中药制剂的含量测定.ppt

第四章 中药制剂的含量测定 本章重点： 1、掌握中药制剂含量测定的样品前处理方法及测定方法的效能指标。 2、掌握可见-紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱法在中药制剂分析中的应用。 3、了解荧光分析法和原子吸收分光光度法在中药制剂分析中的应用。,含量测定：是中药制剂质量控制的重要指标。 含量测定目的：通过研究制剂中某种成分的含量高低来判定药物的优劣，保证临床用药的安全、有效。 含量测定对象：有效成分、指标成分、毒性成分、贵重药材成分。,中药制剂与化学药品含量测定的区别： 1、对象不同：化学药品成分明确组成单一；中药制剂组成及成分复杂。 2、供试品溶液制备不同：化学药品方法简单；中药制剂方法繁琐，大多需要净化分离。 3、待测成分确定不同：化学药品待测成分明确，多为主要成分；中药制剂需先根据中医药理论选定药味，再综合考虑各方面因素选定待测成分。 含量测定的步骤：药味的选定、测定成分的选定、测定方法及条件的选定、方法学考察。,第一节 含量测定样品的处理 样品处理的作用： 充分释放被测成分 除杂纯化 富集浓缩或衍生化，以测定低含量被测成分 所用溶剂符合测定要求 一、样品的粉碎: 样品粉碎的目的： 保证所取样品均匀且有代表性 较快且完全地提取被测成分 粉碎设备： 粉碎机、研钵、食品处理机等 生物组织样品用高速匀浆机或玻璃匀浆器。,粉碎的注意事项： 粉碎度按实际情况进行，不可太粗或太细。太粗影响提取效果，太细一方面造成粘性成分附着，妨碍进一步提取，另一方面造成过滤困难。 避免由于设备的磨损或不干净等原因而污染样品。 防止粉尘飞散或挥发性成分损失。 不能丢弃不宜粉碎的大颗粒物质，要反复粉碎后使其全部过筛网。,二、样品的提取： 常见提取方法：冷浸法、回流提取法、连续回流提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法。 冷浸法： 浸泡后溶液的两种测定方法。 部分测定法（等量法）：浸泡后的溶液过滤，精密量取与一定重量的样品相当的滤液进行测定。（此法不适合挥发性较大的提取溶剂） 全部测定法（总量测定法）：浸泡后的溶液过滤，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定。（此法克服了部分测定法的缺陷，且提取溶剂不必精密加入）,三、样品的分离净化： 常见净化方法：沉淀法、蒸馏法、液-液萃取法、色谱法、固相微萃取法、消化法。 沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法。 注意事项： 过量试剂若干扰被测组分的测定，应设法除去。 大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分应不能产生共沉淀而损失。 被测成分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。,蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。 注意事项： 最常用水蒸气蒸馏法。 适用于挥发油，小分子生物碱的分离。 优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来。,液一液萃取法： 1、直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。 萃取次数：实验考察（符合样品回收率的要求） 溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱选择极性 适当的溶剂。 水相pH的控制：对弱酸性成分 pHpKa-2 对弱碱性成分 pHpKa+2(此处为其共轭酸的pKa) 盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。,2、离子对萃取法：在适当pH介质中，某些有机酸、有机碱形成的离子与带相反电荷的离子定量的结合成为弱极性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。 适用于高度离解的有机酸、有机碱的萃取（不能用直接萃取法）。 中药制剂分析主要用于生物碱（B）的分离。 离子对试剂：常为酸性染料（In-） 如：溴百里酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG） 注意：水相pH值的控制 离子对试剂的选择,色谱法： 分类： 1、按分离原理分类：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱 2、按操作方式分类：柱色谱、薄层色谱、纸色谱 3、按装柱方法分类：湿法装柱、干法装柱 方法：分离时常用柱色谱法。将样品溶液加到装有合适固定相的色谱柱中.或者将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定;或者使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。 适用于：最适合总类成分的含量测定。,1、氧化铝：用于生物碱、苷类等碱性、中性成分的 测定，吸附酸性成分. 硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。 2、键合相硅胶： 十八烷基键合相硅胶（C18，ODS）、 C8（反向色谱） 分离脂溶性成分 苯基、氰基键合相硅胶（正向色谱） 分离水溶性成分,3、大孔树脂：分为极性和非极性型 ，D101最常用。 4、聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用于含酚、酸、醌类、黄酮类药物样品液的净化分离。 