4 5： 4 2 6 2 4 2 6 5 7 Che n H M ，M ur a mo t o K，Ya ma u c hi F，e t a 1 Ant i ox i da t i v e pr op e r t i e s o f h i s t i di ne - e on t a i n i n g p ep t i de s d e s i gn e d f r o m p e p t i d e f r a g me n t s f o u n d i n t h e d i g e s t s o f a s o y b e a n p r o t e i n E J 3 J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e mi s t r y ， 19 9 8，4 6： 4 9 5 3 8 Che n H M ，M u r a mot o K，Ya ma ue h i F，e t a1 An t i ox i d a nt a c t i v i t y of de s i gn pe p t i d e s b a s e d o n t he a nt i ox i da n t pe pt i de i s o l a t e d f r o m d i g e s t s o f a s o y b e a n p r o t e i n l- J J o u r n a l o f Ag r i c u l t u r a l a n d Fo o d Ch e mi s t r y ，1 9 9 6 ，4 4：2 6 1 9 2 6 2 3 9 朱艳华 ， 谭军 玉米多肽抗氧化作用研究 J 中国粮油学 报 ， 2 0 0 8 ， 2 3 ( 1 ) ： 3 6 4 3 S t u d y o n t h e An t i o x i d a t i v e Ac t i v i t y o f W a l n u t Pe pt i d e L i u Z h a o mi n g ， Hu a n g C u i j i ， Me n g L u l i ， Hu a n g J u a n j u a n ， Z h o u We n wu ( De p a r t me n t o f B i o l o g i c a l a n d Ch e mi c a l E n g i n e e r i n g，Gu a n g x i Un i v e r s i t y o f Te c h n o l o g y，Li u z h o u 5 4 5 0 0 6 ，Ch i n a ) ABSTRACT The r e duc i n g a b i l i t y a nd hy d r ox y l ，s u pe r ox i d e r a di c a l s c a v e n gi ng a c t i v i t y a nd DPPH s c a v e n gi n g a c t i v i t y o f wa l nu t pe pt i d e s wh os e mo l e c ul a r we i gh t i s l o we r t ha n 3 00 0 we r e o b s e r v e d，a n d c o mpa r e d wi t h t ho s e of