肿瘤细胞与分化、凋亡一.ppt

肿瘤细胞与分化、凋亡(一),源于一位权威专家的课件，和大家一起分享,前 言,大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等阶段。并且，各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因失活。表现为增生过度、分化异常、凋亡受阻。,长期以来，“细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞”的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手术切除、化疗、放射或免疫治疗。1971年，Friend报告小鼠红白血病细胞（MEL）可被二甲基亚砜（DMSO）诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。,细胞分化与肿瘤,一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念,1. 分化(differentiation） 细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。如人起源于一个受精卵，通过细胞分裂形成内、中、外三个胚层细胞。,2. 反分化 (retro-differentiation) 又称去分化(dedifferentiation)，肿瘤的反分化是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象。恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟。,3.再分化（redifferentiation） 又称逆转（reversion），它是指在分化诱导剂的作用下，恶性肿瘤细胞被诱导而重新向正常细胞的方向演变分化，表现为形态学、生物学、生物化学等诸多指标均向正常细胞接近，甚至完全转变为正常细胞。,二、分化诱导剂,1.内源性分化诱导剂 内源性分化诱导剂是由肿瘤或宿主细胞产生的具有分化诱导作用的化学物质。它有以下几种： 集落刺激因子（CSF）：分为CSF-M和CSF-G； 粒细胞巨噬细胞分化因子（GMDF）； 类固醇类化合物：如糖皮质激素和1，25-（OH）2-vitD3； 细胞因子:如TNF-和INF-； 糖脂:如神经节苷脂GM3； 其它，如cAMP等。,2.外源性分化诱导剂 可分为以下几类： 无机化合物：亚硒酸钠等。 简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜(DMSO)、六次甲基二乙酰胺(HMBA)等。 维生素A类化合物：维甲酸、AM80、芳维甲等。 佛波酯类化合物：12-O-十四酯酰佛波-13-乙酸(TPA)。 抗生素类：放线菌素D、丝裂霉素等； 抗癌药：6-巯基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。,三、诱导肿瘤分化的研究,1.体外分化诱导模型 (1)白血病细胞分化诱导模型 最常用的是急性髓性白血病细胞株HL-60。它在分化诱导剂作用下可出现分化表型如形态上由早幼粒白血病细胞分化为中、晚幼粒、杆状核细胞和分叶核细胞，生化方面出现硝基蓝四氮唑还原性（NBT），功能方面出现吞噬活性及趋化性，生物学方面丧失了在软琼脂培养基上形成集落及裸鼠体内移植成活的能力。,(2)实体瘤分化诱导模型 人胃癌分化诱导模型 国内外有人用DMSO、HMBA、suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时，癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学等方面均出现分化特征。 人神经母细胞瘤分化诱导实验 在正丁酸、苯丁酸及其盐类作用后，瘤细胞可形成树突状结构，功能上能产生神经递质合成酶，生物学上其致瘤性明显降低，表现出分化的特点。,人粘液表皮样癌分化诱导实验 MEC-1细胞是上皮样细胞，体外增殖迅速，形态异型性明显，裸鼠体内成瘤性，在HMBA的作用下出现分化表型：生长抑制、核异型性降低、表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒、DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。 其它实体瘤分化诱导模型 其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。,2.体内分化诱导模型 目前，体内分化诱导尚无理想的模型。