5、硅藻土、纤维素：亲水型填料，原理为分配作用 流动相：与水不混溶的有机溶剂 洗脱：亲脂性的成分 6、离子交换树脂：用于除去样品中的离子或萃取可离解化合物(弱酸、弱碱药物)。,第二节 含量测定方法的验证 方法验证：又称效能指标，是方法学论证的重要指标，也是药品质量标准中方法学考察的主要内容。 含量测定方法学考察的目的：是证明采用的分析方法是否适合于相应的检测要求。在建立中药质量标准时，方法验证的过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明中。 验证的内容：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、线性、范围和耐用性。,一、准确度：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（%）表示。中药制剂分析常用加样回收率来考查。准确度应在规定范围内测试。 （一）含量测定的准确度： 用已知纯度的对照品做加样回收测定，即已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品进行测定，得总量（C）。 加样回收率(%)=（CA）B100%， n5 A为供试品加样前被测成分含量，C加样后实测总量，B 为加入对照品量,n为实验次数。,（二）数据要求： 加样回收率试验中，加入对照品后，亦应在规定的 标准曲线线性范围内。加样回收率试验至少做五次。常用测定方法有两个：取同一浓度的供试品6份，分别加入等量的对照品，做六次平行试验，用6个测定结果进行评价，对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制在1：1左右。取同一浓度的供试品9份，每三份加入等量的对照品一定量，制成有3个不同浓度，每个浓度有3份的供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。一般中间浓度溶液的对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制在1：1左右为宜。 中药制剂含量测定所得的单份供试品回收率及所有供试品平均回收率均在95%105%之间，特殊操作繁复的可略低（但不可小于90%或大于110% ）。回收率的RSD不大于3% （RSD=S/X平均100%）。,加样回收率试验举例： 取已知含量的样品6份，每份约0.05g，每份含有效成分黄芩苷4.79%，精密称定，置25mL量瓶中，分别精密加入黄芩苷标准品贮备溶液5.0mL（0.3884mg/ml），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用高效液相色谱仪检测，进样10L，测定并计算回收率，结果表明该方法准确度好。,黄芩苷加样回收试验结果,二、精密度：系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度。 (一)精密度表示方法： 1、偏差（d）:单项测定值与平均值的差值 2、标准偏差：S= 3、相对标准偏差： RSD（%）=S/X平均100%（最常用） (二) 重复性、中间精密度及重现性,(二)重复性、中间精密度及重现性： 1. 重复性：在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。测定方法为在规定的范围内， 取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价（六点测定）；或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价（九点测定）。毕业论文水平的实验只做到重复性即可。 2中间精密度：同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。测定方法同前重复性实验，为考察随机变动因素对精密度的影响，申报新药做到中间精密度。 3重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。测定方法同前重复性实验，当分析方法将被法定标准采用时（如建立药典分析方法），应进行 重现性实验。 (三)数据要求：常用RSD表示，应不大于3%。,重复性试验举例： 精取六份五味子浸膏，每份168mg，按供试品溶液的制备方法制备六份液相供试品溶液,按高效液相色谱条件进样测定,每份进10l,记录峰面积，计算五味子醇甲含量(mg/g)，结果见下表，表明该方法重复性良好。,重复性测定数据表,三、专属性：又叫选择性，系指在其他成分（如杂质、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。考察的是分析方法对被测成分是否有准确而专属的测定能力。考察方法常用阴性对照法，即以被测成分与除去该成分或除去该药材的成药进行对照，考察被测成分的测定是否受到干扰组分的影响。 如用色谱法、光谱法等应附代表性谱图，例子见书P72.,四、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或质量直接呈正比关系的程度。 （一）测定方法：为在规定的范围内制备至少6个浓度的样品，以测得的响应信号作为被测物浓度或质量的函数作图，观察是否呈线性。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。 （二）数据要求：应列出回归方程，相关系数（r）和线性图。相关系数一般要求r0.999，在TLCS定量中要求r0.995。,线性关系举例：标准曲线的制备： 精密量取五味子乙素对照品溶液（0.208mg/ml ）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，分别置具塞试管中，蒸干，各精密加10变色酸溶液1ml，加硫酸溶液(水1份，浓硫酸2份) 9ml，摇匀，置水浴上加热30分钟，放冷，用分光光度仪在570nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线，结果如下表（结果表明，在绘制标准曲线的浓度范围内4.1629.12 g/ml 线性关系良好）。