短乳杆菌生产γ-氨基丁酸培养基的优化.pdf

现代食品科技 Mo d e r n F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 2 0 1 0 ，Vo 1 2 6， No 1 短乳杆菌生产 Y一 氨基丁酸培养基的优化 冯宇，高年发，张颖，潘超强，宋磊 ( 工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 3 0 0 4 5 7 ) 摘要：丫 - 氨基丁酸 ( G AB A)也称氨酪酸，是一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。本实 验采用单因素、正交设计和 S AS响应面分析的方法对以MR S为基础的GA B A发酵培养基进行了优化，确定了葡萄糖为最适碳源， 黄豆粉和玉米浆为混合氮源，并确定了葡萄糖、黄豆粉和玉米浆的最佳发酵培养基添加量，使 G A B A产量达到了2 7 1 2 g L ，比原始 培养基的 l 4 0 3 g 门 L 提高了9 3 3 0 。 关键词： 氨基丁酸；短乳杆菌；培养基优化；响应面分析 文章编号：1 6 7 3 9 0 7 8 ( 2 0 1 o 1 1 3 4 _ 4 Opt i mi z a t i o n o f Fe r me nt a t i o n M e d i u m f o r mi no bu t y r i c Ac i d Pr o du c t i o n I NG Yu， GAO Ni a n - f a ， ZE I ANG Yi ng ， PAN Ch a o - qi a ng ， SONG Le i ( K e y L a b o r a t o r y o f I n d u s l r i a l Mi c r o b i o l o g yo f Mi n i s t r yo f E d u c a fi o n ， C o l l e g e o f B i o t e c h n o l o g yo f T i a n j i n U n i v e r s i t yo f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ，T i a n j i n 3 0 0 4 5 7 ， C h i n a ) A b s t r a c t ：G a mm a - a mi n o b u t y r i c a c i d( G A B A ) h a s m a n y p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s a n d i s a ma j o r i n h i b i t o r y n 鼠 o 缸 a 】 瞰 硼 牡 e r i n ma mma l i a n n T V O U S s y s t e ms F e r me n t a ti o nme d inl nf o r GABA p r o d u c t i o n , b a s e do nMRSme d i u m, wa s o p t imi z e du s i n g s i n g l e f a c t o r t e s t , o r t h o g o n a l d e s i g na n d Re s p o t S u r f a c e a n a l y s i s me t h o d l e b e s t c a r b o n s o u r c e a n d n i t r o g e n S O U r C e we r e d e t e r mi n e d a s g l u c o s e a n dt h e mi x t u r eo f s o y b e a na n dc o r n s t e e pl i q u o r , r e s p e c t i v e l y Un d e r t h e o p t i mu m c o n d i ti o n s ， the c o n t e n t o f GABA ino p t imumf e r me n t a ti o nme d i um r e a c h e d 2 7 1 2 g L， wh i c h wa s 9 3 3 0 h i g h e r t h a n t h a t o f o ri g i n a l f e r m e n t a t i o n me d ium ( 1 4 0 3 g L ) Ke ywo r d s ： Ga mma - a mi n o b u t y r i ca c i d ； L a c t o b a c i l l u s b r e v is ；M e d i u m o p ti mi z a t i o n ； Re s p o n s eS u r f a c e a n a l y s i s Y 一 氨基丁酸 ( G AB A)也称氨酪酸，是一种非蛋 白质组成成份的天然氨基酸，广泛存在于 自然界中， 是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质， 它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、 改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等 功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注 。 G A B A的生产方法主要有化学合成、植物富集和 生物合成三种。生物合成一般以大肠杆菌为菌株，但 其存在安全卫生方面的隐患【 5 】 。乳酸菌中同样拥有谷 氨酸脱羧酶，可以催化底物谷氨酸钠 ( MS G)来合成 G A B A，而且被普遍应用于食品医药行业当中，比较 安全6 。 本实验采用单因素、 正交设计和 S AS响应面分析 的方法，对 以MR S为基础的 G A B A发酵培养基进行 收稿 13 期：2 0 0 9 - 0 8 - 2 5 作者简介：冯宇 ( 1 9 8 4 - )，男，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药 学 通讯作者：高年发教授 了优化，确定了廉价发酵培养基的组成，使 G A B A产 量达到 2 7 1 2 g L 。 1 材料与方法 1 1 材料及仪器 1 1 1 菌种 本实验室保藏菌种 L a c t o b a c i l l u s b r e v i s T C C C 1 3 0 0 7 ，分离 白酸菜。 I 1 2 液体 MR S培养基( L 1 蛋白胨 l 0 g ，牛肉提取物 1 0g ，酵母提取物 5 g ， 葡萄糖 1 0g ， 乙酸钠 2g ， 磷酸氢二钾 2g ， 柠檬酸钠 2g ， Mn S O 4 H 2 0 0 5 g ，Mg S O 4 7 H2 0 0 6 g ，MS G 5 0 g ，添加 蒸馏水至 1 0 0 0 mL，p H 自然，高压灭菌备用。 1 1 - 3 仪器 安捷伦1 2 0 0 高效液相色谱仪和K r o ma s i l C 1 8 高效 液相色谱柱。药品试剂均为分析纯，乙腈为色谱纯。 1 2 方法 1 2 1 发酵方法 现代食 品科技 Mo d e r n F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 2 0 1 0 ， V o 1 2 6 ， N o 1 将高层琼脂中的菌体接入 5 0 mL MRS培养基中， 3 0活化培养 1 6 h ， 以 5 接种量接入发酵培养基中， 3 0静置发酵 7 2 h 。 1 2 2 G AB A 检测高效液相色谱法 发酵液5 0 0 0 r rai n 离心后，取上清液l 0 ，加入 衍生缓冲液1 0 0 、衍生剂( 2 ， 4 二硝基氟苯) 1 0 0 ， 定容缓冲液7 9 0此 于1 5 m L 离心管中，混匀，6 O水 浴1 h ， 2 0 u L 进样。 用K r o ma s i l C1 8 柱， 流速0 8 mL mi n ， 3 6 0 n m检测。流动相为乙腈、乙酸钠溶液和水，梯度 洗脱 。 1 2 - 3 培养基优化方法 采用单因素、正交设计和响应面分析法。 2 结果与讨论 2 1 碳源对发酵生产G AB A的影响 G A B A生物合成的底物为MS G，所以在发酵过程 中加入5 0 g m的MS G。分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、 麦芽糖等为唯一碳源，添加量为1 0 g m，其他发酵培 养基成分以液体MR S 培养基为基础，进行发酵。3 0 静置培养3 d ，检测发酵液中G A B A的含量，结果见表 l 。 结果显示 ， 葡萄糖作为此株短乳杆菌发酵培养基的 碳源最为适合，葡萄糖作为可快速利用的碳源为短乳 杆菌的生长和G AB A生产提供能量来源，故以其作碳 源，无论是菌体量还是G A B A产量都优于其他碳源 。 