蛹虫草虫草素和虫草多糖综合提取工艺的研究.pdf

科技信息专题论述 1.前言 蛹虫草 C o r d y c e p s m i l i t a r i s ( L ) L i n k . 又称蛹草、 北虫草、 北冬虫夏草， 为真菌界子囊菌亚门（A s c o m y c o t a ） 、肉座菌目 ( H y p o c r e a l e s ) 、麦角菌 （C l a v i c i p i t a c e a e ） 的虫草属， 是一种虫生真菌， 与冬虫夏草同属异种 1 。 蛹虫草由虫体与从虫头部长出的真菌子座相连而成， 虫体似蚕， 长 3 - 5 c m ， 直径 0 . 3 - 0 . 8 c m； 表面深黄色至黄棕色， 有环纹 2 0 - 3 0 个， 近头 部的环纹较细； 头部红棕色， 足 8 对， 中部 4 对较明显； 质脆， 易折断， 断 面略平坦， 淡黄白色。 子座细长圆柱形， 长 4 - 7 c m ， 直径约 0 . 3 c m ； 表面深 棕色至棕褐色， 有细纵皱纹， 上部稍膨大； 质柔韧， 断面类白色。 气微腥， 味微苦 2 。蛹虫草在世界各地分布广泛， 我国的吉林、 河北、 四川、 湖南、 湖北、 山西等省均有生长。 其子座于春至秋季在半埋于林地上或腐枝落 叶层下的鳞翅目昆虫蛹上长出 3 。 蛹虫草主要有效成分虫草素， 结构为 3 -脱氧腺苷， 结构与腺苷相 似替代腺苷。 虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素， 分子 量为 2 5 1 D ， 熔点 2 3 0 - 2 3 1 ， 溶于水、 热乙醇和甲醇， 不溶于苯、 乙醚和 氯仿， 紫外光的最大吸收波长为 2 5 9 n m 4 。虫草多糖被认为是一种活性 物质， 关于其结构和生物合成已有一定的研究。 虫草多糖的生物合成已 经得到了初步的研究， 不同培养方式的多糖产率有一定的差异， 可以通 过优化培养条件来提高多糖的产量。虫草多糖产业化生产已成了研究 的热点之一 5 。 蛹虫草作为传统珍贵中药材， 我国人民对其药用价值早有认识。 蛹虫草人工栽培成功以来，药理和毒理等方面的研究得到了广泛 的开展。研究表明蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的作用， 无毒副作用， 近年来， 随着人们对蛹虫草的滋补保健功效和多种药用价值的认识， 其 开发利用研究倍受关注， 并在药理、 有效成分及人工栽培等各方面取得 了很大的进展。 蛹虫草是一种具有滋补作用的中药和营养品， 其所含的虫草素、 虫 草多糖具有独特的药理及保健功效： 虫草素具有抗病毒、 抑菌、 明显抑 制肿瘤生长， 与环磷酰胺有明显的协同作用， 并有降血糖的作用； 虫草 多糖具有提高机体免疫功能、 免疫调节， 抑制肿瘤作用、 降血压、 抗衰 老、 抗疲劳、 调节内分泌、 抑菌、 抗病毒等多种药理作用， 长期以来被视 为珍贵的强壮滋补中药和藏药。 近年来蛹虫草受到了广泛关注， 并大面积地种植开发， 近年来蛹虫 草人工培养及其活性成分的研究才活跃起来, 而人工培养已有大量药 品、 保健食品上市。为了更好地开发利用蛹虫草资源， 本研究采用正交 试验对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取工艺进行了深入研究， 为 进一步开发利用提供有价值的参考数据，也将会对今后产品开发研究 具有重要的意义。 2.材料与方法 2 . 1 实验材料、 仪器及试剂 2 . 1 . 1 实验材料 蛹虫草粉末: 由江苏虫草种植基地提供， 先用样品均在 7 0 下真空 低温干燥 5 - 6 h ， 干燥后粉碎研成粉末， 装瓶备用。 2 . 1 . 