人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法;人实体瘤采用小鼠肾包膜下移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。分化诱导效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长，细胞标记酶、抗原以及形态的变化来判断。国内用NB4细胞株建立了SCID小鼠人APL腹水细胞模型，在ATRA作用下能发生分化，如明显提高NBT还原率和CD11b的表达，小鼠的生存期明显延长。该模型的建立是评价新的或已有的治疗APL药物和临床前期实验研究的理想模型。,3.分化诱导的临床试验 尽管诱导分化研究取得了成绩，但其最终目的是能应用于临床，ATRA治疗APML能有效地达到临床缓解，被认为是人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范。ATRA能诱导APL病人恶性肿瘤细胞分化成熟，口服ATRA可使大多数患者达到完全临床缓解，即使是传统化疗失败后亦是如此。在欧洲的随机实验证实，ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长生存期。,四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制 1.核内受体途径 维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径。维甲酸受体(RAR)是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋白，有RARS和RXRS两类，每一类又有、三种类型，比较其DNA序列和结构特点，二者属于类固醇-甲状腺素-vitD3受体在内的核内受体超家族。在细胞液内存在RA结合蛋白，能将RA从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位，自身则释放回到胞浆。RA经胞质内RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位，与核受体以二聚体形式结合某些靶序列，进而引起特定基因的转录激活或转录抑制来诱导细胞分化。,Manfredini 等用ATRA和vitD3诱导白血病母细胞分化实验中发现，M0、M1对二者不敏感，M3在ATRA诱导下向粒细胞方向分化，M2则在二者诱导下向单核细胞分化。进一步研究方发现，ATRA和vitD3有效地增加核内VDR，VDR与RXR形成二聚体，再结合到DR3型VD反应元件，从而激活VD反应元件调控的报告基因的转录，启动了M2向单核细胞方向分化。,2. 影响基因转录 Naka 等用9-cis-维甲酸诱导胃癌细胞株分化研究中，发现大多数胃癌细胞株能合成RARs和RXRs mRNA，其中一些细胞株并不停滞于G0/G1期，但可一过性增加p21WAF1蛋白表达，降低CDK7、EGFR及cyclinD蛋白量，减少Rb基因产物磷酸化。认为9-cis-维甲酸抑制细胞生长是通过调控细胞周期，影响维甲酸受体mRNA转录来实现的。,Okabe 发现TPA可诱导Ph阳性白血病细胞 MC3向巨核细胞系分化，血小板糖蛋白GPb表达增强，GPb mRNA水平增高，处理组有GATA-1表达，而GATA-3不表达，未处理组仅GATA-2转录。TPA则通过影响GPb及GATAs转录来诱导MC3细胞分化。 Garingo在诱导MEL分化中发现红细胞特异性基因转录活化，PKA缺陷时则转录出现障碍。转录因子NF-E2是提高球蛋白位点控制区活性的必须成分。DNA与NF-E2结合，-球蛋白位点控制区增强子活性在PKA缺陷细胞中明显低于具有PKA活性的细胞，PKA对转录因子的调控影响了红细胞特异基因转录而诱导MEL细胞分化。,研究表明，染色质重塑在基因转录调控中有重要作用，而组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因素。我们前期研究的基础上，建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型，以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸钠（Sodium butyrate, SB）为阳性对照，观察DADS（diallyl disulfide）在体内外诱导MGC803细胞分化时，对其核组蛋白乙酰化表达的调控作用，以及二者之间的关系，进一步探讨DADS对MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理。