蜡样芽孢杆菌B-02菌株培养基及培养条件的优化.pdf

山 东 农 业 科 学2 0 0 8 ， 7： 5 45 7 S h a n d o n g A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s 蜡样芽孢杆菌 B一 0 2菌株培养基及培养条件的优化 刘 婧， 马汇泉 ， 董 瑾， 杨 晓 ( 山东理工大学生命科学学院， 山东 淄博2 5 5 0 4 9 ) 摘要： 为研究培养条件对蜡样芽孢杆菌( B a c i l l u s c e r e us) B一0 2菌株生长和对番茄灰霉病菌( B o t r 2 is c i n e r e a ) 抑菌活性的影响， 分别采用分光光度计法、 琼脂孔扩散法和杯碟法进行 B a c i l l u s c e r e us B一 0 2菌株的菌 体量和抑菌活性的测定。结果表明， B一0 2菌株的最佳培养条件为： 装液量 5 O m l ( 2 5 0 m l 三角瓶) ， 接种量 1 ( V V) ， 转速 1 4 0 r ra i n ， 温度3 2 ， 初始 p H值为9 0的N B培养基中培养 3 6 h ； 在此条件下 B一 0 2菌株抑 菌活性比初始条件提高 1 6 2 2 。 关键词： 番茄灰霉病； 蜡样芽孢杆菌 B一 0 2 ； 抑菌活性 ； 培养条件 中图分类号 ： $ 4 3 6 4 1 2 1 3 ； S 4 7 6 文献标识号 ： A 文章编号 ： 1 0 0 1 - 4 9 4 2 ( 2 0 0 8 ) 0 7 - 0 0 5 4 - 04 Op t i mi z i n g Cu l t u r e M e d i u m a nd Cu l t u r e Co n d i t i o n s o f Ba c i l l u s c e r e u s B O 2 L I U J i n g ， MA Hu i q u a n ， DONG J i n， Y ANG Xi a o ( C o l l e g e o f S c i e n c e ， S h a n d o n g U n i v e r s i t ) o f T e c h n o l o g y ， Z i b o 2 5 5 049 ， C h i n a ) Abs t r a c t I n o r d e r t o s t u d y t h e i n fl u e n c e o f c u l t u r e c o n di t i o ns o n t he g r o wt h a n d a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t y o f Bc e r e u s s t r a i n B一0 2 a g a i n s t B o t r y t c i n e ma，t h e me t h o d s o f s p e c t r o me t e r ，a g a r d i f f u s i o n b i o a s s a y a n d we l l t e s t w e r e u s e d r e s p e c t i v e l y t o q u a n t i f y t h e b a c t e r i u m a s w e l l a s i t s a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t y T h e b e s t c u l t u r e c o n d i t i o n s w e r e 5 0 m l N B me d i u m i n 2 5 0 m l fl a s k w i t h 1 i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n ( V V) ， 1 4 0 r m i