2 主要仪器与设备 高效液相色谱仪： 日本 H I T A C H I ( 由 L - 7 1 1 0 液压恒波泵、 L - 7 4 2 0 紫外可见光检测器) ， N 2 0 0 0色谱工作站 V a r i a n2 7 0 0C 1 8不锈钢柱； E a s y p u r R F 超纯水器； 真空恒温干燥器： P B - I A型， 天津市光学仪器厂技术开发公司； 三用恒温水浴箱： H H - 4 型， 江苏金坛荣华仪器公司； 循环水式多用真空泵： S H B - B 9 5 型， 郑州长城科工贸有限公司； 分光光度计： U V - 2 6 5 型， U V - 7 2 1 日本岛津仪器有限公司； 旋转薄膜蒸发器： R E - 5 2 A型， 上海申科机械研究所； 电子天平： B P 2 1 1 - D型， 北京赛多利斯仪器有限公司； 超声波清洗器： K Q一 6 0 0 型， 巩义市英峪予华仪器厂； 超声萃取器： H S 3 1 2 0 型， 宁波新芝科学仪器研究所； 真空减压提取罐： 5 0 L - 2 0 0 0 型, 无锡市雪浪化工设备厂。 2 . 1 . 3 主要试剂 9 5 %乙醇： 武汉市江北化学试剂厂; 9 9 . 5 %甲醇： 杭州化学试剂厂; 9 9 . 5 %丙酮： 武汉市江北化学试剂厂; 磷酸盐: 天津市化学试剂三厂; 浓硫酸: 武汉市江北化学试剂厂; 苯酚： 武汉市江北化学试剂厂; 无水葡萄糖: 天津市科密欧化学试剂开发中心; 虫草素对照品： 上海化学试剂公司进口分装； 纯水( 用超纯水器制备， 电导率 1 0 - 8 M) 样品 1 ： 野生蛹虫草子座( 抚顺产) ； 样品 2 ： 以大米为培养基质的人工栽培蛹虫草子座； 样品 3 ： 以蚕蛹为培养基质的人工栽培蛹虫草子座； 样品 4 ： 长满了蛹虫草菌丝的大米培养基； 样品 5 ： 深层发酵的蛹虫草菌丝； 以上 5 种样品均干燥后研成粉末 待测。 以上试剂均为分析纯。 2 . 2 实验方法 2 . 2 . 1 分析测试方法： 用高效液相色谱法 （H P L C ） 测定虫草素含量 6 2 . 2 . 1 . 1 高效液相色谱条件 色谱柱： Cl 8柱( 4 . 6 m m 2 5 0 m m ， 5 m ) ； 流动相： 磷酸盐缓冲溶液 ( p H 6 . 5 ) -甲醇( 8 5 : 1 5 ) 流速 1 m L / m i n ； 紫外检测波长 2 6 0 n m ， 在此条件下， 虫草素保留时间为 1 1 . 3 m i n 。 2 . 2 . 1 . 2 标准溶液的配制 用电子天平称取虫草素对照品适量， 置于容量瓶中， 加 5 0 %乙醇水 溶液， 超声波振荡溶解， 定容， 配制成浓度为 5 0 . 5 g / m L标准储备液备 用， 使用时加 5 0 %乙醇稀释液。 2 . 2 . 1 . 3 样品处理 蛹虫草样品 6 0 真空干燥 2 h ， 粉碎过 4 0 目筛( 0 . 3 6 m m ) 。准确称取 干燥样品粉末 0 . 5 g 置具塞锥形瓶中， 准确加入甲醇 3 0 m L ， 称定， 超声波 振荡 3 0 m i n ， 补足失重， 滤过， 弃去初滤液， 准确吸取续滤液 1 m L ， 置1 0 m L 量瓶中， 甲醇定容。 2 . 2 . 1 . 4 样品分析 吸取对照品和样品溶液各 1 0 L注入高效液相色谱仪，记录色谱 蛹虫草虫草素和虫草多糖综合提取工艺的研究 沈阳信天翁医药有限公司祁波 摘要 蛹虫草 （Cordycepsmilitaris ） 在我国本草文献中已有记载。近年来的研究更进一步证实了蛹虫草与冬虫夏草 C. sinensis有相 同或相似的化学成分和药理作用,是可供开发的新产品,并可以之作为冬虫夏草的替代品。现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营 养价值， 而且有明显的药用价值。 其中尤以虫草素、 虫草多糖等多种生物活性物质的药用价值最为显著。 虫草素是一种具有抗菌活性 的核苷类物质， 对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。 在 DNA转录 mRNA过程中使 mRNA成熟障碍， 抑制癌细胞的生长。 并 有降血糖的作用。 虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖， 它能促进淋巴细胞转化， 提高血清 IgG 的抗体含量和机体的免疫功能， 增强机体自身抗癌抑癌的能力。 因此分离纯化虫草素和虫草多糖， 对此类抗癌药物的开发具有很大社会价值和意义。 本次研究以蛹 虫草粉末为原料， 研究了蛹虫草中虫草素和虫草多糖的综合提取工艺技术， 探讨了采用超声波水提法、 超声波醇提法、 水热回流法和 醇热回流法 4 种提取方法， 选择虫草素和虫草多糖的最优提取办法。并通过用正交试验方法研究考察了水热回流法中提取温度、 提 取次数、 提取时间、 料液比 4 个因素对虫草素和虫草多糖综合提取效率的影响。建立了从蛹虫草中综合提取虫草素和虫草多糖的最 佳工艺。采用正交试验对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取工艺进行了研究， 为进一步开发利用提供有价值的参考数据， 也将会 对今后产品开发研究具有重要的意义。 关键词 蛹虫草虫草素虫草多糖提取工艺正交试验法 7 0 9 科技信息 图， 外标法以峰面积计算样品中虫草素的含量。 2 . 2 . 2 分析测试方法： 用苯酚一硫酸法测虫草多糖含量 7 2 . 2 . 2 . 1 蛹虫草多糖的提取 蛹虫草样品均取研成的粉末 1 0 g ， 用水提醇沉法提取， 即加 1 0 倍量 的水 1 0 0 水浴煎煮 1 h ， 重复 3 次。提取液过滤、 浓缩至 1 : 1 ( g / m L ) 加 3 倍量的乙醇使其沉淀。 倾出上清液， 沉淀加水溶解， 加稀乙醇使沉淀、 离 心， 取出上清液， 继续加乙醇放置。倾出上清液， 沉淀依次用乙醇、 无水 乙醇冼涤、 过滤、 低温干燥， 即得多糖粗品。将提取的多糖粗品， 置于 l 0 m L 量瓶中， 加重蒸馏水溶解， 并稀释到刻度， 摇匀、 备用。 2 . 2 . 2 . 2 溶液的配制 用电子天平称取 8 0 g 重蒸苯酚， 置于容量瓶中， 加入 2 0 m L重蒸馏 水， 配制成 8 0 %苯酚溶液。 2 . 2 . 2 . 3 标准曲线的制作 吸取葡萄糖标准液( 1 0 0 g / m L ) 0 , 0 . 1 , 0 . 2 ， 0 . 3 ， 0 . 4 ， 0 . 6 ， 0 . 8 ， 1 m L分 别加入到各试管中。用重蒸馏水补足至每管 2 m L 。使各管葡萄糖含 量分别为 0 ， 1 0 ， 2 0 ， 3 0 ， 4 0 ， 6 0 ， 8 0 ， 1 0 0 g ， 各管加 0 . 0 5 m L8 0 苯酚溶 液， 再加入浓硫酸 5 m L ( 勿沿管壁加入， 以便使样品与硫酸快速混匀) ， 静置 1 0 m i n ， 3 0 水浴 1 5 m i n 。在 4 9 0 n m波长处测各管的 O D值。 糖 浓度为横坐标，各管的 O D值为纵坐标作标准曲线，其回归方程为 Y = 0 . 0 6 2 5 X - 0 . 0 6 8 9r = 0 . 9 9 9 0 线性范闹为： 1 0 g / m L 6 0 g / m L 。 2 . 2 . 2 . 4 样品测定 取 2 m L稀释的待测样品（糖浓度控制在 1 0 g / m L 6 0 g / m L之 间 ） ， 加入试剂量和操作方法同制作标准曲线， 测其 O D值， 在标准曲线 上， 求得多糖相当的量， 再计算出样品含糖量。 2 . 3 单因素确定虫草素最佳提取方法 2 . 3 . 1 水热回流提取法 取蛹虫草粉末 2 . 5 g ， 用 5 0 m 1 蒸馏水于 9 5 - 1 0 0 热回流提取 2 h ， 重 复提取 3 次， 合并滤液， 用蒸馏水定容至 2 0 0 m l 。 2 . 3 . 2 醇热回流提取法 取蛹虫草粉末 2 . 5 g ， 用 5 0 m 1 的 5 0 %乙醇 8 0 热回流提取 2 h ， 重复 提取 3 次， 合并滤液， 用 5 0 %乙醇定容至 2 0 0 m l 。 2 . 3 . 