,H3 -actin,DADS(mgL-1): 15 30 60 30 SB(mM) : 5 5,DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响,H4 -actin,DADS(mgL-1) : 15 30 60 30 SB(mM) : 5 5,DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响,p21WAF1 -actin,处理时间 （h） : 12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24h DADS(mgL-1) : 0 0 15 15 30 30 60 60,DADS对MGC803细胞p21WAF1蛋白表达的影响,DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响,H3 -actin,各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度(mgkg-1)： 66 50 100 200,H4 -actin,各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度(mgkg-1)： 66 50 100 200,DADS对移植瘤细胞p21WAF1表达的影响,p21WAF1 -actin,各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度(mgkg-1) ： 66 50 100 200,3. 对癌基因和抑癌基因的影响 细胞的基因控制细胞的生长与分化，而这些基因的变化则影响基因的表达或功能被认为是癌变的主要原因。Ras基因在细胞内有H-，K-，N-Ras，编码分子量为21kd的蛋白，p21Ras蛋白具有GTP酶活性。Ras能使3T3细胞恶性转化，促使细胞增殖。C-myc过表达可以促进基因转录和细胞分裂，与肿瘤的形成关系密切。P53基因编码P53蛋白，P53蛋白有野生型和突变型，野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。,李晓光等用大蒜油诱导MGC803细胞分化和凋亡研究中，发现处理组细胞形态接近正常细胞，细胞的致瘤性明显下降，Northern杂交有P53和P21表达增强，提示大蒜油通过促进抑癌基因P53、P21的表达，抑制细胞恶性增殖、诱导凋亡和促进细胞分化。 王代树等用HMBA诱导MGC803细胞分化时发现C-myc和C-H-ras表达抑制。Naka 用9-顺-维甲酸诱导胃癌细胞分化时则有P21蛋白一过性增加。 这些基因在诱导癌细胞分化过程中的改变进一步影响其调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应。,我们发现，DADS作用下，MGC803细胞明显抑制，且呈剂量-效应依赖关系；瘤细胞对Con A的凝集率、 集落形成率与ALP比活性下降；瘤细胞异形性降低，核浆比下降，细胞表面微绒毛数目减少，胞浆内细胞器丰富，胞核及部分细胞器呈退行性变，可见细胞间连接结构；细胞骨架蛋白合成增加与重组，细胞间缝隙连接通讯功能恢复，提示DADS可诱导MGC803细胞分化。DADS处理后的MGC803细胞S期细胞含量减少，G2期细胞含量增加，细胞停滞于G2期，p21WAF1、Rb表达增强，p21ras、c-Myc、突变型p53表达减弱。,MTT比色实验结果,.DADS对MGC803细胞生长的影响,倒置显微镜观察,MGC803细胞（ 20）,DADS组 （ 20）,普通光镜观察,MGC803细胞 HE （ 20）,DADS处理组 HE（ 20）,电镜观察 微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一，本实验通过透射电镜和Con A凝集性实验证实了MGC803细胞在DADS处理后，细胞表面微绒毛明显减少，对Con A的凝集率下降，表明MGC803细胞生物学行为表现出恶性性下降。 未处理组MGC803细胞核浆比例大，核仁均质，以1-2个核仁细胞为主；胞质内细胞器稀少，细胞分化程度低。 DADS处理的MGC803细胞表面微绒毛减少，细胞核浆比例下降，胞质内细胞器丰富，有散在的核糖体，细胞核和线粒体水肿退变，细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连接结构，细胞分化好 。,MGC803细胞核浆比例大，核畸形，线粒体水肿（5000倍）,图示DADS组 细胞电镜结构,图示DADS组 细胞电镜结构,结构的破坏及功能的抑制都是细胞转化早期的异常表现，并与细胞增殖失控及其它恶性行为有关，而微管解聚与DNA合成的启动有关。本实验中观察到DADS处理后，MGC803细胞出现微丝微管合成增加与重组装，呈现规则的放射状分布，提示瘤细胞恶性表型下降，表现为去恶化。