表 1碳源对发酵培养液 中G A B A含量和菌体量的影响 T a b l e1 Eff e c t so f c a r b o n s o u r c eo nc o n t e n t o f GABAi l l f e r me n t a tio nbr o t ha ndbi o mas s 2 2 氮源对发酵生产 GA B A的影响 分别用黄豆粉 、玉米浆和麸皮等氮源代替蛋 白 胨、牛肉提取物和酵母提取物，对氮源进行优化。优 化时葡萄糖添加 1 0 g m，MS G添加 5 0 g m。 首先比较单一氮源对 G A B A产量的影响， 然后比 较混合氮源的发酵效果。玉米浆的蛋 白含量为 4 5 、 黄豆粉为 8 、麸皮为 1 2 0 8 ，按 2 5 g L的添加量进 行折算，在进行单一氮源发酵时其添加量分别为：玉 米浆 5 5 g m、黄豆粉 3 1 g L 、麸皮 2 0 5 g m。在进行均 匀混合发酵时， 同样以氮源添加量为2 5 g L进行折算。 单一氮源的实验结果见表 2 ，混合氮源的实验结果见 表 3 。 从表 2可知，在单一氮源的实验中，玉米浆的效 果最好。从表 3 可知，以黄豆粉和玉米浆为复合氮源 对于 G A B A产量的提高有很大帮助。 原因可能是营养 成分的充足供给有利于短乳杆菌的生长和提高菌体活 力。分析玉米浆和黄豆粉 的成分可以发现，玉米浆主 要为微生物成长提供必要的维生素 ( 烟酸、叶酸、泛 酸、 硫胺素等) ， 而黄豆粉可为培养基提供较高的氨基 酸和金属离子。 表2氮源对发酵培养液中G A B A含量的影响 I b k 2 Effe e o f n i t r o g e n s o u r c e o n c o n t e n t o f GABA i n r me n ta fi o n b r o t h 表 3复合氮源对发酵过程中G A B A 含量的影响 T a b l e3Effe c o f c o mp xnit r o g e no n c o n n t o f GABA in r m e n t a fi o nb rot h 氮源麸皮+ 玉米浆黄豆粉+ 玉米浆 麸皮+ 黄豆粉 G A B A( g L ) 1 3 5 5 1 5 4 0 1 1 3 0 2 3 正交试验设计优化发酵培养基 以葡萄糖为碳源，黄豆粉和玉米浆为混合氮源， 在MS G添加量为5 0 g L ，其他营养成分以液体M 培 养基为基础进行正交设计L 2 7 ( 3 ) 。因素水平表和实验 结果分别为表4 和表5 。 表5 的极差分析显示，葡萄糖添加量对于G A B A 的产量影响最大，主要成分对GA BA产量的影响顺序 为：葡萄糖 黄豆粉 玉米浆。而磷酸氢二钾、柠檬 酸钠、乙酸钠、硫酸镁的添加与否都不会对实验结果 造成很大影响。其原因可能是黄豆粉和玉米浆足 以提 供菌体生长和发酵所需的无机盐，因此不用再额外添 加。因此，正交试验给出的基本发酵培养基组成是： 葡萄糖1 3 g L 、黄豆粉3 3 g L 、玉米浆3 0 g L 、硫酸锰 0 2 5 ，MS G添加5 0 g L 。 由于最佳的培养基组成在试验中没有进行，所以 根据正交试验给出的最佳培养基成分进行发酵，产量 为2 4 8 6 g m，高于2 3 号试验。比初始培养基产量提高 了7 7 1 9 。 表 4 因素与水平表单位 ：g m T a b l e 4Fa c t o r s a n dl e v e l s o f t h eo r t h o g o n fl t e s t u n i t ： 3 5 现代食品科技 Mo d e r n F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 2 0 1 0 ， V o 1 2 6 ， N o 1 表5正交实验结果及极差分析结果 T a b l e s A n a b s o f t h e o r t h o g 0 n a l e x p e r i me n t a l r e s u l t s 2 4 响应面法确定最佳值域 由表5 的正交试验结果可知， 影响G A B A 产 量的最 显著因素为葡萄糖、黄豆粉和玉米浆。因此，本实验 以G A B A 产量为响应值，葡萄糖、黄豆粉和玉米浆为 自变量 ( 分别以A、B 、C 表示)，对葡萄糖、黄豆粉 和玉米浆进行响应面分析，寻求最佳结果。响应面的 因素水平见表6 ，实验结果见表7 。 