3 超声波水提法 取蛹虫草粉末 2 . 5 g ， 用 5 0 m l 蒸馏水， 超声波提取 3 0 m i n ， 重复提取 3 次， 合并滤液， 用蒸馏水定容至 2 0 0 m l 。 2 . 3 . 4 超声波醇提法 取蛹虫草粉末 2 . 5 g ， 用 5 0 m l 的 5 0 %乙醇， 超声波提取 3 0 m i n ， 重复 提取 3 次， 合并滤液， 用 5 0 %乙醇定容至 2 0 0 m 1 。 2 . 4 单因素确定虫草多糖最佳提取方法 2 . 4 . 1 水热回流提取法 取蛹虫草粉末 1 0 . 0 g ， 用 l 0 倍量蒸馏水 9 5 - 1 0 0 热回流提取 2 h ， 重 复提取 3 次， 合并滤液， 减压浓缩至 1 : 1 ( w / v ) ， 冷却后加入 3 倍量乙醇使 其沉淀， 浸出上清液， 沉淀再加少量水溶解， 加入 2 倍量使其沉淀， 重复 3 次， 将最后的沉淀物用蒸馏水溶解， 并定容于 5 0 m 1 容量瓶中( 用于测 定虫草多糖) 。以上乙醇上清液合并， 并用水定容至 2 0 0 m 1 ( 用于测定虫 草素) 。 2 . 4 . 2 醇热回流提取法 取蛹虫草粉末 1 0 . 0 g ， 用 1 0 0 m l 的 5 0 %乙醇 8 0 热回流提取 2 h ， 重 复提取 3 次， 合并滤液， 减压浓缩至 1 : 1 ( w / v ) ， 冷却后加入 3 倍量乙醇使 其沉淀， 浸出上清液， 沉淀再加少量水溶解， 加入 2 倍量使其沉淀， 重复 3 次， 将最后的沉淀物用蒸馏水溶解， 并定容于 5 0 m 1 容量瓶中( 用于测 定虫草多糖) 。以上乙醇上清液合并， 并用水定容至 2 0 0 m 1 ( 用于测定虫 草素) 。 2 . 4 . 3 超声波水提法 取蛹虫草粉末 1 0 . 0 g ， 用 1 0 0 m l 蒸馏水， 超声波提取 3 0 m i n ， 重复提 取 3 次， 合并滤液， 减压浓缩至 1 : 1 ( w / v ) ， 冷却后加入 3 倍量乙醇使其沉 淀， 浸出上清液， 沉淀再加少量水溶解， 加入 2 倍量使其沉淀， 重复 3 次， 将最后的沉淀物用蒸馏水溶解， 并定容于 5 0 m 1 容量瓶中( 用于测定 虫草多糖) 。以上乙醇上清液合并， 并用水定容至 2 0 0 m 1 ( 用于测定虫草 素) 。 2 . 4 . 4 超声波醇提法 取蛹虫草粉末 l g ， 用 1 0 0 m l 的 5 O %乙醇， 超声波提取 3 0 m i n ， 重复 提取 3 次， 合并滤液， 减压浓缩至 1 : 1 ( w / v ) ， 冷却后加入 3 倍量乙醇使其 沉淀， 浸出上清液， 沉淀再加少量水溶解， 加入 2 倍量使其沉淀， 重复 3 次， 将最后的沉淀物用蒸馏水溶解， 并定容于 5 0 m l 容量瓶中( 用于测定虫 草多糖) 。以上乙醇上清液合并， 并用水定容至 2 0 0 m l ( 用于测定虫草素) 。 2 . 5 虫草素和虫草多糖最佳提取条件 用正交试验法 L9( 3 4 ) 对水热回流提取法中 4 个因素( 提取温度 A 、 提 取次数 B 、 提取时间 C及料液比 D ) ， 分别取 3 水平对虫草素、 虫草多糖 综合提取的影响， 以确定最佳提取条件。 L9( 3 4 ) 正交试验条件因素( 见表 1 ) 。 表 1正交试验条件因素 2 . 6 统计分析 超声波水提法、 超声波醇提法、 醇热回流提取法和水热回流提取法 分别进行 5 次( n = 5 ) 平行实验， 进行 R S D分析， 并对得率平均值进行相 对比较， 确定综合提取最佳方法； 在最佳方法提取中以 L9( 3 4 ) 正交试验 的方差分析法， 确定综合最佳提取条件。 3.结果与分析 3 . 1 4 种提取方法结果比较 根据以上单因素确定的结果， 分别用水热回流提取法、 醇热回流提 取法、 超声波水提法、 超声波醇提法对虫草素最佳提取条件进行研究测 定， 并计算得率 （结果见表 2 ） 。 