,MGC803细胞骨架 考马丝亮蓝染色（ 20）,DADS组细胞骨架 考马丝亮蓝染色（ 20）,细胞结构观察,MGC803细胞骨架呈弥散荧光 间接免疫荧光染色（ 100）,DADS组细胞骨架阳性，呈黄绿色荧光环绕胞核。 间接免疫荧光染色（ 100）,划痕标记后数分钟即可观察到黄色荧光传播，人胃癌MGC-803细胞不显示荧光染料的传播，表明无间缝隙连接通讯功能。 DADS处理后，黄色荧光分布在伤沿细胞列和相邻的数列细胞内，荧光强度从伤沿细胞列到临近数列细胞逐渐减弱，以伤沿细胞列最强，表明间缝隙连接通讯功能恢复 。,细胞间缝隙连接通讯功能,未处理人胃癌细胞 Lucifer Yellow 10,处理组人胃癌细胞 Lucifer Yellow 10,MGC803细胞 (+),p53表达,DADS组 (),p21WAF1表达,DADS组 （）,MGC803细胞 （）,MGC803细胞 (),DADS组 （）,pRb表达,MGC803细胞 （）,DADS组 （）,p21ras表达,MGC803细胞 (+),DADS组 (),C-Myc表达,裸鼠移植瘤 形成实验,移植瘤形成实验,表1. DADS处理后各组裸鼠移植瘤重量变化情况,移植瘤光学显微镜下形态变化 HE40 (A: 未处理组；B: 100mgkg-1DADS处理组),PCNA -actin,各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度(mgkg-1) ： 66 50 100 200,DADS处理移植瘤后PCNA蛋白表达,SSH技术成功构建DADS诱导人胃癌细胞MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库。 差异表达片段DADS1，长208bp，为人类-synuclein基因部分序列，其上调可能与DADS诱导人胃癌MGC803细胞分化相关。 差异表达片段DADS2，长272bp，与鱼类hepcidin-like precursor mRNA具有高同源性，其上调可能与DADS造成细胞内低铁低氧环境，继而诱导人胃癌MGC803细胞分化相关。,不同浓度的DADS可显著抑制HL-60细胞的增殖，且与药物浓度有明显依赖关系；0.625-2.5 g/mL时，NBT还原反应显著增强，且在1.25gmL-1时诱导分化作用达峰值；DADS小鼠肾囊膜下移植的HL-60细胞具有显著的生长抑制作用，并呈剂量依赖关系，21 mg/kg 时抑瘤率达49.5%；2142mg/kgDADS可诱导HL-60细胞向中性粒系方向分化。,DADS对HL-60细胞作用的研究,DADS对HL-60细胞呈浓度依赖性的生长抑制效应,1.25 gmL-1DADS 处理HL-60细胞不同时期NBT还原 反应的变化,未处理的HL-60细胞 处理的HL-60 细胞,DADS对小鼠肾囊膜下HL-60细胞的诱导分化作用,4.影响细胞周期蛋白活性 研究者们认为，细胞周期的失调控是癌症发生发展的原因，而细胞周期素cyclins、细胞周期素依赖性激酶CDKs及调节CDKs的激酶和磷酸酶则是细胞周期调控的分子基础。在真核生物细胞进行有丝分裂时，其细胞周期可分为间期（G1期、S期、G2期）和M期，G1期细胞可进入持续时间不等的G0期。,我们上述研究结果显示，pRb、p21表达的增强和c-Myc、Ras及突变型p53表达减弱均可导致细胞停滞于G1期。本实验采用流式细胞仪检测了MGC803细胞在DADS作用后细胞周期的分布，结果表明细胞停滞于G2期而非G1期。DADS可诱导HL-60细胞表面分化抗原CD11b表达升高，CD33表达下降及细胞周期阻滞在G0/G1期。,DADS对人胃癌MGC803细胞周期的影响,0gmL-1 DADS 0.625gmL-1 DADS 1.25gmL-1 DADS,2.5gmL-1 DADS 5gmL-1 DADS ATRA,DADS对白血病HL-60细胞周期的影响,DADS对HL-60细胞周期的DNA含量的 影响,CD11b CD33,DADS对HL-60细胞表面分化抗原的影响,流式细胞术检测结果显示经SB和100mg/kg、200 mg/kg DADS作用后，MGC803细胞移植瘤细胞G2/M期百分率分别比NS对照组增加1.92、2.22和3.37倍 (P0.05)，表明DADS呈浓度依赖性对移植瘤细胞有G2/M期阻滞 。,不同浓度DADS处理后移植瘤细胞周期的变化,NS组 SB组 DADS 50mgkg-1组,DADS 100mgkg-1组 DADS 200mgkg-1组,研究表明，cyclin有7种，它们的表达随细胞周期时相的转换而发生改变，不同cyclin须与相应的CDK结合才能促使细胞周期的完成。细胞增殖分裂过程中，cyclins有如下变化：细胞由G0期进入G1期时，cyclinD1-3合成均增加；G1/S期时，cyclinDs及cyclinE降解，cyclinA合成增加；S期进入G2期时，cyclinB合成逐渐增加积累；G2/M期转换时，cyclinA、B降解，cyclinDs、E合成增加。