n r o t a t i o n s p e e d，3 2 ，p H 9 0 a n d 3 6 h o u r s T h e a n t i mi e r o b i a l a c t i v i t y o f B一0 2 h a d b e e n i n c r e a s e d 1 6 2 2 o v e r t h e b e g i n n i n g Ke y wo r d s Bo t r y t i s c i n e ma；Ba c i l l u s c e r e us B 一0 2；Ant i mi c r o b i a l a c t i v i t y；Cu l t u r e c o nd i t i o n 番茄灰霉病( B o t r y t is c i n e m a P e r s e x F r ) 是 一 种世界性重要病害 ， 目前 已成为危害我国大 棚蔬菜的首要病害 。近年来， 利用拮抗微生物 进行生物防治 ， 被认为是有效控制植物病害的重 要途径。芽孢杆菌 ( B a c i l l u s s p p ) 在 自然界分布 广泛 ， 生理特性丰富 ， 可以产生丰富的具有潜在植 物病害防治和医学应用价值的抗菌物质， 是植物 病害生防微生物的重要组成部分 J 。 蜡样芽孢杆菌( B a c i l l u s c e r e u s ) B O 2是从种 植番茄的土壤中分离筛选得到的一株抗番茄灰霉 病菌的高效拮抗菌株， 室内平板抑菌试验结果显 示 ， B一 0 2菌株在 P D A平板上可 以形成 明显的抑 菌带 。同时， 还发现 B一 0 2菌株和经 1 2 1 灭 菌 3 0 mi n后的无菌滤液均有很强的抗番茄灰霉 病菌活性。营养 、 温度 、 时间 、 p H、 转速、 接种量和 装液量是影响拮抗菌株生长和抑菌活性的主要因 素 。因此 ， 本试验就影响 B O 2菌株生长和 抑菌活性的培养条件进行了优化， 为今后该拮抗 菌株的培养和应用提供了依据 。 l 材料与方法 1 1 供试菌株 供试菌种为番茄灰霉菌( B o t r y t is c i n e r e a ) 和 蜡样芽孢杆菌 ( B a c i l l us c e r e us) B一 0 2 4 ， 均 由本 实验室分离得到。 1 2 培养基 收稿 日期： 2 0 0 8 0 1 1 0 基金项 目： 山东省教育厅研究基 金( T 0 4 c 0 8 ) 作者简介 ： 刘婧( 1 9 8 2 一 ) ， 女 ， 山东蓬莱人， 硕 士研究生， 目前攻读生物化学与分子生物学硕 士学位。 通讯作者 ， Em a i l ： mh q s w p s d u t e d u c r l 第7期 刘 婧等： 蜡样芽孢杆菌B一 0 2菌株培养基及培养条件的优化 5 5 P D A培养基 ， 用于平板检测 B一 0 2菌株对番 茄灰霉病菌的抑菌活性 ； 以下培养基 用于菌株 B 一 0 2的培养： L B培养基； P D B培养基； K MB培养基 ； N B培养基 。 1 3 培养基对 B一0 2菌株 生长及抑菌活性 的影 响 B一0 2菌株按 1 接种量分别接种 到 p H 7 0 的 N B、 L B、 P D B、 K MB培养 基 中， 3 0 C振 荡培 养 ( 1 4 0 r m i n ) 。振荡培养 1 5 ra i n后开始取样 ， 之后 每 4 h取样一次。测定并记录不 同培养基菌悬液 的 O D 6 o 0 值及 p H值。培养至 4 8 h时测定 B一 0 2 菌株的抑菌活性和 O D 6 o o 值 。 1 4 培养条件对 B一 0 2菌株生长及抑菌活性 的 影响 斜面活化的 B一0 2菌株 ， 接种于 ( 1 3 ) 筛 选 的 5 0 m l 液体培养基中， 每瓶接种量相同( 1 ； 不 同接种量的除外 ) 。分别在下列不 同的培养条件 下将各处理分别 置于 1 4 0 r ra i n ( 不 同转速 的除 外 ) 的摇床上培养 。 