可移动的遗传因子转座和染色体外遗传因子.ppt

第三章,可移动的遗传因子（转座子） 和染色体外遗传因子,生化教研室 林丽彬,主要内容,第一节 转 座 子 第二节 质 粒 第三节 遗传重组,第一节 转 座 子,转座子(transposons) 概念：,转座子是基因组突变的主要因素之一。,转座子（transponsn,简称Tn）是原核生物和真核 生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点的一些DNA序列。这些DNA序列可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。故又称跳跃基因。,一、转座子的分类和结构特征,（一）原核生物转座子的类型：,1、插入序列（insertion sequences，IS） 最简单的转座子。, 二个分离的反向末端重复序列 (inverted terminal repeats, ITR) 一个转座酶（transposase)编码基因,2、复合转座子 类转座子 由IS类转座组件构成的复合体。,组成：两端为IS序列或类IS序列 中间编码抗生素物质,3、转座子A家族类转座子（Tn A家族） 携带转座和耐药等基因的独立体家族。,组成：两端为ITR，而不是IS 中间编码区含转座酶编码基因，及 抗生素抗性和解离酶等编码基因。,4、转座噬菌体类转座子（了解）,（二）真核生物转座子的类型（了解）,1、酵母菌中的转座子Ty因子： 2、果蝇中的转座子P因子、FB因子等： 3、玉米中转座子玉米调控元件 4、逆转录转座子逆转录病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。,转座子共同特点,.两端有反向重复序列 .转座后靶位点是正向重复 .编码与转座有关的蛋白转座酶 .可以在基因组中移动,（一）类型,1、复制型转座 （replicative transposition）,2、非复制型转座（nonreplicative transposition）,3、保守转座（conservative tranposition）,二、转座子机制,1、复制型转座,转座是伴随着新拷贝的复制。TnA转座子家族的移 动只能通过复制型转座,转座酶：交错切割原来的转座子末端和靶序列。,解离酶：作用于新的转座子拷贝,需要两种酶：转座酶和解离酶。,2、非复制型转座,一个位点移到另一位点。一种酶：转座酶 。转座 后供体中无转座子。插入序列和复合转座子Tn10、 Tn5均利用这一机制移动。,3、保守转座,宿主的修复系统能识别此处双链断裂并进行修复,保守型转座是另一种非复制型的转座过 程，该过程中转座元件从供体部位被切除并通过一系列的过程插入到靶部位，在该过程中每个核苷键皆被保留。,IS插入，与宿主的单链末端相连接,缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，插入的IS两端形成了DR或靶重复。,转座过程：,非复制型转座（插入序列）的转座过程：,转座酶交错切开宿主靶位点,+,转座酶交错切割原来的转座子末端和靶序列。,复制型的转座过程：,切割产生的靶序列3端和转座子5端之间发生DNA链交换，形成假复制叉。,然后以靶序列的3端为复制引物，以转座子链为模板进行复制产生共合体。,最后在解离酶的作用下，2个拷贝的转座子发生同源重组并释放出2个复制子。,三、转座效应（了解）,1、转座的遗传效应：,转座最典型的作用是引起不稳定的突变等位基因。,导致受体DNA基因突变，插入导致基因失活是转座 最直接的效应。,干扰宿主基因与调控元件之间的关系，或改变DNA 结构而影响基因表达。,转座引起的DNA重排,引起插入突变、产生新的基因、产生染色体畸变、引起生物进化,3、异常转座的效应：,4、对宿主细胞活力的影响：,异常转座包括：一端转座、部分转座、隐藏位点转座、协同转座、倒位转座,影响细胞DNA代谢，介导基因异常重排。 三种形式： 修复切割所留下的切口 转座子内部的重排 转座子间的重排,2、精确转座的结构效应：,转座事件可介导两侧的宿主DNA发生一系列的基因重排。,逆转录转座子：指内部含逆转录酶编码序列, 通过DNARNADNA 方式进行转座, 即转座子转录产生相应的RNA , 再经逆转录生成新的转座子DNA 并整合到基因组中。,四、逆转录病毒和逆转录转座子,逆转录病毒：将含有逆转录酶的RNA病毒称为 逆转录病毒。,逆转录酶由逆转录病毒基因组RNA编码,所以逆转录转座子与逆转录病毒有关，是真核生物转座子的重要类型。,逆转录病毒与逆转录转座子的区别：,逆转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以 在细胞之间转移。,逆转录转座子是宿主DNA基因组的组分，可以 在基因组内转座，但不能在细胞之间转移。,1、逆转录病毒基因组与逆转录转座子结构,（1）逆转录病毒：,基因组由两条相同的正链RNA组成。典型逆转录病毒具有gag、pol、env三个结构基因。如图：,编码病毒核心蛋白,编码逆转录酶、蛋白水解酶和整合酶,编码包膜糖蛋白。,（2）逆转录转座子：,与逆转录病毒结构有许多相似之处，但env基因被破坏或没有，故逆转录转座子不能形成感染粒子。,2.逆转录病毒与转座, 逆转录产生原病毒像溶源性噬菌体DNA一样，成为宿主基因组的一部分； 细胞DNA序列可能与病毒序列重组，并经过转座作用插入新位点，改变细胞的性质。,逆转录产生的线形病毒DNA，由整合酶催化插入宿主靶位点DNA，这一整合过程与转座子一样。,3、逆转录病毒与转导（了解）,逆转录病毒可转导真核细胞的序列，常被称 为转导逆转录病毒。