,五味子乙素标准曲线数据表,五、范围：范围是指能到达一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。如上例，线性范围为： 4.1629.12 g/ml 六、耐用性：系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。 耐用性试验举例（变动的为时间）： 精取五味子浸膏175.3g，按供试品溶液的制备方法制备一份液相供试品溶液,室温放置24小时,分别在0、2、4、8、12、24小时按HPLC色谱条件进样测定,每次10l,记录峰面积，计算五味子醇甲含量(mg/g)，结果见下表。,耐用性测定数据表,从上表可见，六个样相对标准偏差1.99%，小于3%。说明用此测定方法测定样品中被测成分含量,在24小时内稳定，因此本测定方法对时间有一定耐用性。,1、评价中药制剂含量测定方法的回收试验结果时，一般要求（ ） A.回收率在85115、RSD5 （n5） B.回收率在95105、RSD3 （n5） C.回收率在80100、RSD10 （n9） D.回收率80、RSD5 （n5） E.回收率在99101、RSD0.2 （n3） 2、下列关于分析方法效能指标的概念描述正确的有( ) (多选) A.在大多数情况下我们研究分析方法的精密度是指重现性. B.被法定标准采用的分析方法是进行过重现性试验的. C.选择性是指在样品中有其他组分共存时，该分析方法对被测物准确而专属的测定能力. D.耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受能力. E.准确度实验常用9点测定法.,第三节 常用定量分析方法 常用测定方法：化学分析法 光谱法（UV-Vis等） 色谱法（HPLC、GC 、TLCS等）,一、化学分析法： 1、包括重量分析法和滴定分析法. 2、适用范围：主要用于测定制剂中含量较高的一些有机成分及含矿物药制剂中的无机成分。 如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药成分 3、特点：所用仪器简单。 但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定。 4、仪器： 重量分析常用仪器：分析天平、称瓶、干燥器、滤器（滤纸、垂熔玻璃漏斗）； 滴定分析常用仪器：滴定管、容量瓶、移液管。,（一）重量分析法：包括挥发法、萃取法、沉淀法。 挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。 如：干燥失重、水分测定 总灰分及炽灼残渣的测定 萃取法：根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。 适用：总皂苷、总有机酸、总生物碱 如：冰硼散中冰片的含量测定、地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定、甘草浸膏中甘草酸的含量测定。 沉淀法：将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量。适用于：制剂中纯度较高的成分。 如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定 苦参片中苦参总碱的含量测定 复方元胡注射液总碱的测定,（二）滴定分析法：是容量分析法。 适用：常量组分的分析. 特点：操作简便、快速，结果准确,一般相对误差0.2%,但反应条件较苛刻且不适合微量成分测定。 条件：反应必须定量完成。 迅速完成。 有适当方法指示终点。 酸碱滴定法：适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。 对KC10-8的酸、碱组分 ，可在水溶液中直接滴定。 对KC10-8的弱酸、弱碱，用间接滴定或非水滴定。,沉淀滴定法：主要用于测定生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其它有机成分的含量。多用以下三法： 银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物,四苯硼钠法：+生物碱白色沉淀 亚铁氰化钾法：与生物碱生成沉淀,配位滴定法：包括EDTA法和硫氰酸铵法。测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。 氧化还原滴定法：适用于测定具有氧化还原性的物质，如酚类、糖类及矿物药中Fe、As等。,二、可见紫外分光光度法（UV-Vis）： 特点：灵敏度高（107104 g/mL）；准确度高（相对误差25）；仪器价格低；操作简单，能满足微量组分的测定要求。所以应用广泛（2005版中国药典37个品种用此法进行含量测定）。 适用：在可见紫外区有吸收的物质。 含量测定原理：朗伯比尔定律： A = KLC A为吸光度；L为液层厚度；C为溶液的浓度； K为吸收系数，即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸收度。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。吸收系数越大，吸光物质吸光能力越强，检测灵敏度越高。,吸收系数因溶液浓度单位不同，有两种表达方式： 摩尔吸收系数：指溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度。单位为Lmol1cm1。 百分吸收系数E1%1cm:溶液浓度为1（即1g/100ml），液层厚度为1cm时的吸收度，单位为100mLg1cm1。 