3 6 表6试验因素水平及编码 T a b l e6L e v e l s a n de c o d o f f a c t o n 因素 水 j f A【 葡萄糖 ( g 几) B 【 黄豆粉 ( 】 c 【 玉米浆， ( g L ) 】 表7 B o x B e h n k e n 试验设计及响应值 Ta b l e7De s i g n san ds D o n s e s o f Bo x - B e h n k e n 2 5 回归模型的建立和方差分析 对表 7的结果进行方差和回归分析，结果见表 8 和表 9 。 表8方差分析表 Ta bl e8 o f t her e s u l 由表 8可知， 回归模型 F 检验显著( P I 0 0 1 ) ， 其 R 2 为 0 9 7 7 0 ，表明此模型拟合度 良好。回归方程的 一 次项、二次项的均方差和系数都较大，而交互项较 小，说明这三个因素交互作用较小。 现代食品科技 Mo d e r n F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 2 0 1 0 ， V o 1 2 6 ， N o 1 表9回归方程中回归系数的估计值 T a b l e 9 E s ti ma t e v a l u e s o f r e g r e s s i o n c o e ffi c i e n t i n t h e r e g r e s s i o n e q ua d o n 从表 9的数据可得拟合二次多项回归方程为： Y = 2 6 6 3 33 3 +1 0 4A+0 1 7 5 B+0 2 8 5 C一 0 6 91 6 6 7 A2 - 0 0 3 AB+ 8 8 8 1 0 AC 一 1 0 1 1 6 6 7 B +0 1 2 B C 一 0 8 4 1 6 6 7 C。 求解该方程组可知，当葡萄糖为 2 1 8 g m、黄豆 粉为 3 6 3 g m、 玉米浆为 2 5 9 g m 时， 实验预测的最大 产量为 2 7 0 6 g m。 为了验证预测的准确性，在最佳发酵条件下进行 了发酵试验，所得产量为 2 7 1 2 g L ，说明该模型能够 很好地预测实际发酵情况。 2 6 底物MS G 添加量对发酵生产GA B A的影响 IGAB A MS C 转 化率 3 0r 1 9 O 一 2 5 2 0 1 5 爱 1 0 0 5 0 M S G ， 7 8 o 0 量 萎 薯 2 l o 0 望 O 图1 M S G 添加量对发酵液 中G A B A 含量的影响 Fi g 1 Effe c t o fM S G on c on t e nt o fGABA i n f e r me nt at i o n br o t h 生物合成G A B A的过程是谷氨酸脱羧酶催化谷氨 酸脱羧的过程，因此本实验在优化了发酵培养基碳氮 源 的基础上以：3 0 g 门 L 、 4 0 、 5 0 g L 、 6 0e e L 、 7 0g L 的比例将MS G J ： n 入到培养基 中，考察发酵液中G AB A 含量的变化。结果见图1 。 图1 表明， MS G添加量为5 0 g L 的时候G A B A产量 最高，达到2 7 1 2 g L 。而MS G的转化率是随着添加量 的增大而减小，可能与谷氨酸脱羧酶的活性或者细胞 膜通透性有关，有待进一步考察。本实验发酵培养基 中MS G的添加量定为5 0 g m。 3 结论 本实验对筛选到的一株产G A BA的短乳杆菌进行 了单因素、正交设计和B o x B e h n k e n 响应面法的培养 基优化。实验确定了葡萄糖、黄豆粉和玉米浆的最佳 取值，优化后的培养基组成为 ( g L)：葡萄糖2 1 8 0 、 黄豆粉3 6 3 0 、玉米浆2 5 9 0 、硫酸锰0 2 5 、MS G 5 0 。 G A B A产量为2 7 1 2 ，比液体MRS 培养基 的产量 1 4 0 3 g L 提高T9 3 3 0 。 参考文献 1 1 张晖， 姚惠源， 姜元荣 富含丫 一 氨基丁酸保健食品的研究与开 发 J 】 食 品与发酵业， 2 0 0 2 ， 2 8 ( 9 ) ： 6 9 - 7 2 2 】 徐冬云， 周立平， 童振宇 等， 产丫 - 氨基丁酸乳酸菌的分离筛 选 【 J 】 现代食品科技， 2 0 0 6 ， 2 2 ( 3 ) ： 5 9 6 2 3 】 Ha y a k a w a K i n l u r a M E f f e c t o f a y - a mi n o b u ty r i c a c i d - e n r i c h e d d a i r y p r o d u c t i o n t h e b l o o d p r e s s u r e o f s po nt a ne o us l y hy pe r t e n s i ve a n d No r mo t e