课件：湘南学院分子生物学基因治疗.ppt

基 因 治 疗,随着近代医学的发展，分子生物学的研究和应用已 经逐渐进入临床医学领域。基因治疗是80年代末出现的 一种新的治疗技术。我国基因治疗研究专家顾健人教授 将基因治疗的发展划分为三个历史阶段，即1980-1989 年的“准备期”、1990-1995年的“狂热期”和1996年之后 的“理性期”。1990年的首例基因治疗获得了成功，为现 代治疗学开辟了一条新途径。目前，国际上已有100多 个基因治疗方案。,第一节 基因治疗的概念与分类 一、基因治疗的概念 基因治疗(gene therapy)是以基因转移为基础， 将某种遗传物质导入患者细胞内，使其在体内表达 并发挥作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。 基因治疗导入的遗传物质： 1.与缺陷基因对应的、在体内表达具有特异功能的 同源基因； 2. 与缺陷基因无关的治疗基因或其它遗传物质。,二、基因治疗分类 1. 生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy) 对缺陷的生殖细胞进行基因矫正 生殖细胞基因治疗的可能对象遗传病。 用显微注射的方法将正常基因导入遗传病患者的 生殖细胞，特别是在受精卵细胞分化之前，可望在其后代不患这种遗传病。 生殖细胞基因治疗，由于对后代遗传性状会有影响，从而对人类的发展也有着深远影响，涉及医学研究活动中的伦理道德问题。 因此，目前对于生殖细胞的基因治疗研究仅限于动物，不考虑人类。,2. 体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)。 将遗传物质导入患者体细胞，以达到治疗疾病的目 的，其基因信息不会传至下一代。 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 目前临床上已采用的基因治疗方案均属于体细胞基因治疗，如对SCID (重症联合免疫缺陷病 （severe combined immunodeficiency) 病人的治疗。,第二节 基因治疗的总体策略 一、基因治疗的总体策略 通过在适当的“靶细胞”中有效表达重组目的基因片段, 实现基因治疗。 原则：1.致病基因的原位置换 2.基因的异位替代 3.直接抑制有害基因的表达 4.增强机体免疫能力的基因治疗,（一）基因替代和基因矫正治疗 基因替代以正常基因原位替代缺陷基因 （或变异基因）。 基因矫正将致病基因的异常碱基序列进行 纠正，而正常部分予以保留。 这两种策略最为理想，因为它们均是对缺陷基 因精确地原位修复，而不涉及靶细胞基因组的其它 变化。 然而由于技术原因，目前还只停留在细胞 水平的同源重组的研究阶段，离临床实际应用尚 有较长距离。,（二）代偿性基因治疗 通过对有代偿功能的基因的正调控， 开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。 例如： 用某些作用剂提高或珠蛋白基因的 表达以治疗地中海贫血。,（三）基因补偿性治疗 指将目的基因导入病变细胞或其他细 胞，不去除异常基因，而是通过目的基因 的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因 的功能或使原有的功能得以加强。 目前基因治疗多采用此种策略， 因为从理论上讲，基因补偿并不去除或 修正原有的变异基因，故相对来讲较容易。,（四）基因失活性治疗 将特定的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和 核酶(ribozyme)导入细胞，在翻译和转录水平阻断某些 基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。,（五）调控性基因治疗 通过导人编码调控蛋白的基因以治疗 基因表达异常的疾病， 例如： 以野生型P53基因治疗肺癌或急性白血病。,（六）应用“自杀基因”的基因治疗 将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码 的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物， 诱导靶细胞产生“自杀”效应，达到清除肿瘤细胞 的目的。 常用的有：HSV-tk基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶、 （EC-CD）基因等。 将“自杀基因”导入肿瘤细胞，该基因表达产物即 可催化无毒性的药物前体转变成细胞毒物质， 从而杀死肿瘤细胞；而正常细胞不含这种外源基因， 故不受影响。目前此种策略已被批准进入临床。,（七）免疫修饰性基因治疗 导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫 力的基因以达到治疗的目的。 例如： B7共刺激分子基因及各种淋巴细胞因子基因的导入和表达、直接注入抗原基因等。 此种策略花样繁多，已被批准进入临床。,（八）特异性细胞杀伤性基因治疗 利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的“神奇弹头(magic bullet)”，“弹头”部分是通过分子重组的各种生物来源的细胞毒素。 如：1.假单胞菌绿脓杆菌外毒素 (pseudomonas exotoxin，PE)、 2.白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、 3.蓖麻毒蛋白、 4.天花粉以及真菌毒素-sarcin等， 它们以酶催化方式发挥抑制蛋白合成的作用， 造成细胞杀伤，其毒性很强。,（九）生殖细胞基因治疗 生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗。 它是更为有效的基因矫正方式，但因涉及技术复 杂，受伦理道德的限制，目前只在动物实验中使 用，尚不能应用于临床。,基因治疗的两条途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,体外途径,体内途径,选择适宜的基因载体和基因转移系统,获得目的基因,合理选择靶细胞,外源基因表达的筛检,回输体内,第三节 基因治疗的基本程序,一、获得目的基因 目的基因的来源： 1.