百分吸收系数在药物定量分析中应用广泛，我国现行药典均采用百分吸收系数。 二者关系： M 为待测物质摩尔质量,紫外可见分光光度计简介： 组成结构：,光源,单色器,吸收池,检测器,信号显示系统,光源：钨灯或卤钨灯可见光源（3501000nm） 氢灯或氘灯紫外光源（200360nm） 单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件（棱镜、光栅） 吸收池：玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区。 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。 （参比溶液和供试品所用的吸收池要相匹配） 检测器：将光信号转变为电信号的装置。包括光电池、光电 管、光电倍增管、二极管阵列检测器。 记录装置：显示系统。（荧光屏显示和打印等）,实验步骤：,开机预热,选择光源,选择波长,参比溶液,吸光度为0,样品测定,分光光度计类型： 单光束分光光度计：从光源到检测器就一束光。使用时要来回拉动吸收池，有移动误差。 双光束分光光度计：交替的两束光分别照射样品池和参比池。使用时不用拉动吸收池，可以减小移动误差，还可以自动扫描吸收光谱。,含量测定方法：定量依据：AECL （一）单波长分光光度法：常用于测定制剂中某一总成分含量。 测量条件的选择： 测定波长的选择：原则 “吸收最大，干扰最小”。测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长处； 溶液吸收度的范围：应控制在0.30.7（在此范围内最符合朗伯比尔定律，检测误差最小）之内，可以通过调节溶液浓度的方法来达到。,1、吸收系数法：测定供试品溶液在规定波长处的吸收度，根据被测成分的吸收系数计算其含量。该法无需对照品，方法简便。但误差较大，吸收系数通常应大于100时才能应用此法。,例：维生素B12 的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12在样品中的百分含量？,2、对照品比较法：按各品种项下要求，在相同条件下分别配制对照品溶液和供试品溶液，在规定波长处，分别测其吸收度，计算供试品溶液中被测组分的浓度。适用于难得到吸光系数的情况。 使用外标一点法，在固定仪器和测定条件时， A供/A对= KLC供/KLC对 A供/A对=C供/C对 C供=C对A供/A对 被测组分在样品中含量（%）=（A供/A对） C对Dm（D为稀释体积，m为供试品取样量） 对照品比较法应用的前提是方法学考察时标准曲线应过原点。 对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分的标示量的10010，所用溶剂完全一致。,3、标准曲线法：配制一系列不同浓度的对照品溶液（n5） ，分别测定吸光度，绘制A-C曲线并求出回归直线方程（r0.999）。在相同条件下测定供试品溶液的吸光度，求得供试品中被测成分的浓度或含量。因其限制条件少，测定准确，是使用分光光度仪时最常用的含量测定方法，且条件不变时标准曲线可多次使用，适合批量样品的测定。 前面方法学考察中举过分光光度法绘制五味子乙素标准曲线的例子： 精密量取对照品溶液（0.208mg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，按规定方法制成供分光光度仪测定用溶液，在570nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线，结果如下表（结果表明，在绘制标准曲线的浓度范围内4.1629.12 g/ml 线性关系良好）。,供试品溶液的制备及测定法：供试品溶液三份按相同方法制成供分光光度仪测定用溶液，在相同条件下测定吸光度分别为0.456、0.463、0.461，代入标准曲线： C=(A+0.00271)/0.03301，计算三份供试品溶液浓度分别为13.90 g/ml 、14.11 g/ml 、14.05 g/ml。,（二）计算分光光度法： 1、适用：多组分的含量测定 2、原理：吸光度具有加和性 3、方法： 双波长法（等吸收点法和系数倍率法） 三波长法 导数光谱法,（三）对仪器和溶剂的要求： 1、仪器波长校正：利用汞灯或氘灯的特征谱线。 2、吸收度的准确度：用重铬酸钾的硫酸溶液检定。 3、杂色光的检查：用碘化钠和亚硝酸钠的水溶液。 4、溶剂和比色皿的吸收度规定： 220240nm, A0.40 241250nm, A0.20 251300nm, A0.10 300nm以上, A0.05,三、薄层扫描法（TLCS）： （一）定义：是用一定波长的单色光（单一波长的光，非单一颜色的光）照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描（斑点对光有透射和反射作用），利用扫描得到的响应信号进行含量测定。 （二）特点： 1、测定准确度高：相对误差2%5%（HPLC为1%3%） 2、检测灵敏度高：薄层吸收扫描法可检测10-610-7g/斑点， 薄层荧光扫描法可检测10-910-11g/斑点. 3、检测速度快； 4、分辨率高：斑点距离在20m可分辨（此距离肉眼看不见）,5、重现性差；（薄层板在敞开系统中铺制） 6、吸附剂的种类受到限制：如扫描键合相硅胶铺制的薄层板不能进行含量测定。（因散射参数SX未知） （三）基本原理： 1、薄层吸收扫描法:适用于在可见、紫外区有吸收的化合物，或能衍生成上述化合物的样品组分的含量测定。分别以钨灯（350800nm）和氘灯（200400nm）为光源,利用透射法测定薄层斑点的吸收度（转化成吸收峰峰面积）进行含量测定。 因薄层板(许多细小颗粒组成的半透明物质)存在明显的散射现象，除透射光和反射光外还有许多不规则散射光存在，不符合LB定律，故斑点中物质的浓度与吸收度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。