RNA提取及常见失败原因.ppt

,研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT-PCR、cDNA 库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。,Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。,目的,主要试剂,1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带手套，样品尽可能盖严； 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。 2-8 避光保存一年。,准备工作,RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。,2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。,3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。,处理的步骤如下：,在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37 或室温下处理过夜。,将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。 灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。,（2） 玻璃和金属物品250 烘烤3小时以上。,DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。,DEPC(二乙基焦碳酸酯),实验步骤如下：,1. 取50100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。 2. 将匀浆室温放置5 min。 3. 加入200 l 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3 min。 4. 12000 rpm，4 离心15 min。 5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 l ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）,6. 12000 rpm， 4 离心15 min 。 7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。 8. 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 l乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的） 9. 8000 rpm，室温离心10min。 10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。 11. 真空离心干燥35分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。 12. 沉淀用30 l DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 处理10 min。,13. RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm