杏鲍菇子实体多糖的提取和纯化工艺研究.pdf

黑龙江医药 H e il o n g j i a n g M e d i c i n e J o u rn a l V o L 2 4 N o 3 2 0 1 1 4 0 3 杏鲍菇子实体多糖的提取和纯化工艺研究 关力， 杨晶， 李楠 黑龙江农业职业技术学院( 1 5 4 0 0 7 ) 摘要杏鲍菇是一种珍贵食用茵， 杏鲍菇多糖具有多种生物活性 ， 本文对杏鲍菇子 实体中多糖的最佳提取条 件进行了筛选， 同时， 应用 s e v a g e法除蛋白， 乙醇沉淀， 离心， 真空干燥， 得到多糖粗品。再用 D E A E一纤维素层析法 进行多糖的分离和纯化， 最后采用紫外光谱扫描、 琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱进行分析检测， 最后获得单一多糖 组分 。 关键词： 杏鲍菇； 子实体； 多糖； 提取和纯化； 分析 中图分类号： T Q 4 6 0 。 6 ； R 2 8 4 2 文献标识码： A 文章编号 ： 1 0 0 6 - 2 8 8 2 ( 2 0 1 1 ) 0 3 4 0 3 一 o 3 S t u d y o n E x t r a c t i o n a n d P u rif i c a t i o n o f P o l y s a c c h a rid e s f r o m P l e u r o t u s E r y n g i i F r u i t B o d y C c u a nLi ， e t a l C o l l e g e o fHe i l o n g fia n g A g r i c u l t u r a l a n d T e c h n i c a l v o c a t i o n a l ( J i a r a u s i 1 5 4 0 0 7 ， G h i n a) Ab s t r a c t ： P l e u r o t u s e r y n g i i i s a k i n d o f r a r e a n d e d i b l e f u n g u s I t s p o l y s a c c h a r i d e s h a v e v a r i o u s b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s I n t h e 因此， 薄荷油喷人量不超过 4 ( m l g ) 。 2 6 制剂处方确定 经试验 ， 确定处方如下。 穿山甲( 制) 3 0 g 土鳖虫 3 0 g 僵蚕 1 2 0 g 牡蛎( 煅)6 0 g 玄参 6 0 g 糖粉 8 g 0 5 ( v V ) 薄荷油适量硬脂酸镁 0 9 g 制成 1 0 0 0片 确定制剂工艺方法如下 ： 以上五味， 粉碎成细粉， 过 1 0 0目 筛， 混匀， 糖粉 8 g 配成 1 0 的糖浆， 加入到细粉中， 制成软材 ， 2 o目筛制成颗粒 ， 干 燥温度( 6 0 7 0 ) ， 2 0目整粒 ， 喷人 0 5 ( V V ) 薄荷油不 超过4 ( v g ) ， 混匀， 置密闭容器中 1 2小时， 加入硬脂酸 镁0 9 g ， 混匀， 压制成 1 0 0 0片， 包薄膜衣， 即可。 3 中试研究 3 1 中试生产 为了考察利咽灵的工艺是否符合能够应用于大规模的 工业化生产， 在利咽灵 的工艺和产品的质量标准确定并考 察了产品稳定性之后， 我们选择经过 G M P认证的生产车 间， 进行了中试 ， 对试验室内确定的工艺路线加以检验。 按照 l O倍处方量投料制成 3批中试样品， 每批 1 0万 片， 分另 I】 按制剂工艺进行操作 ， 并且按照利咽灵的质量标准 进行考察 ， 其考察项 目为性状、 鉴别、 重量差异、 崩解时限、 微生物限度检查、 含量等， 中试结果及考察项 目 见表 6 。 表 6 中试工艺数据 批号 原料( k g ) 糖粉( g ) 硬脂酸镁( g )成品率( ) 2 o 0 5 o 3 Ol 3 0 8 0 9 9 8 68 2 0 o 5 0 3 O 2 3 0 8 O 9 9 8 8 3 20 o 5 0 3 0 3 3 0 8 0 9 9 8 7 2 3 2 稳定性试验 加速稳定性试验， 将“ 利咽灵片” 三批样 品在上市用包 装条件下， 于温度 4 o 2 条件下放置 6个月， 第 O 、 l 、 2 、 3 、 6月末取样一次， 按稳定性重点考查项 目检测。 长期稳定性试验 ， 将“ 利咽灵片” 三批样 品在上市用包 装条件下， 于温度 2 5 2 C 条件下放置 1 2 个月 ， 第 3 、 6 、 9 、 l 2月末取样一次， 按稳定性重点考查项目检测。 考查项 目： 性状 、 鉴别、 重量差异、 崩解时限、 微生物限 度检查、 含量测定。试验方法按照 利咽灵 片 质量标准的 方法进行。 三批样品考察结果药品稳定无变化， 工艺合理可行。 4结论 利咽灵片工艺较为简单， 在利咽灵片生产工艺考查中， 经过对药材粉碎出粉率的考察、 辅料的筛选、 湿颗粒烘干温 度的考察、 薄荷油喷人量的考察等， 将原工艺中各部分的参 数填充得更加详细， 形成了比较合理而且完整的生产工艺。 按本制法的要求制成利咽灵片， 制剂成 品检验结果证 明： 本制剂工艺可行， 参数合理 ， 易操作 ， 成品稳定， 完全符 合生产的要求。 收稿 日期 ： 加 1 1 0 22 5 4 0 4 黑龙江医药 H e i l o n g j i a n g M e d i c i n e J o u rn a l V o L 2 4 N o 3 2 0 1 1 p a p e r ， s o me r e s u l t s o f t h e e x t r a c t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m t h e my c e l i a o f P l c u r o t u s e r y n g i i f r u i t b o d y W e r e r e p o r t e d F i r s t l y t h e my e e l i a wa s e x t r a c t e d i n t h e b e s t e x t r a c t i o n c o n d i t i o n s T h e n t h e r a w p o l y s a e c h a r i d e s w e I o b t mn e d b y me a n s o f e t h ano l p r e c i p i t a t i o n， p r o t e i n r e mo v a l b y s e v a g e me t h o d T h e r a w p o l y s a e e h a r i d e w e r e p u r i fi e d wi t h c o l u mn c l u - o ma - t o g r a p h y o n D EAEc e l l u l o s e a n d c o l l e c t e d b y c l e a n s e d F i n a l l y， Th e p u r e p o l y s a c c h a r i d e s Wa S d e t e c t e d b y UV s p e c r a l S C an n i n g， Ag a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d HP L C Ke y wo r d s ： P l e u r o t u s e r y n g i i ； f r u i t b o d y ； P o l y s a c c h a r i d e s ； e x t r a c t i o n a n d i s o l a t i o n； ana l y s i s 杏鲍菇又名刺芹侧耳， 隶属于担子菌亚门， 层菌纲， 侧 耳属； 杏鲍菇 口味兼具杏仁香味和鲍鱼风味， 非常适合食 用， 是一种在我国很有发展前景的新型食用菌； 同时， 杏 鲍菇药用功效也很突出， 尤其是杏鲍菇多糖 J 。大量药效 学实验证明杏鲍菇多糖具有抗氧化- 2 剖、 增强免疫活性和抗 肿瘤作用 川 ； 对肝脏、 骨骼肌有明显抗损伤作用 。目 前， 关于杏鲍菇培养和驯化的报导较多， 但是关于子实体多 糖的分离 、 纯化方面的研究较少， 本文研究了杏鲍菇子实体 多糖的提取、 分离和纯化方法， 为进一步对杏鲍菇的食药用 价值的开发提供依据。 1 材料与 方法 1 1 材料与设备 杏鲍菇子实体由哈尔滨文臣菌菇基饲养地提供 ； L D 5 1 0 型离心机 ： _J E 京医用离心机厂； WF 2 8 0 0一D 3 B型紫外分 光光度计 ： 上海精宏实验设备有限公司； J YS P I O型电泳 槽 ： 北京六一仪器厂 ； D H G一9 2 4 0 A电热恒温古风干燥箱 ： 上 海精宏实验设备有； D Y Y一5稳压稳流电泳仪： 北京市六一 仪器厂； L C一1 0 A高效液相色谱仪： 日本岛津公司； 乙醇、 考 马斯亮蓝 、 苯酚、 硫酸、 蒽酮、 D N S 、 小牛血清白蛋白、 茚三酮、 无水硫酸铜、 O f 一 萘酚等均为分析纯。 1 2 方 法 I 2 I 杏鲍菇子实体粗多糖 的提取： 分别称取预先加工好 的杏鲍菇子实体 6 g ， 采用 ( 3 ) 正交表 ， 以提取温度( A ) 、 提取时间( B ) 、 料液比( C ) 为影响因素， 以多糖得率为考察 指标进行均匀设计试验。按表 1 ， 以不同的料液比、 提取温 度、 提取时间， 在超声波处理 1 0分钟后 回流提取， 3 0 0 0 r ra i n 离心 1 0 m i n ， 上清液即多糖提取液。在多糖提取液中 加入 3倍体积9 5 的乙醇沉淀多糖， 冷冻干燥后得杏鲍菇 粗多糖 ， 用蒸馏水溶解利用苯酚硫酸法测定多糖含量。( 结 果见表 2 ) 表 1 杏鲍菇子实体多糖提取工艺正交实验因素与水平表 1 2 2 杏鲍菇粗多糖的脱蛋 白： 乙醇沉淀后的粗多糖类物 质巾含有一定 的蛋白质， 采用 s e v a g e法去除蛋白质， 透析， 乙醇沉淀 ， 冷冻干燥后得杏鲍菇粗多糖。 1 2 3 D E A E一纤维素柱层析 称取 0 5 g杏鲍菇粗多糖溶于5 m l T r i s He l 缓冲液中， 3 0 0 0 r mi n离心 1 0 mi n ， 除去不溶物留上清， 取 1 m l 上述清 液进行柱层析 ， 洗脱速度 1 m l m i n ， 收集洗脱液 3 4 m l 管， 共收集 1 0 0管 ， 并采用硫酸 一苯酚法测定每管内糖含量。以 管号为横坐标， 以多糖含量为纵坐标做洗脱 曲线。收集 目 的多糖洗脱液 ， 透析、 浓缩、 乙醇沉淀、 干燥即得白色精制的 杏鲍菇多糖。( 结果见图 1 ) 1 2 4 紫外光谱扫描 取精制后的杏鲍菇多糖配成 1 m s m 1 供试液， 在 1 9 0 4 0 O n to的波长下对其进行紫外光谱扫描。 ( 结果见图 2 ) 1 2 5 琼脂糖凝胶电泳检测 精密称取精制后的杏鲍菇多糖用巴比妥钠缓冲液中分 别配成 5 t g m L 、 1 0 s m L 、 1 5 v , m L、 2 0 v g m L四个供试品。 2 0 V恒压条件下电泳操作 1 2 h ， 以溴酚蓝为指示剂， 用甲苯胺 蓝染色液染色， 再用乙醇脱至背景无色。( 结果见图3 ) 1 2 6 高效液相色谱检测 精密称取精制后的杏鲍菇多糖用去离子水配成 l O m g r n l 供 试 品， 0 2 2 z m 水 膜 过 滤， 备 用。色 谱 柱 ： T S K G E L 2 0 0 0 S WX L柱( 7 8 m m 3 0 0 mm) ； 检测器 ： 示差折光 检测器( R I DI O A ) ； 流动相： 双重蒸馏水 ； 柱温： 3 5 C； 保 留 时间： 3 0 m i n ； 进样量： 2 0 p L ； 流速： 1 0 m L m i n ， 进行高效液相 色谱检测。( 结果见图4 ) 2 结果与分析 2 1 杏鲍菇子实体粗多糖的提取 表2 影响杏鲍菇子实体粗多糖提取效果的正交实验结果 由表 21分析看出， 影响杏鲍菇子实体粗提物中的多 糖量的各因素排序为 B A C ， 即提取时间 提取温度 料液比， 最佳组合为： A 3 B 3 C 2 ， 因此， 杏鲍菇子实体粗多糖提 取的最优条件为 1 0 0 ， 处理时间 1 0 h ， 料液 比 1 ：4 o ， 此条 件下粗提物中的多糖量为6 9 5 。 2 2 D E A E一 5 2纤维素柱层析结果 黑龙江医药 H e i l o n g j i a n g M e d i c i n e J o u rn a l V o L 2 4 N o 3 2 0 1 1 4 0 5 0 l o 2 0 3 0 4 0 5 o 管号 图 1 D E A E一5 2纤维素柱层析结果图 D E A E一5 2纤维素柱层析结果显示经过纤维索柱层析 后从粗多糖中分离到两种组分， A 1 和 A 2 ， 其中 A l 峰所占面 积最大， 证明为其中主要成分 ， 主要集中在第 l 5 3 O之间。 2 3 紫外光谱扫描结果 l 8 O 2 3 O 2 8 o 3 3 O D 波长 ( 图 2 紫外光谱扫描结果图 由紫外光谱曲线可知， 其在 1 9 0 n m附近一个临界吸收 峰外 ， 在2 6 0 、 2 8 0 n m处无核酸吸收峰和蛋白质吸收峰， 说明 其样品中不含核酸和蛋白质。 2 4 琼脂糖凝胶电泳检测结果 l 2 3 4 1 杏鲍菇予实 体多 糖( 5 m L ) 2杏鲍菇子实体多 糖( 1 O 0 #m L ) 3 杏鲍菇子实 体多 糖( 1 5 r I lL ) 4 杏鲍菇子实体多 糖( 2 0 n 】L ) 图3 琼脂糖凝胶电泳检测结果图 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示纯化后杏鲍菇子实体多 糖在多糖特征电泳后得单一多糖斑点， 证明利用 以上分离 纯化方法已从杏鲍菇子实体获得一种单一多糖。 2 5 高效液相色谱检测结果 H P L C分析结果纯化后产品中主要含有一种多糖， 在 1 2 6检测条件下出峰时间在 8 m i n 左右， 证明以上选择的 提取和分离纯化条件很有效。 l 料 ； 3 a 咄 誊 l l ： ； 警芝 嚣 若 嚣 ： ： ： ： ； 图4 杏鲍菇子实体多糖 H P L C分析结果图 3 结论 试验结果表明， 从杏鲍菇子实体中提取多糖的最优条 件为 I O 0 C ， 处理时间 1 0 h ， 料液比 1 ：4 0 ， 此条件下粗提物 中的多糖量为 6 9 5 。所得粗提取经有机溶剂沉淀、 离心、 透析、 D E A E纤维素柱层析后获得两种多糖组分 A 1和 A 2 。 其中A 1为主要组分， 经紫外光谱扫描、 琼脂糖凝胶电泳和 H P L C分析检测该组分为某种纯多糖组分， 具体为何种多 糖， 分子量和结构式以及功效性实验将是下一步研究 的重 点内容， 希望本项研究可以为食用菌深加工提供新的思路。 参考文献 I 杨立红， 史亚丽， 王晓洁等杏鲍菇多糖的分离纯化及生物活 性的研究 J 食品科技， 2 0 0 6 ， 3 2 ( 6 ) ： 1 8 2 盛伟， 方晓阳等 白灵菇、 杏鲍菇、 阿魏菇多糖体外抗氧化活 性研究 J 食品工业科技， 2 0 0 8 ， 2 9 ( 5 ) ： 1 0 3 1 0 9 3 王振河 ， 张习约等 白灵菇及杏鲍菇子实体多糖含量的测定 J 河南科技学院学报( 自然科学版) 2 0 0 7 ， 3 5 ( 3 ) ： 1 0 1 1 4 张志军； 李淑芳等 杏鲍菇粗多糖的提取及其保湿性能研究 J 食用菌学报 2 0 1 0 ， 1 7 ( 2 ) ： 7 6 - 7 9 5 杨立红， 史亚丽， 王晓洁等 杏鲍菇多糖的分离纯化及生物活 性的研究 J 食品科技， 2 0 13 6 ， 3 2 ( 6 ) ： 1 8 2 o 6 张俊会， 王谦 杏鲍菇多糖的抗氧化活性研究 J 中国食用 菌 ， 2 0 0 3 ， 2 2 ( 2 )： 3 7 7 盛伟， 方晓阳 杏鲍菇菌丝体胞 内与胞外多糖体外抗氧化活 性研究 J 中国林副特产， 2 0 0 9 ， 2 4 ( 1 ) ： 7 一 l 0 8 O u y a n g x L ， Z h a n g x Y ， Wa n g H X， e t a 1 R e s e a r c h o n e x t r a c t i o n me t h o d s o f P o l y s a e e h a r i d e f r o m Ag r o e y b e c h a n i n g Hu an g My e e l i a J E d i b l e u C h n a ， 2 0 0 5 ， 2 3 ( 5 ) ： 3 5 2 3 7 1 。 9 N i e J Y ， Wu C Y， Wu S R ， e t a 1 M i c r o w a v e a s s i s t ant e x t r a e t i o n o f w a t e r s o l u b l e P a e h y m a ll f r o m P o fi a c o c o s J 6 “h n