含目的基因的供体细胞的基因组DNA 2. 经限制性内切酶消化后的DNA片段、 3. 预先分离克隆的基因、经RT-PCR扩增得到 的 cDNA、人工合成的DNA片段。 其中分离克隆基因是目前获得目的基因最为 常用的一种方法。,二、合理选择靶细胞 已被应用的靶细胞： 淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、 角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、 肝细胞、肌细胞、肿瘤细胞等。,在选择基因治疗靶细胞时，综合考虑以下因素 1.发病的器官及位置 可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病 变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。 例如：在肝脏病的基因治疗中， 可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞； 在肝癌的基因治疗中，也可选择肝癌组织中浸润 的淋巴细胞作为其靶细胞； 有时甚至肿瘤细胞也可作为靶细胞的候选对象。,2. 靶细胞应容易取出和移植 基因治疗的一般常规途径是：将靶细胞从体内取 出，经基因转化后再移植回人体内，目的基因在体 内特定部位得到表达，以达到基因治疗的目的。 这就要求靶细胞容易从体内取出和植回人体。最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞。,3. 靶细胞容易在体外培养 作为基因治疗的靶细胞要求在体外培养的条件 下容易存活，而且要有一定的分裂和自我更新能力， 因为一般情况下基因治疗要求的转染细胞数量在108 以上。 但目前常用的几种基因转移方法其效率不同， 逆转录病毒载体包装细胞系基因转移系统效率最高， 但也不总是能够达到100%。因此，在实际应用中， 要求靶细胞的数量要大于这个数字。,4. 对靶细胞容易实现基因转化 将目的基因转移入靶细胞的手段包括物理法、 化学法、融合法及病毒载体法四大类。 目前广泛应用且前景广阔的基因转移方法： 病毒载体介导途径。,5. 靶细胞应具有较长的寿命 基因治疗，特别是某些单基因遗传缺陷性 疾病的基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、 稳定的表达，甚至是终生的。 因此，必须使基因治疗的靶细胞具有较长的寿命。 体内许多干细胞能够满足这一条件。,三、选择适宜的基因载体和基因转移系统 目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒 载体两大类。 在基因治疗的临床实施中，一般多选用病毒载体。在体外实验研究中，将目的基因导入哺乳动物细胞的方法有两类： 非病毒介导的基因转移 病毒介导的基因转移 在实际应用中不同方法各有优缺点。,（一） 非病毒介导的基因转移方法 1. 物理方法 1）显微注射法： 利用显微注射仪，将目的基因直接注入 靶细胞，其转化效率高。但所需设备昂贵。 2）电穿孔法： 利用外部高压短脉冲作用使受体细胞膜出 现瞬间可逆性孔隙，允许一定大小的DNA分子 进入细胞。具有简便、快速、对质粒DNA纯度 要求不高等优点，但高压电击可杀死部分细胞， 故只能在体外进行。,3）显微注射法和微粒子轰击（又称基因枪）法： 显微注射法是在显微镜直视下，向细胞核内 直接注射外源基因，这种方法应是有效的。,不需要进行基因工程的繁琐操作， 直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。,动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 * 将促进心脏血管生长的基因直接注入 实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细 血管增加30%40%； * 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细 胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； * 肌内注射凝血因子基因，可产生血 友病所需的凝血因子等等。,2.化学方法 1） DNA-磷酸钙共沉淀法： DNA与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞 的内吞作用进入细胞质，然后再进入细胞核并整合到染色体上。 该法的优点： 目的基因的制备较容易，不必构建复杂的载体。 不足之处： 转移效率低，一般1000100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。,受体介导转移技术示意图,2019/8/7,33,可编辑,脂质体介导的基因转移示意图,3）脂质体-DNA复合物法： 脂质体是由脂质双层分子组成的环形封闭囊泡，无毒、无免疫原性，DNA被包裹于中。这种脂质体外壳可使DNA保持完整，通过一种内吞噬过程进入细胞。,（二） 病毒介导的基因转移 以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。 使用的病毒载体： *经过改建的有复制缺陷的病毒。 （缺失了其自身复制所必需的一些基因） *插入了治疗性基因或一些基因的调控成份 (如启动子和增强子)。 目前在基因转移中所使用的病毒主要有以下几类。,1）逆转录病毒（Retrovirus，RV）载体 RV是小的单股RNA病毒，是目前基因转移中应用 最为广泛的一类病毒。 逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。 转染后，前病毒基因组(经逆转录后形成的DNA) 可与靶细胞基因组随机整合，因而能较稳定地表 达外源基因。,* 只能转染处于增殖状态的细胞，对静止期细胞无效。 * 所携带的外源基因不能太大，否则会影响病毒的效 价和稳定性。 * 理论上讲，从包装细胞释放出来的复制缺陷的逆转录 病毒，只能一次性感染靶细胞，不会扩散到其它细胞。 但在某种情况下，也会造成野生型病毒的爆发。 * 由于病毒的基因组是随机整合到靶细胞基因组的， 因而具有致细胞癌变的可能。