,原病毒DNA整合在C-onc基因附近，二者可 融合在一起，转录后形成一条即含病毒序列又含 C-onc的RNA，后者如含包装信号可被包装进 病毒颗粒中，形成含有一条融合RNA和一条正 常病毒RNA的二倍体病毒颗粒。 二者分子之间发生重组将会产生转化逆转录 病毒基因组。病毒携带V-onc，即具有转化能力。,LTR,gag,pol,env,LTR,Virus DNA,Virus protein,LTR,gag,LTR,V-onc,Transforming Virus DNA,Virus protein,逆转录病毒和携带细胞基因序列病毒基因组比较,3.逆转录病毒与转录,病毒超家族（vira superfamivly）：反转录病毒编码反转录酶或整合酶，所以有转座能力。反转录子不同于反转录病毒，它们自已并不形成独立的感染颗粒。但对于转座机制等其它方面它们是相似的。这一组称为。,逆转录转座子的分类,非病毒超家族（nonviral suberfamily）：另一类反转录子其内外部特点相似，表明它们起源于RNA序列。它们并不编码具有转座功能的蛋白，转座的酶是通过别处编码的酶来作用的。这一组就称为.。,第二节 质 粒,质粒（plasmid）：为多数细菌和某些真核细胞染色体外的环状双链DNA分子 。,特点：,能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。 但质粒并不是它的宿主细胞所必需的。,质粒（plasmid）, 存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息,3. col质粒：编码大肠埃希菌的细菌素,一、质粒遗传学类型,2. R质粒,1. F质粒,3. col质粒,4.质粒噬菌体,1. F质粒：编码细菌性菌毛,2. R质粒： 编码细菌耐药性,二、质粒DNA的特性,（一）质粒的复制,质粒在细胞内的复制分两种类型：,1、严紧型质粒的复制：,依赖细菌染色体的多种酶系统。,只在细胞周期的一定阶段进行复制，与细菌的繁 殖密切相关。受细胞核控制，与染色体DNA复制 相伴随。 需要蛋白质合成和 DNA pol 的存在。 每个细胞只有 15个拷贝。,在整个细胞周期中随时都可进行复制。不受细胞 核控制， 需用DNApol的存在。 在细胞内有10200个以上,甚至多达数千个。,质粒复制方式： 均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。 质粒复制形式多样，包括： 单向复制、双向复制、单向与双向并存。,2、松弛型质粒的复制：,（二）质粒的不相容性,质粒的不相容性是指细菌质粒不能在相同细胞 中同时存在的现象。,当某种质粒在宿主细胞内存在时，会阻止其它质粒进入细胞寄宿，这种质粒称为不相容质粒。,四、质粒中的选择性标记,选择标记是指能够赋予宿主易于检测的表型。包括抗生素抗性标记，以及一些生化表型的标记。,抗生素抗性基因是目前使用最广泛的 选择标记。常用的有 ：,1、氨苄青霉素抗性基因 ampr 2、四环素抗性基因 tetr 3、氯霉素抗性基因cmr 或 cat,三、特殊细菌质粒（了解）,（一）F 质粒 性质粒,F 质粒是一种环状的DNA分子，分子量94.5kb； F 质粒有整合进入细胞染色体而产生Hfr细胞 的能力； 染色体上有20多个整合位点，F质粒对其亲和力 不同，形成Hfr 细胞株的频率也是不同的； F 质粒的整合方向可以是顺时针，也可逆时针； F 质粒可从一个细胞转移到另一无F 质粒的细胞。,（二）R 质粒耐药性质粒,R 质粒由抗性转移因子（RTF）和决定抗性 因子（r-决定子）两部分DNA片段组成。,（三）Col 质粒大肠杆菌质粒,是能产生大肠杆菌素的大肠杆菌质粒，可以 抑制或杀死不含Col 质粒的亲缘细菌。,R 质粒含有对抗生素的抗性基因，使宿主细 菌产生对抗生素的抗性，这种耐药性是可以 遗传的。,在减数分裂时，通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。（genetic recombination）,第三节 遗传重组,遗传重组定义：,广义的遗传重组：指任何产生新的基因组合，从而造成基因型变化的过程，包括独立分配或基因交换。,狭义的遗传重组：仅涉及DNA分子的断裂并重 新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换。,遗传重组类型,1.同源重组 2.位点特异性重组 3.转座作用 4.异常重组,依据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求,一、同源重组 （homologous recombination）,发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式。 通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子大片同源序列间进行单链或双链片段的交换。,1、同源重组的产生：,产生条件：只要两条DNA序列相同或相似，就可 以在序列的任何一点发生同源重组。,二、同源重组的分子机制, 两个DNA分子单链的同一部位发生断裂。 两个断裂的单链的游离末端彼此交换，连接形成Holliday连接体。 通过分支移动产生同另一分子的互补序列形成异源双链DNA。 Holliday交叉的上部或下部旋转1800，中间体 切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体和拼接重组体。