表 2提取方法对虫草素得率的影响( n = 5 ) 由表 2 的得率和相对标准偏差结果可以看出， 4 种提取方法都可用 于虫草素的提取， 与其它 3 种方法相比， 超声波醇提法较优， 提取效率 分别高出 4 . 3 5 %、 7 . 2 5 %、 1 1 . 5 9 %， 说明 4 种方法对虫草素的提取效率基 本一致。 根据以上单因素确定的结果， 分别用水热回流提取法、 醇热回流提 取法、 超声波水提法、 超声波醇提法对虫草多糖最佳提取条件进行研究 测定， 并计算得率 （结果见表 3 ） 。 表 3提取方法对虫草多糖得率的影响( n = 5 ) 表 4 正交表 L9( 3 4 ) 及结果 水平编号 A提取温度 ( ) B提取次数 C提取时间 ( m i n ) D料液比 ( w / v ) 16 026 01 : 1 0 28 039 01 : 2 0 31 0 041 2 01 : 3 0 水热回流 提取法 醇热回流 提取法 超声波 水提法 超声波 醇提法 得率( %)0 . 1 2 20 . 1 2 80 . 1 3 20 . 1 3 8 相对标准偏差 R S D ( %)2 . 1 31 . 8 22 . 4 41 . 6 8 水热回流 提取法 醇热回流 提取法 超声波 水提法 超声波 醇提法 得率( %)4 . 0 20 . 0 80 . 8 90 . 0 4 相对标准偏差 R S D ( %)1 . 7 62 . 4 22 . 1 02 . 3 9 序号ABCD虫草素得率( %) 虫草多糖得率( %) 1 n 11110 . 1 2 03 . 0 2 2 n 12220 . 1 2 43 . 2 8 3 n 13330 . 1 2 83 . 4 7 4 n 21230 . 1 2 83 . 6 9 5 n 22310 . 1 3 03 . 8 2 6 n 23120 . 1 3 13 . 9 8 7 n 31320 . 1 1 03 . 8 6 8 n 32130 . 1 1 74 . 0 2 9 n 33210 . 1 1 44 . 1 8 G= 1 . 1 0 23 3 . 3 2 G T = 0 . 1 3 4 9 3 41 2 3 . 3 5 8 0 0 0 专题论述 7 1 0 科技信息 由表 3 的得率和相对标准偏差结果可以看出，水热回流提取法对 虫草多糖提取优于其它 3 种方法，提取效率比其它 3 种方法分别高出 9 8 . O 1 %、 7 7 . 8 6 %、 9 9 . 0 0 %， 说明超声波水提法、 超声波醇提法和醇热回 流提取法均不利于虫草多糖的提取。 综合分析表 2 、 表 3 结果可以看出， 水热回流提取法既有利于虫草 多糖的提取， 又有利于虫草素的提取， 因此对蛹虫草中虫草素和虫草多 糖的综合提取应选择水热回流提取法。 3 . 2 虫草素、 虫草多糖综合提取条件选择 用水热回流提取法进行 4 因素 3 水平正交实验 L9( 3 4) ， （结果见表 4 ） 。 3 . 2 . 1 用水热回流提取法进行虫草素得率直观分析和虫草素得率方 差分析，（结果见表 5 和表 6 ） 。 表 5虫草素得率直观分析结果 注： K 各因素某一水平结果之和； k 各因素某一水平结果之和平均值； 角标号 1 - 3 各因素实验水平； G 所设计 9 组实验得率结果之和； （其中 R = ( K 2 1+ K 2 2+ K 2 3) / 3 ； T = G 2 / 9 ； 偏差平方和 S = R - C T ） 表 6虫草素得率方差分析结果 注： F0 . 0 1 ( 2 . 2 )= 9 9 ； F0 . 0 5 ( 2 . 2 )= 1 9 . 0 ； F0 . 1 ( 2 . 2 )= 9 . 0 e 为误差； * 为显著； * * 为极显著。 由表 5 和表 6 直观分析及方差分析结果可以看出： R值由大到小 依次为 A 、 B 、 D 、 C因素， 其中 A因素有极显著意义 （F F0 . 0 1) ， B因素有 显著意义 （F0 . 0 5 F0 . 