cyclinD1在细胞增殖过程中意义最大，是G1期细胞增殖信号的关键蛋白。许多作者将它视为一种癌基因，其过度表达可导致细胞增殖失控，最终形成肿瘤。,CDKs由CDK1-7 组成，其在细胞周期的特定时间与相应的cyclin结合后，并经磷酸化或去磷酸化后方具有生物活性，促使与细胞周期有关蛋白的基因表达，从而对DNA合成及有丝分裂进行调控。 G1/S期有不同的cyclin/CDK复合体，cyclinD/ CDK4和cyclinE/CDK2激酶活性是细胞周期G1/S期转换所必须的，与cyclinA、E结合的CDK2激酶活性在G1/S期转换时升高，而在M期则降低。,CyclinB/cdc2复合体的活性是细胞进入M期所必的，而G1/S期转换，关系到细胞周期的启动，G2/M期转换则是细胞进行有丝分裂增殖的前提。 CDIs是CDKs的负调控因子，可使CDKs失活；cyclins是CDKs的正调控因子，使CDKs活化，二者对CDK活性的影响控制细胞周期各时相的转换。CDIs可分为两类，一类是P16家族，包括P16、P18、P15、P19，特异地抑制CDK4和CDK6；另一类是P21家族，它包括P21、P27、P57，对CDK具有广谱的抑制作用。,Lee 用flavopiridol处理NSCLC细胞株NCI-H358时，发现flavopiridol可使该细胞生长停止和诱导分化，且分化的启动与cdk2失活相一致，western blot分析处理后细胞的有cyclinE和D1的缺失，表明CDKs调控亚单位缺失是CDK2激酶失活的一个原因，同样CDK1、2、5的抑制剂roscovitine也可以诱导NCI-H358细胞分化，因此诱导分化剂可能通过阻抑CDK2的活性诱导细胞分化。,我们应用Western blot分析发现，在G2/M期阻滞同时有Cdc25C蛋白表达下降，但CDK1蛋白表达不受 DADS 作用的影响。表明 DADS对MGC803细胞的抑制增殖作用与G2/M期阻滞有关，其分子机理可能与降低Cdc25C蛋白水平有关。p38通路调节Cdc25C磷酸酶的表达在DADS诱导MGC803细胞G2/M期阻滞中起着重要作用。,DADS对人胃癌MGC803和BGC823细胞G2/M期检查点 激酶通路的影响,RT-PCR检测Chk1和Chk2在mRNA水平的改变 Western blot检测各蛋白的改变 免疫共沉淀检测Chk1、Chk2与Cdc25C结合,M 1 2 3 4 5 6,600bp 300bp,Chk1 -actin,RT-PCR 检测MGC803、BGC823细胞 Chk1mRNA表达水平 M：Marker；1：MGC803细胞对照组； 2-3：DADS 处理MGC803细胞1d、2d； 4: BGC823细胞对照组；5-6：DADS 处理BGC823细胞1d、2d,M 1 2 3 4 5 6,600bp 300bp,Chk2 -actin,RT-PCR 检测MGC803、BGC823细胞 Chk2mRNA表达水平 M：Marker；1：MGC803细胞对照组；23：DADS 处理MGC803细胞1d、2d； 4: BGC823细胞；56： DADS处理BGC823细胞1d、2d,DADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk1和P-Chk1表达,0 1 2 4 8 12 (hr),P-Chk1(Ser345),Chk1,-actin,DADS对MGC803细胞磷酸化Chk1表达的影响,P-Chk1(Ser345),Chk1,-actin,DADS对BGC823细胞磷酸化Chk1表达的影响,0 1 2 4 8 12 (hr),DADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk2和P-Chk2表达,0 1 2 4 8 12 (hr),P-Chk2,Chk2,-actin,DADS对MGC803细胞磷酸化Chk2表达的影响,0 1 2 4 8 12 (hr),P-Chk2,Chk2,-actin,DADS对BGC823细胞磷酸化Chk2表达的影响,DADS诱导MGC803和BGC823细胞ATR和P-ATR的表达,0 15 30 60 90 120 (min),P-ATR（Ser428）,ATR,-actin,DADS对MGC803细胞磷酸化ATR表达的影响,0 15 30 60 90 120 (min),P-ATR（Ser428）,ATR,-actin,图27 DADS对BGC823细胞磷酸化ATR表达的影响,DADS诱导BGC823细胞Chk下游分子CDC25C、Cyclin B1的表达,0 12 24 36 48 (hr),CDC25C,-actin,