培养 时间 ： 设 8个梯 度， 1 2 、 2 4 、 3 6 、 4 8 、 6 0 、 7 2 、 8 4 、 9 6 h 。初始 p H值 ： 设 8个 梯度 ， 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0、 8 0 、 9 0 、 1 0 0 、 1 2 0 。温度 ： 设 5个梯度 ， 2 5 、 2 8 、 3 0 、 3 5、 3 7 C。 摇床转速： 1 0 0 、 1 2 0 、 1 4 0 、 1 6 0 、 1 8 0 、 2 0 0 r m in ； 装液量和接种量 ： 每个 2 5 0 m l 三角瓶中分别装入 2 5 、 5 0 、 7 5 、 1 0 0、 1 2 5 、 1 5 0 m l 液体培养基 ， 即装液量 分别为 1 0 、 2 0 、 3 0 、 4 0 、 5 0 和 6 0 。分 别以0 5 、 1 、 2 的接种量接种。 取不 同培养条件下 的 B一0 2菌 株发 酵液 1 ml ， 在 7 2 2 S可见分光 光度计 中测定 菌液 6 0 0 n m 处 的吸光度。上述菌液 ， 4 C离心( 8 0 0 0 r rai n ， 1 0 mi n ) 后 ， 收集上 清 液 ， 过滤 除菌 ( 0 2 2 Ix m， 2 5 mm) ， 采 用琼脂 孔扩 散 法检 测抑 菌 活性。即在 P D A平板上接种番茄灰霉病菌饼 ( 6 m m) ， 2 8 C 倒置培养 23 d后距菌落前沿约 1 e m处打孔 ， 在孔中加人 1 0 0 Ix l 待测活性溶液 ， 2 8 正置培养 1 2 h ， 观察并测定抑菌带宽度 ， 每皿重复 3次 ， 取 平均值。以加入 1 o o l 未接种 B一0 2的液体培 养基作为空 白对照 。 1 5 B O 2菌株优化条件与初始条件的对比 采用杯碟法 把 B一0 2菌株 优化条 件和初 始条件( 表 2 ) 下 的待 测活性溶液 ， 分 别按 1 ：1 0 的比例JJ H - 1 约 4 5 。 C的 P D A培养基中， 倒平板， 待 冷凝后接种番茄灰霉病菌饼 ( q 5 6 m i Y 1 ) ， 2 8 C下倒 置培养 ， 分别于培养 1 、 2 、 3 、 4、 5、 6 、 8 d后用十字 交叉法测定菌落直径 ， 每皿重复 3次 ， 取平均值。 以加入相同比例无菌水 的 P D A平板上生长 的灰 霉病菌作为空白对照。依下式计算抑制率 ： 抑制率( )= ( 对照菌落直径 一 处理菌落直 径) ( 对照菌落直径 一6 m m)X 1 0 0 2 结 果与分析 2 1 不 同培养基对 B一0 2菌株生长及抑菌活性 的影响 2 1 1 B一 0 2菌株在 4种液体培养基 中生长曲 线的测定B一 0 2菌悬液 的 O D值反映培养液 中 菌体量随时间的变化趋势 。在 不同时间取样后 ， 于 6 0 0 ll m处测定 B一 0 2的 O D值。结果( 图 1 ) 表明， 用 L B、 N B和 K MB三种培养液振荡培养 1 5 1 6 h时， BO 2菌株处 于对 数生长期 ， 而 P D B 培养液振荡培养 1 6 3 2 h时 ， B O 2才处于对数 生长期 。其中 L B、 N B和 K MB三种培养液在 1 6 h 时 O D值达到 1 5以上， 2 4 3 2 h 时 O D值达到最 高峰 ， 2 8 4 0 h时三种培养 液的 O D值变化趋 势 趋于稳定。在 1 5 3 2 h发现 P D B的O D值均低 于其他三种培养液， 3 2 h之后 4种培养液 O D值 均在 1 4以上。 _ 一I B_ I l ( ml 2 15 5 言 1 o 0 5 0 1 5 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 4 O 培养时间 ( 天 ) 图 1 BO 2菌株在不 同供试培 养基中的生长 曲线 2 1 2 B一 0 2菌株在4种液体培养基中p H值的 变化B一 0 2菌株培养液 p H值变化曲线( 图 2 ) 显示 ， 随着培养时间增大 ， 不同培养液 的 p H值及 其变化趋势有所不同。L B 、 N B和 K MB在液体培 养起始时 p H值均在 7 0左右 ， 1 5 h之后 L B、 N B 的 p H值 缓慢 上升 ， 2 84 0 h时 达到 8 0以上 ； K M B则随着培养时间的延长， p H值缓慢下降， l 2 h 后 即保持在 5 0以上 。P D B起始 p H偏酸 ， 后 逐渐上升 ， 在 2 02 4 h时 p H有一个 比较大 的上 升 ， 2 4 h后即保持在 7 0以上。 5 6 山 东 农 业 科 学 2 0 0 8丘 1 5 4 8 1 2 1 6 2 0 9 -4 2 8 3 2 3 6 4 0 培养时间 ( h ) 图2 不同培养时间内B O 2菌株在 4种液体培养基中 p H值的变化 2 1 3 不同培养基对 B一 0 2菌株抑 菌活性的影 响B一 0 2菌株在 N B、 L B、 K MB培养基中的菌体 量大于在 P D B培养基中的菌体量 ， 表明蛋 白胨有 益于 B一 0 2的生长 ； 在 K MB培养基 中菌体含量 达到最大值时 ， 抑菌活性最小 ， 说明甘油有利于菌 体生长， 但不适宜于抑菌活性的发挥 。B一 0 2菌 株在 N B培养基 中抑菌活性较强 ( 表 1 ) ， 所 以选 择 N B培养基作为 B O 2菌株的最适培养基 。 表 1 培养基对 B一 0 2菌株生长和抑菌活性的影响 2 2 培养时间对 B一 0 2菌株生长及抑菌活性的 影响 B一 0 2菌株在 1 2 h内菌体量增加 明显 ， 但未 检测到抑菌活性， 4 8 h时菌体量达 到最大 ； 在培 养 3 6 h时 ， 抑菌活性达 到最大值 ， 并且与其 它培 养时间抑菌活性相 比差异显著 ( 图 3) 。在 3 6 h 前存在一个抑菌活性作用的高峰期， 从图中可以 看 出， 随着菌液浓度的增加 ， 抑菌活性也增强 ， 但高 峰期后 ， 抑菌潘I生 又随着菌液浓度的下降而减弱。 1 2 2 4 3 6 4 8 6 O 7 2 8 4 9 6 培养时间( h ) 图3 培养时间对 B一 0 2菌株生长和抑菌活性的影响 2 3 p H值对 B O 2菌株生长及抑菌活性的影响 B一 0 2菌株在 p H值 4 01 2 0 ( 图 4 ) 下均 可生长， 并且在 p H值 5 01 2 0下有抑菌活性。 p H值为 4 0时菌体可生长， 但抑菌活性较弱。 p H值为6 0 9 0时， 菌体生长量及抑菌活性相 差不大 ， p H值为 9 0时抑菌活性最强。 4 3 5 善3 靼 1 5 墨 0 5 O 2 5 2 1 5 i 量 1 鲁 0 - 5 0 4 5 6 7 8 9 1 0 l 2 p H 图4 p H值对 B一 0 2菌株生长和抑菌活性的影响 2 4 温度对 B一 0 2菌株生长及抑菌活性的影响 B O 2菌株在 2 53 7 C下均可生长并有 抑 菌活性。温度对菌株 的生长影 响较大 ， 抑菌活性 在3 2 C 达到最大值( 图5 ) ， 温度过高或过低都不 利于抑菌活性的作用。 2 5 2 8 3 0 3 2 3 5 3 7 温 度 ( ) 1 7 5 1 1 65 i 1 5 5 8 l |5 1 45 1 4 图5 温度对 B一 0 2菌株生长和抑菌活性的影响 2 5 摇床转速对 B一 0 2菌株 生长及抑菌活性的 影响 B e r e l $ 的发酵过程是需氧 型发酵 ， 通过改 变摇床转速来调节通气量 。B O 2 菌株在转速 小于 1 4 0 r mi n时， 随着转速的加大 ， 菌体量及抑 菌活性均呈现增长趋势 ， 在转速为 1 4 0 r mi n时 ， 菌体量和抑菌活性均达到最大值( 图 6 ) ； 当转速 大于 1 4 0 r m i n时， 随着转速 的增加， 菌体量减 少； 当转速大于 1 6 0 r ra i n 时， B一 0 2菌株抑菌活 性下降。因此 ， 1 4 0 r mi n是 B一0 2菌株生长及抑 菌活性作用的最佳转速。 9 8 7 6 5 4 l 晶 7 6 5吐0 2 1 O 一 一 般旧 第7 期 刘 婧等： 蜡样芽孢杆菌 B O 2菌株培养基及培养条件的优化 5 7 i 0 0 1 2 0 l 4 0 l 5 0 l 8 0 摇床转速 (r m i n ) 1 7 S 1 7 1 5 5 e 1 6 耋 0 1 5 5 1 5 1 4 5 图 6 摇床转速对 B一 0 2菌株生长和抑菌活性的影晌 2 6 装液量和接种量对 B O 2菌株 生长及抑菌 活性的影响 B一 0 2菌株在不同装液量( 2 51 5 0 m1 ) 和接 种量( 0 5 、 1 、 1 5 )的培 养条 件 下 测定 发 现 ， 抑菌活性 以装液量和接种量分别为 5 0 ml 、 1 为最佳( 图 7 ) 。装 液量的增加使得拮抗菌株 B一 0 2 菌体生长量降低( 图8 ) 。 2 5 5 0 7 5 l 0 O I 2 5 1 S 0 装 液 量 ( m 1) 图 7 装液量和接种量对 B一 0 2菌株抑菌活性的影响 Z U f 1 00 l 2 5 l 50 装液量 ( ) 图 8 装液量 和接种量对 B一 0 2菌株生长 的影 响 2 7 B一 0 2菌株优化条件与初始条件的对比 根据上述结果 ， 得到 B一 0 2菌株摇瓶培养的 最适条件 ( 表 2 ) 。 应用表 2中 B一 0 2菌株 的优化条件和初始条 表2 B一 0 2菌株优化条件与初始条件 件 ， 进行抑菌活性对 比试验。结果显示 ， B一 0 2菌 株的抑菌活性有了显著提高 ， 较初始 条件平 均增 加 1 6 2 2 ， 表明培养条件的优化效果 明显。 3 结论与讨论 已有文献报道， 培养条件可以影响菌株的生 长和抑菌 活性 9 J ， 本试 验也证 实 了这一点 。同 时 B O 2菌株的菌体量与其抑菌活性有一定关 系， 菌体量达到最大时的培养条件不一定是抑菌 活性最大的条件 ， 说 明 B一0 2菌株的生长与抑菌 活性对培养条件的要求不 同， 并且抑 菌活性 的作 用是建立在菌体生长的前提下。上述研究结果表 明， B一0 2菌株在装 液 量 5 0 m l 2 5 0 ml 和接 种量 1 ( 0 5 m l 5 O r n 1 ) 、 摇床转速 1 4 0 r mi n 、 3 2 o C、 初 始 p H 9 0的N B培养液中振荡培养 3 6 h ， 其代谢 产物的抑菌活性 作用最 为显著 ， 较初始培养条件 增加 了 1 6 2 2 。本试验结果为该菌的培养和开 发应用奠定 了基础。 参考文献 ： I 1 Dik A J ，K o n i n g G K b h l J E v alu a t i o n o f mi c r o b i a l a n ta g o n i s t s f o r b i o l o g i c a l c o n t r o l o f B o t r y t i s c i n e ma s t e m i n f e c t i o n i n e t l c u m b e r a n d t o m a t o J E u ro p e a n J o u rna l of P l a n t P a t h o l o g y ， 1 9 9 9， 1 0 5： 1 1 5 1 2 2 2 郑果 ，杜蕙 几种新 型药剂 对番茄灰霉病 的防治效果 J 中国蔬菜， 2 0 0 6 ， 9 ： 2 2 2 3 3 蒙显英， 黎起秦， 冯家勋 ， 等 芽孢杆菌产生的抗菌物质 的研究进展 J 中国植保导刊， 2 0 0 4 ， 2 4( 1 2 ) ： l 2 1 5 4 李桂霞， 马汇泉， 刘婧， 等 番茄灰霉病高效拮抗菌株的 鉴定及通过导入 B一1 ， 3一 葡聚糖酶基因提高其生防效果 J 中国生物工程杂志， 2 0 0 7 ， 2 7( 4 ) ： 4 4 4 9 5 李桂霞， 马汇泉， 刘婧， 等 番茄灰霉病高效拈抗菌株的 鉴定及抗菌活性研