0 1) ， B因素有显著意义 （F0 . 0 5 F F0 . 0 1) ， C因素和 D因素无显著 性意义( F F0 . 1) 。考查对虫草多糖得率影响时， A 、 B因素仍为主效因素， 即对虫草多糖得率影响最大的为提取温度、 提取次数、 提取时间及料液 比则为次要因素，不同于对虫草素得率影响的是在次要因素水平上略 有差异。根据各因素是 k 的变化率选出影响虫草多糖得率最佳因素搭 配为 A2B2C2D2。 在综合提取虫草素、 虫草多糖时， 从以上表中和分析中可以看出： 影响虫草素、 虫草多糖得率的主效因素是提取温度 A 、 提取次数 B ， 而 提取时间 C及料液比 D影响较小。 因此综合提取时， 考虑到提取效率以 及经济可行，在保证主效因素水平时将提取时间 C及料液比 D分别选 择水平 2 和 1 。 所以其综合提取最佳条件为 A2B2C2D1， 即用 1 0 倍量的水 于 8 0 热回流提取 3 次， 每次 9 0 m i n 。 表 7虫草多糖得率直观分析结果 表 8虫草多糖得率方差分析结果 4.结论与讨论 本实验研究了采用超声波水提法、 超声波醇提法、 水热回流法和醇 热回流法 4 种提取方法选择虫草素和虫草多糖的最佳提取工艺。虫草 素、 虫草多糖是蛹虫草中最主要的 2 种有效成分， 在单项利用中应考虑 其综合提取， 以充分利用蛹虫草资源， 减少不必要的损失。 水热回流提取法既有利于虫草多糖的提取，又有利于虫草素的提 取，因此对蛹虫草中虫草素和虫草多糖的综合提取应选择水热回流提 取法。 由于 5 0 %乙醇不利于多糖的提取； 虽然超声波提取法具有加速植 物中有效成分进入溶剂， 增加提取率等诸多有利因素， 但在实验中由于 多糖提取温度是主要影响因子，而超声波所产生温度仅能达到 5 0 左 右， 这不利于多糖溶解， 从而排除了超声波水提法、 超声波醇提法和醇 热回流提取法。 用水热回流提取法对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取的最佳 条件为 1 0 倍量的水于 8 0 热回流提取 3 次， 每次 9 0 m i n 。实验结果表 明此条件下提取效率高和省时、 节能。 参考文献 1 赵克蕊,王维亨.冬虫夏草的药理作用 J .植物药分册， 2006,21 (3):105- 108 2 雷万生,谢联斌.蛹虫夏草的研究 J .海军医学杂志， 2006,(3): 262- 269 3 陈俐彤曹红峰黄文芳.蛹虫草的化学成分、 药理及应用 J 现 代食品科技， 2005， 21(3):192- 194,197 4 林群英,宋斌,李泰辉.蛹虫夏草研究进展 J .微生物学通报， 2006,33:(4):154- 157 5 李刚,朱华素,毛先兵.蛹虫草中虫草素分离纯化工艺研究进展 M .重庆中草药研究， 2006,1:51- 54 6 马丽影,张铭,李润文.人工蛹虫草子实体中虫草素的含量测定 J .中国中医杂志， 1997,25 （10 ） :489 7 可世麟,赵春柱.苯酚 - 硫酸比色定糖法的应用 J .生物化学与 生物物理进展， 1986, （5 ） :68- 69 数据来源ABCD K10 . 3 7 20 . 3 5 80 . 3 6 80 . 3 6 4 K20 . 3 8 90 . 3 7 10 . 3 6 60 . 3 6 5 K30 . 3 4 10 . 3 7 30 . 3 6 80 . 3 7 3 k10 . 1 2 4 0 0 00 . 1 1 9 3 3 30 . 1 2 2 6 6 70 . 1 2 1 3 3 3 k20 . 1 2 9 6 6 70 . 1 2 3 6 6 70 . 1 2 2 0 0 00 . 1 2 1 6 6 7 k30 . 1 1 3 6 6 70 . 1 2 4 3 3 30 . 1 2 2 6 6 70 . 1 2 4 3 3 3 K 2 1+ K 2 2+ K 2 3 0 . 4 0 5 9 8 60 . 4 0 4 9 3 40 . 4 0 4 8 0 40 . 4