,普遍公认的是1964年提出的Holliday模型，该模型于1975年得到改进：,片段重组体 基本无重组发生：,拼接重组体交换重组：,切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,切开的链并非原来断裂的链，重组体 异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,片段重组体,拼接重组体,RecBCD核酸酶 RecA蛋白 RuvAB和RuvC蛋白,（三）、同源重组的酶学,对大肠杆菌的研究最为深入，主要蛋白质有：,1、RecBCD蛋白,RecBCD是一种多功能酶，具有外切核酸酶、解 螺旋酶、ATP酶和序列特异的单链内切酶活性。,单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链RecA的作用位点,RecBCD有固定切割位点,单链区的 chi 位点3方46NT处切断单链(单链内切酶),chi位点：5-GCTGGTGG-3目前发现的重组热点，E.coli基因组中大约每10Kb出现一个该位点.,5,3,RecBCD 切割产生3单链末端,chi位点：5-GCTGGTGG-3,2、RecA 蛋白,活性,RecA 有单、双链 DNA 结合活性,RecA 有 ATPase 活性,RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分 子的能力，即联会同源 DNA,功能：,在ATP的协助下， 促进各种DNA分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的联合分子。,RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段,3、其它蛋白,、RuvA：识别 Holliday 结构的连接点,、RuvB：为分枝迁移提供动力（ATPase ）,RuvAB最主要的功能： 凭借其解旋酶活性，推动Holliday中间体的分支迁移。, Ruv C 的作用：,Ruv C 是一种核酸内切酶-专一性识别Holliday 结构的连接点。,拆分分三步进行：,功能：在重组中诱发Holliday中间体的拆分作用。,第一： Ruv C 结合于Holliday中间体； 第二：改变DNA构象，需用Mg2 或Ca2 ； 第三：切割，需用Mg2。,（四）、同源重组的主要途径,（1）Rec BCD 途径：是最重要的一条途径。 （2）Rec F 途径：在Rec BCD 途径不能运作 的情况下，大肠杆菌启动该途径。 （3）Rec E 途径：不用Rec BCD ，也不用Rec A。 （4）Red 途径：为重组缺陷途径，是噬菌体 专用途径。,概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间，不依赖于DNA序列的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组。,二、 位点特异性重组,概念：,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,特点：,在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂 重接-产生精确的DNA重排,都具有整合作用的两个基本特征, 典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先 的DNA，即DNA不失去、不合成、不交换对等 部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA 分子中，又称整合式重组）, 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性 核苷酸上，需要位点专一性的蛋白质因子参与。,位点特异性重组与同源重组的区别：, 同源重组中DNA链的切断是完全随机的； 位点特异性重组是在某些特异的DNA 序列处发生重组。, 同源重组后染色体内的DNA序列一般仍按 原来的顺序排列； 位点特异性重组中DNA节段的相对位置发 生了移动，即DNA序列发生重排，从而得 到不同的结果。,（一）噬菌体对E.coli 的整合,1、噬菌体DNA的整合作用：,噬菌体感染大肠杆菌后，有两种生活方式：, 裂解生长途径（溶菌生长）：lysis pathway 溶源菌生长途径：lysogenic pathway,噬菌体在溶源周期和裂解周期中，其DNA状态 不同，两种状态的相互转变（整合与切离）是通 过位点特异性重组实现的。 这些特异位点叫附着点（attachment site）， 简称为 att。,BOB,att B,att P,POP,Int IHF,Int Xis IHF,BOP,POB,att L,att R,原噬菌体,切除,整合,细菌DNA,噬菌体,核心序列 “O”完全一致（同源部分）-位点特异性重组发生的地方,整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）,噬菌体的整合作用有两个特点：, DNA和宿主DNA的交换是可逆的， 原先存在的DNA序列全部被保存下来，并 无丢失。, 噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的 同源序列，重组交换必须通过其中的一个 特定的核苷酸。,2、噬菌体整合的分子机制：,分成三个阶段：,