,Kubelka-Munk理论及曲线 薄层色谱斑点的吸光度，涉及两个参数，散射参数SX与吸收参数KX。 SX与薄层板厚度（X）及散射系数（S）有关。不同厂家的吸附剂和薄层板，其SX值不同。KX与薄层板厚度（X）及吸收系数（K）有关，待测组分的浓度是通过KX来反映的，即KX=C（浓度）。用A对KX作图所得曲线即为薄层扫描定量分析的吸收度-浓度曲线（ Kubelka-Munk曲线 ）。该曲线是一条弯曲的线，弯曲度与SX呈正比，SX值越大，弯曲度越大。 SX=0时为直线，K-M曲线说明固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响（A与KX呈非线性），解释了薄层扫描法中标准曲线的弯曲问题。当SX0时，进行定量分析时曲线要进行处理。处理方法有曲线校直法和计算机回归法。常用曲线校直法，即选择适当的SX值将曲线在一定范围内校正为直线，用校正后的直线进行定量分析。,2、薄层荧光扫描法:适用于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。光源用氙灯或汞灯。荧光测定法专属性强，灵敏度比吸收法高13个数量级，最低可测1050pg(1pg=1012g)的样品，但适用面窄。 用一定波长的激发光照射展开后的薄层，测定薄层斑点在固定发射波长下的荧光强度，进行定量分析。当样品溶液浓度很稀时(ECL0.05)，荧光物质的荧光强度F与物质浓度C的关系式为： F=2.3KI0ECL 或F=KC K为常数（与荧光效率有关），I0为激发光强度，E为百分吸收系数，L为薄层厚度。由上式可见，在点样量很小时，斑点中组分的浓度（C）与其荧光强度（F）成线性关系。在实际计算时，用斑点荧光强度的积分值（峰面积）与斑点中组分含量代替上式中的F与C。,（四）仪器及基本操作步骤：,薄层扫描仪主要由光源（钨灯、氘灯、氙灯、汞灯）、单色器（从复合光中分出测量所需单色光）、样品室、检测器、数据处理系统（把检测器的信号进行积分计算）组成。,基本操作步骤： 1、供试品预处理：样品经适当方法提取、分离,做成供试品溶液。 2、点样：在一块薄层板上交叉点上供试品和对照品，一同展开，供试品点样不少于4个，对照品每一浓度不少于2个。 3、展开：展开距离15cm左右为宜，被分离物质Rf值在0.20.8之间，展开过程中，温度、湿度变化不应太大。 4、薄层扫描： （1）检测方法的选择：吸收度法适用于紫外-可见光区有吸收的化合物。荧光法适用于荧光物质及荧光衍生物。,（2）扫描条件的选择： 波长的选择：单波长测定因不能消除薄层板不均匀带来的误差只可用于定性鉴别。双波长测定用于定量，是用两束不同波长的单色光，一束测量样品称测定波长（S）,另一束作为对照，称参比波长（R），用两者交替照射斑点，测定斑点对两种波长的吸收度或荧光强度之差从而计算斑点中被测成分含量。 测定波长（S）：一般选待测组分的最大吸收波长或产生最大荧光强度的波长； 参比波长（R）：选待测组分不吸收、吸收很小或不产生荧光的波长。,扫描方式的选择： 线性扫描：用一束比斑点略长的光带照射薄层板的一端，薄层板相对于光带作直线运动到另一端。特点是适合规则斑点的测定，测定速度快，常用于定性。 锯齿扫描：是用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运行轨迹为锯齿形。因光束反复通过斑点，准确度高，重复性好，常用于定量，特别适于形状不规则和浓度不均匀斑点的测定，但扫描速度较慢。 5、数据处理：设定扫描起始位置和扫描波长。 显示出检测到的色谱图和峰面积结果。 根据对照品的浓度和相应峰面积制作标准曲线。 根据标准曲线和供试品被测成分峰面积计算被测成分含量。,（五）定量分析方法： 1、方法学考察：说明新建方法的可靠性。包括工作曲线、定量结果的精密度及准确性、统计检验等内容。 （1）工作曲线：对于用Kubelka-Munk曲线校正法进行定量校准的仪器，绘制色谱峰峰面积与对照品点样量间的工作曲线的目的首先并非直接用于定量，其目的是： 检查所选择的散射参数SX值是否适宜。 SX值适宜则标准曲线被校正为直线，否则调整SX值再校正，直至在一定点样量范围内标准曲线成直线为止。 考察标准曲线是否过原点，以便确定采用外标一点法还是外标两点法定量。,确定点样量的线性范围。即使采用曲线校正，标准曲线也只是在一定点样量范围内为直线，因此需确定点样量的上、下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。为克服薄层板间差异，采用随行标准法。 （2）分离度：用于含量测定时，要求定量峰与相邻峰的分离度应大于1.0。 （3）重复性：取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点6点以上，展开后测定待测成分的峰面积，计算RSD值，要求RSD3%，需显色后测定的RSD5%。 （4）准确度：常用加样回收率（R）来衡量，其值应在95%105%之间，测量数据一般为56个。,（5）稳定性：展开后斑点是“敞开”的，易受环境的影响而褪色，从而影响分析结果的准确性，因此必须考虑斑点的稳定性。扫描操作必须在斑点稳定期内完成。 （6）统计检验：检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度间是否存在显著性差异，说明新建定量方法是否优于旧方法。 统计检验包括t检验和F检验。 F检验是方差齐性检验，是精密度差别检验，检验两组数据的偶然误差是否存在显著性差异。 F检验是单侧检验，若方差无显著性差异，两组数据可直接进行t检验。 t检验是两个样本的均数检验，是准确度差别检验，检验两组数据的系统误差是否存在显著性差异。是双侧检验。,2、定量方法：有外标法、内标法及回归曲线法等。 （1）外标法：该法简便，但点样量必须准确，要采用定量毛细管和市售薄层板。因板间差异大，应采用随行标准法，即供试品与对照溶液交叉点在同一薄层板上，供试品点样不少于4个，对照品每一浓度不少于2个，两者峰面积接近时误差小。扫描时，应沿展开方向。 外标一点法：先绘制标准曲线，标准曲线过原点时采用 外标一点法定量，只需点一个浓度的对照品溶液，与供试品同板展开，测定含量。 C标=FA标， 求出F， C样=FA样 C为组分的含量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F为比例常数。,外标两点法：标准曲线不过原点时用此法，至少需两种不同浓度的对照品溶液（或一种浓度两种点样量），才能确定一条直线，公式如下： C=F1A+F2 C、A同前，F1是比例常数，F2是纵坐标截距。较先进仪器可自动给出，否则也可自己求算。根据两种浓度对照品溶液C1、C2可测出其相应峰面积A1、A2代入上式解二元一次方程，求出F1与F2，确定直线方程后再测出供试品的峰面积，即可计算出供试品浓度。,（2）内标法：首先选择一个内标物，要求供试品中不存在且纯度高，化学性质稳定，在薄层上能与被测成分很好分开且其色谱不受其它成分色谱干扰，便于称量的物质。 准确称取一定量内标物分别加入供试品和对照品溶液中（加入量应接近被测成分含量），同一薄层板上展开，在薄层扫描仪上测定两者中内标物与被测成分的峰面积，用被测成分与内标物的峰面积比代替外标法中的被测成分峰面积，用被测成分与内标物的浓度比代替外标法中的被测成分浓度，计算。即： 内标一点法：标准曲线过原点，C/Cs=FA/As 内标两点法：标准曲线不过原点，C/Cs=F1A/As+F2, C、Cs分别是被测成分与内标物的浓度或量；A、As分别是被测成分与内标物的峰面积， F1是比例常数，F2是纵坐标截距。较先进仪器可自动给出，否则也可自己求算。 内标法可消除点样量不准产生的误差，但内标物不宜找且操作复杂，故不及外标法多用。,（3）回归曲线法：属计算机回归法，由回归方程计算供试品含量，不常用。 （六）影响薄层扫描定量的因素： 1、吸附剂性能及薄层质量：吸附剂颗粒要细，且分布均匀，薄层板薄厚要均匀。 2、点样：TLCS法最主要杂质来源，供试品和对照品溶液点样量接近，遵循随行标准。 3、展开条件：展开距离15cm左右为宜，被分离物质Rf值在0.20.8之间，展开过程中，温度变化不应太大。 4、显色：显色要均匀。 5、扫描：扫描条件选择适当，扫描方向一致，通常是沿展开方向。,1、薄层扫描最常用的定量方法是（ ） A、内标法 B、外标法 C、追加法 D、回归曲线定量法 E、曲线校直法 2、影响薄层扫描定量的因素是（ ）（多选） A、吸附剂的性能及薄层板的质量 B、点样操作与随行标准 C、展开条件 D、显色 E、扫描仪输入的参数是否合理,四、气相色谱法（GC)： (一)定义：是以气体为流动相的色谱分析方法。 (二)适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性的组分的分析.主要包括挥发油及其它挥发性组分：冰片、桉叶素、樟脑、丁香酚、龙脑等。中药制剂含水量、含醇量的测定。 （三）特点： 高效能。 高选择性：特别适合于复杂试样。 高灵敏度：可以检测10111013g的物质。 分析速度快、操作简单：色谱操作及数据处理自动化。 应用比较广泛：热稳定性好的气体和易挥发或可衍生化为气体的物质均可。 弱点：受试样蒸气压限制。另外载气种类可选择性小.,（四）仪器及分析流程： 现在仪器大多连在电脑上进行自动化控制。,载气减压净化稳压 色谱柱检测器记录仪 进样 五大系统：载气系统、进样系统、分离系统、检测系统 记录系统,（五）基本原理： 保留时间tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间。 死时间t0：组分在流动相中的所消耗的时间(即流动相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时间)，又称流动相保留时间。 调整保留时间tR：组分的保留时间与死时间之差值， 即组分在固定相中滞留的时间。（tR= tR t0） 半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽。 峰宽W：正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交的截距。 标准差：正态分布色谱曲线两拐点距离的一半 对应0.607h处峰宽的一半,1、塔板理论：假定色谱柱每个H高度内有一块塔板，共有若干块塔板，组分在每块塔板两相间分配达平衡，分配系数K小的先出柱。多次分配平衡，K有微小差异组分就可获较好分离。 理论塔板高度H：为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长。 理论塔板数n：组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。 色谱柱柱效用二者衡量，计算公式为：,以调整保留时间tR代替保留时间tR，则得到反映色谱柱实际柱效的有效理论塔板数neff：,可见，当tR一定时，峰越窄，则H越小， n越大，柱效越高，分离性能越好。,2、速率理论： 因塔板理论有如下缺陷： 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程。 只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的影响因素。 排除了一个重要参数流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速关系更无法提出降低板高的途径。 