,该类载体也有一定的缺陷，表现在：,2）腺病毒（Adenovirus, AV ）载体 AV双链DNA病毒,约38kb。通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。,腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,腺病毒的优点,*基因导入效率高，对人类安全；,*宿主范围广；,*基因转导与细胞分裂无关；,*重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,*腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；,3）腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体 AAV 属于微小病毒家族成员，是一类小的单链 DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病 性，需辅助病毒(常为AV)存在时才能复制。AAV可感 染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。大部分AAV 基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。,AAV的特点,*以潜伏感染为主； *病毒基因组与细胞共存； *只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态； *若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制； *产生子代病毒并释放，又感染新的细胞,（ 四）外源基因表达的筛检 在体外培养细胞中，基因转化效率很难达到100%， 故需利用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。 在较多的表达载体中都有neor（抗新霉素）标记基因的存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞则因不存在neor标记基因而不能存活，最后只有转化细胞存活下来。 在筛选出转化细胞后仍需检测转化细胞中外源基因的表达状况。只有稳定表达外源基因的细胞在病人体内才能发挥治疗效应。,G418:氨基糖苷类抗生素, 是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。 通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成。 当neo基因被整合进真核细胞DNA后, 启动neo基因编码的序列转录为, 从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达, 使细胞获得抗性，而能在含有418的选择性培养基中生长。,（五） 回输体内 将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式 回输体内以发挥治疗效果， 如：淋巴细胞可以静脉回输入血； 造血细胞可采用自体骨髓移植的方法； 皮肤成纤维细胞经胶原包裹后可埋入皮 下组织中等等。,第四节 基因治疗的应用研究,第一例基因治疗 腺苷脱氨酶（ ADA）缺乏症,1990年9月4日美国国立卫生研究院 Blaese博士对一位患ADA缺乏症的4岁女孩进行首例基因治疗。 该病是一种ADA单基因功能缺陷的遗传性疾病。多见于儿童，发病率在欧美为十万分之一，亚洲较 少见。 临床表现为严重免疫功能低下。 ADA是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，它使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸排出体外。当腺苷脱氨酶缺乏时，脱氧腺苷不能脱氨，在淋巴细胞内大量堆积，造成其死亡，机体免疫功能缺乏。,位于20号染色体的ADA基因缺陷 ADA酶缺乏 脱氧腺苷不能脱氨而含量增高 对淋巴细毒性或淋巴细胞死亡 免疫球蛋白合成减少和细胞免疫削弱,ADA缺乏症治疗步骤： （体外基因修饰骨髓移植法） 1、麻醉下，从病人髂嵴抽取骨髓液， 分离淋巴细胞。 2、将病人的淋巴细胞与携带ADA基因 的逆转录病毒混合培养，经病毒转移 ADA 基因进入淋巴细胞。,3、清洗淋巴细胞；去除多余的病毒筛选带 有ADA基因的淋巴细胞，检测其ADA含 量，确定ADA基因在淋巴细胞中有满意 表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回 病人体内。 4、密切观察病人各项免疫指标的变化，必 要时重复。 该女童共接受了7次自体细胞输注，其ADA水平稳定升高，从不到正常人的1增至25，转移的ADA基因在体内长时间持续表达。免疫功能增强，临床症状改善，基本恢复正常。,SCID病人的治疗,ADA基因缺陷临床治疗的潜在问题： 淋巴细胞是ADA缺乏症基因治疗的常用靶细 胞，但淋巴细胞的寿命为一个月到数个月不等， 随着转染淋巴细胞的死亡，ADA表达量下降， 必要时重复基因治疗。 选择寿命长的骨髓造血干细胞。,法国成功地治疗了5例患儿，但不久发现 这些患儿出现了类白血病症状而被迫停止。,近来，来自美国、意大利和奥地利的科学家们联合 公布了一项关于ADA缺乏症基因治疗试验的最新研究成果。 研究者们对10名有严重的联合性免疫缺陷症的ADA缺乏症 患进行了基因治疗。 他们将携带有ADA基因的逆转录病毒转导至患者自体 CD34+骨髓细胞，并将这些细胞重新输回患者体内。 在经过平均4年的随访后，所有转导的细胞均稳定存在于 血液中并分化成含有ADA的骨髓细胞和淋巴细胞。其中8名 患者体内持续表达ADA，不再需要酶替代治疗，没有嘌呤 代谢异常的症状。9名患者T细胞数量增加，功能恢复。,家族型高胆固醇症,病因： 因为 (LDLR)基因突变，肝脏缺乏低密度脂蛋白 受体(LDLR)，LDL不能正常代谢，造成血浆LDL和胆 固醇升高的遗传病。患者可在较年轻时会出现冠心病 或心肌梗死。,1992年Michgan大学的研究人员对一例28岁的 加拿大该病女性患者进行了基因治疗。,A：手术第一天切除病人三分之一左肝叶； B：对切下的肝进行胶原蛋白酶灌流，分离肝