故而提出速率理论，其吸收了塔板理论的有效成果H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素，提出了Van Deemteer 方程式： H = A + B/u + Cu u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效；,（1）涡流扩散项（多径扩散项）：A 产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒 的阻力导致路径改变产生涡流扩散。 减免方法：填充柱的固体颗粒要小，填充要实。 （2）纵向扩散项（分子扩散项）：B/u 产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开，因两边浓度差导致纵向扩散。 减免方法：适当提高载气流速、选用分子量较大的载气、适当的降低柱温和提高柱压。 （3）传质阻抗项：Cu 产生原因：样品在气液两相分配，组分运动太慢从而造成峰扩张。 减免方法：适当减少固定液的用量，降低液膜厚度。 因开口毛细管柱色谱涡流扩散项A=0，H=B/u+Cu, 其柱长又远大于填充柱，故柱效比填充柱高得多，多用于难分离组分的检测。,3、分离度的计算： （1）定义：分离度用相邻两组分峰顶间距离对峰底宽平均值的倍数表示，是衡量色谱分离条件优劣的参数。 定义式： R1.0, 两峰基本分离 R1.5, 两峰完全分离 R1. 0， 两峰完全未分离,（2）气相分离方程式及影响分离的因素： 方程式： a b c a为柱效项：影响色谱峰的宽窄，主要取决于色谱柱性能。,增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段。 提高柱效的途径：增加柱长；降低板高.,b为柱选择性项：=K2/K1=k2/k1= tR2 / tR1 ， 影响峰的间距， 主要取决于固定相性质及柱温。 增大柱选择性是改善分离度的最有力手段，选择合适的固定相使与不同组分的作用产生差别才能实现分离。另外降低柱温可以增大柱的选择性。,c为柱容量项：影响峰位，主要取决于固定相用量、柱温和载气流速。,综合考虑分离度、分离时间和峰检测几项因素 控制k2的最佳范围是25。GC中，增加固定液用量和降低柱温可以增加k2。,4、系统适用性实验：用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 （1）色谱柱理论塔板数n：n5.54(tR/W1/2)2 如理论塔板数低于各品种项下规定的最小理论塔板数，可改变柱长，柱温、载体性能等使其达到要求。 （2）分离度：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) R1.5（两峰完全分离） （3）重复性：取各品种项下对照品溶液连续进样5次，其峰面积测量值相对标准偏差RSD2.0 (n=5) （4）拖尾因子：T=W0.05h/2d1 (d1峰极大至峰前沿之间的距离) 1.05T0.95,（六）实验条件的选择：实验条件包括分离条件和操作条件。分离条件是指色谱柱，操作条件是指载气流速、进样条件等。 1、固定相的选择： （1）气液色谱：固定相由固定液和载体组成. 固定液的选择： 按“相似相溶”规律：极性相似或官能团相似。 按组分性质主要差别： 沸点相差大的选非极性固定液; 极性差别大的选极性固定液; 复杂样品选用混合固定液进行分离。 高沸点组分低固定液配比（1%3%） 低沸点组分高固定液配比（5%25%） 载体的选择：常用适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。,（2）气固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球（具有吸附、分配及分子筛三种作用），主要用于分离水及含羟基（如醇）的化合物。 2、柱温的选择： （1）基本原则： 在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。 根据样品沸点情况选择合适柱温，柱温应低于组分沸点50100。宽沸程样品应采用程序升温，可改善分离效果，缩短分析时间，提高灵敏度。 柱温不超过固定液最高使用温度。,（2）具体操作：,3、载气的选择：主要从对峰展宽（柱效）、柱压降（气体通过色谱柱降低的压力）和检测灵敏度的影响三方面考虑。 （1）N2是最常用的载气。 （2）载气流速较低时，宜用N2，流速高时，宜用H2、He。 （3）较长色谱柱，宜用H2作载气。 （4）热导检测器应选用H2、He；氢焰检测器、电子捕捉检测器，一般用N2。 （5）常用载气流速为2080ml/min。,4、其他条件的选择： （1）气化室（进样口）温度：等于或稍高于试样的沸点，不超过沸点50以上，高于柱温3050。 （2）检测室温度：应高于柱温3050或等于气化室温度。 （3）进样时间和进样量：进样速度快，在1s以内。试样不超载，否则造成拖尾峰，一般气体样品进样0.11ml；液体0.11L.,5、检测器： （1）热导检测器（TCD)：通用型检测器，结构简单、适用范围广（无机物、有机物），不破坏样品。但灵敏度低，噪音大。载气多用H2。 （2）氢焰离子化检测器（FID)：制剂分析中应用最广泛的检测器。专属性检测器（只能测含C有机物），灵敏度高（ TCD），死体积小，线性范围宽，但易破坏样品。载气多用N2。 （3）氮-磷检测器（NPD):专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。 （4）电子捕捉检测器（ECD）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物，如含卤素、硫、氧等化合物的分析。 电负性越强,检测器灵敏度越高.,（七）定量分析方法：常用的定量方法有内标法、外标法、 归一化法和标准溶液加入法，以峰高或峰面积定量(常用). 首先讲两个概念: 峰面积的测量： 目前常用气相色谱仪均有色谱工作站，可直接给出A，h，W1/2。,校正因子的测定： 前提是同一物质用同一检测器检测,物质的m或CA. (1)绝对校正因子的测定:,(2)相对校正因子的测定:,fmi为相对校正因子,其与待测物、基准物和检测器类型有关，与操作条件变化（如进样量）无关. 基准物：热导检测器（TCD）苯； 氢焰离子化检测器（FID）丁庚烷。,1、内标法：气相色谱最常用的定量方法. 以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量。,对内标物要求： a内标物须为原样品中不含组分. b内标物能单独出峰且与待测物保留时间应接近，但与待测组分可完全分开,R1.5. c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质,加入的重量接近于组分的含量.,内标法优点：只需内标物及待测组分出峰。无需准确进样，适合微量组分的含量测定. 缺点：找合适内标物困难(选择合适内标物是内标法的关键);需已知校正因子;样品的配制较复杂.,内标法加校正因子:精密称取待测物质的对照品R,加入适量内标物S进样,记录色谱图,测量对照品和内标物的峰面积,则其相对校正因子为:,再取加入内标物的供试液,进样,记录色谱图,测量供试液中待测组分和内标物的峰面积,计算含量:,内标对比法（内标一点法） 把等量内标物分别加入等体积已知浓度对照品溶液和待测样品溶液中，样品溶液浓度最好与对照品溶液相当。 前提:Ci/CsAi/As的截距为零.,内标对比法特点：不需要校正因子,内标工作曲线法： a、配制一系列不同浓度的等体积对照液，并加入相同量的内标物，进样，测标准品和内标物的峰面积Ai和As，以Ai/As对对照溶液中对照品浓度与内标物浓度之比Ci/Cs作图。计算回归方程式 Ai/As= a Ci/Cs+b 及相关系数（ a：斜率；b：截距 ），求出斜率、截距后确定标准曲线。 b、与对照液等体积待测试样溶液中也加入与对照液相同量的内标物，测得Ai/As。 c、把b中测得比值代入标准曲线计算试样的含量。,特点：不需要校正因子且比内标一点法精确。,2、外标法：以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号（峰面积）相比较进行定量的方法。 外标法关键：进样量准确，实验条件恒定。 优点：操作简便，不用校正因子，不必加内标物，只需待测组分出峰。 缺点：结果的准确度与进样量和操作条件的稳定性有关,易产生误差。,外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量，中国药典用气相测水分用此法。 前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近。 C标=FA标， 求出F， C样=FA样 C为组分的浓度，A为测得该组分的峰面积，F为比例常数。 外标两点法：用两种浓度对照物求算样品中待测组分含量。 前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度。 C=F1A+F2 C、A同前，F1是比例常数，F2是纵坐标截距。较先进仪器可自动给出，否则也可自己求算。根据两种浓度对照品溶液C1、C2可测出其相应峰面积A1、A2代入上式解二元一次方程，求出F1与F2，确定直线方程后再测出供试品的峰面积，即可计算出供试品浓度。,工作曲线法：用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积对对照品的量（或浓度）作线性回归，求出斜率、截距，确定标准曲线而后计算样品的含量。 前提：进入检测器样品中被测成分含量与峰面积成正比且待测物峰面积在标准曲线范围内。 3、归一化法： 前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰。 依据：组分含量与峰面积成正比。 适用范围：只能粗略考察供试品中被测物的含量，不适合微量组分的测定。,质量归一化法公式：,各组分为同系物或性质相近，校正因子相近时可直接采用面积归一化法计算：,优点：定量结果与进样量、重复性无关，色谱条件略有变化对结果几乎无影响。 缺点：所有组分必须在一定时间内都出峰，必须已知所有组分的校正因子，不适合微量组分的测定。,4、标准溶液加入法：近年来出现新方法。为精密量取待测成分对照品适量配制成对照品溶液，取一定量精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定含量，再扣除加入对照品的量，即得供试品中待测成分的含量。 目的：因气相色谱供试品中被测成分多含量较低，测量时误差较大。此方法就是要加大检测样品量，减小误差，其基本定量方法同前三个。,（八）注意事项： 1、手工进样时，因进样体积不宜控制，最好用内标法定量。自动进样时，可采用外标法定量。 2、当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，以标准溶液加入法为准。,五、高效液相色谱法（HPLC）： （一）定义：是在经典的液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵，高效固定相以及高灵敏度在线检测器发展而成的分离分析方法。适用于测定挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋白质、生物碱、甾体等。 HPLC与经典液相色谱比较：1、采用高压泵和高效固定相； 2、采用高灵敏度检测器； 3、分析速度快。 HPLC与气相色谱比较： 1、应用范围广； 2、流动相选择范围宽； 3、室温下分离。 （二）特点： “三高” “一快” “一广” 高柱效n104/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,（三）高效液相色谱仪与工作流程：,（四）基本原理： 1、塔板理论：,2、速率理论：,因在HPLC中流动相为液体，扩散系数很小，纵向扩散项B/u 可忽略不计.,流动相流速对HPLC板高的影响：,（五）HPLC法实验条件的选择： 1、色谱柱的选择： 反相色谱