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瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌纯种发酵绿豆乳培养基的研究 贺志华 1 谷新晰 1 田晶晶 2 杨杰 1 田洪涛 1* 罗云波 3 （1河北农业大学食品科技学院河北保定071001 2河北农业大学生命科学学院 河北保定071001 3中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083） 摘要以益生乳制品中选育的生长繁殖力强、发酵活力高的瑞士乳杆菌05-29和干酪乳杆菌05-211为试验菌 株，采用层层筛选的方法优化发酵绿豆乳培养基，研究牛奶、大豆、蔗糖的添加量对瑞士乳杆菌05-29和干酪乳 杆菌05-211纯种发酵绿豆乳活菌数和pH的影响；绿豆乳发酵培养基制备过程中均质压力、灭菌温度、护色剂 添加量及色素添加量对发酵培养基色泽的影响。 研究结果表明：添加牛奶23.75，大豆乳5，蔗糖4纯种发 酵6 h后，瑞士乳杆菌05-29达到4.5108cfu/mL，pH 4.55；干酪乳杆菌07-211达到6.3108cfu/mL，pH 4.69。 采用20 MPa均质，95 10 min灭菌，添加护色剂3，果绿0.010 g/kg，绿豆乳产品具有良好的外观颜色。 关键词发酵绿豆乳； 益生菌； 瑞士乳杆菌； 干酪乳杆菌； 护色与调色 文章编号1009-7848（2013）06-0117-06 益生菌是一类能够促进宿主肠道微生态菌群 平衡， 对宿主健康产生有益作用的活性微生物1。 因其特有的保健功能2，故在食品上的应用得到迅 猛发展。 目前国际上对于益生菌的研究已从第一 代双歧杆菌和嗜酸乳杆菌发展到第二代干酪乳杆 菌、瑞士乳杆菌3。益生菌对营养要求苛刻，使其广 泛应用受到限制。 近年来我国乳品行业发展迅速， 激烈的竞争 使得奶源供应紧张。 我国是农业大国，农产品资源 丰富。 绿豆是一种兼具营养和药用价值的经济作 物。 绿豆乳富含蛋白质、多糖类，不含胆固醇和乳 糖，其中纤维素和酮类物质具有极高的保健功效， 因此绿豆乳是一种优良的乳品加工原料。 绿豆乳 在加工过程中易氧化褐变， 同时较高的淀粉含量 对产品稳定性产生影响。 本试验中去除绿豆乳中的淀粉， 通过添加牛 乳、大豆、蔗糖增强其适口性。 以活菌数和发酵pH 值为检测指标， 调配具有良好口感并适于益生菌 生长的绿豆乳发酵培养基。 通过研究豆乳制备过 程中颜色的影响因素，获得最佳的产品外观，为开 发集营养保健和益生菌益生功效于一体的发酵绿 豆乳产品奠定基础。 1材料与设备 1.1菌种 瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）05-29、 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）07-211，由河北 农业大学食品科技学院发酵工程实验室提供。 1.2主要原料和试剂 主要原料：绿豆、鲜牛奶、蔗糖均为市售，用于 发酵培养基的制备。 主要试剂：复配护色剂（食品科技学院田益玲 教授惠赠）、果绿、高温-淀粉酶、酵母膏、葡萄 糖、牛肉膏、蛋白胨、醋酸钠等均为分析纯或生化 试剂。 1.3培养基 MRS培养基：参照文献3配制MRS液体或 者固体培养基， 调节pH6.46.8，115 灭菌20 min，室温冷却备用。 液体培养基用于菌种活化，固 体培养基用于菌种活菌数检测。 脱脂乳培养基： 脱脂奶粉与蒸馏水质量体积 比为17，112 灭菌10 min，室温冷却备用，用于 检测菌种活力。 绿豆乳培养基： 绿豆与水的质量体积比为1 9，磨成豆乳，加热糊化，添加0.01淀粉酶处理30 min，95 灭菌10 min， 用于菌种活化和发酵剂制 收稿日期：2012-06-29 基金项目： 山东省科技发展计划项目（2010GG10048） 作者简介： 贺志华，男，1987年出生，硕士生 通讯作者： 田洪涛 Vol 13 No 6 Jun 2 0 1 3Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology 中 国 食 品 学 报 第13卷第6期 2 0 1 3年6月 中 国 食 品 学 报 2013年第6期 备。 1.4主要仪器与设备 酸度计（PHS-3CW），上海班特仪器有限公司； FLC-3超净台， 哈尔滨市东联公司； 高压灭菌锅 （YW-24LD），江阴滨江医疗设备有限公司；生化 培养箱（SPX-150B-Z），上海博迅实业有限公司； 磨浆机 （FOM-Z150-2）， 镇江市丹徒区纪中电器 厂；实验型高压均质机（SIS60-70），上海申鹿均质 机有限公司。 2实验方法 2.1菌种的活化 将瑞士乳杆菌05-29、干酪乳杆菌07-211按 1（体积分数）分别接种于试管MRS液体培养基 中，37 培养，活化13次，使培养1218 h活菌 数在1109cfu/mL以上。将1MRS菌液接种于试 管无菌脱脂乳（脱脂奶粉与水的质量体积比17） 培养基中，37 培养，活化23次，使凝乳时间3 5 h。 分别将两株菌的试管脱脂乳菌液接种于试管 绿豆乳培养基中，37 培养，活化23次，凝乳时 间45 h为宜，制成试管活化菌种。 2.2工艺流程与技术路线 选豆（挑除杂质，霉烂豆）烘豆（120 ，10 min）蒸馏水浸泡（45 ，5 h）打浆（豆水比1 9）胶体磨磨浆糊化淀粉酶酶解（70 ，30 min）煮沸（100 ，10 min，终止酶解）调配 （0.1 HCL调节pH 7.0， 考察绿豆乳中牛乳、大 豆乳和蔗糖添加量对两株菌纯种发酵及感官风味 的影响）均质（采用不同的均质压力考察均质对 颜色的影响）杀菌（采用不同的灭菌温度和时 间，考察灭菌温度对颜色的影响）冷却绿豆乳 发酵培养基。 2.3生长曲线的测定 将活化的瑞士乳杆菌05-29和干酪乳杆菌 07-211按2接种量接种到纯绿豆乳培养基中， 37 培养，每隔2 h取样进行梯度稀释，选择合适 梯度进行活菌计数，测定16 h生长曲线。 每个样 品做3个平行。 2.4各指标的测定方法 2.4.1活菌计数平皿菌落计数法，37 有氧培 养3648 h，每个试验重复3次。 2.4.2pH值测定用PHS-3CW酸度计测定，每 个试验重复3次。 2.4.3滴定酸度测定用0.1 mol/L NaOH标准 溶液滴定，每个试验重复3次 3结果与分析 3.1纯豆乳中两株益生菌生长曲线及培养时间 将两株益生菌在MRS液体培养基中活化，分 别以2%（活菌数约107cfu/mL）接种量接种到无菌 脱脂乳（脱脂奶粉与蒸馏水质量体积比17）培养 基中，在最适温度下培养至凝乳时间稳定。 将试管 脱脂乳菌液以2%接种于绿豆乳（绿豆与蒸馏水质 量体积比19，磨成豆乳）培养基中，测定16 h生 长曲线，见图1，图2。 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 0246810121416 生长时间/h 图1干酪乳杆菌07-211纯豆乳中生长曲线 Fig.1The growth curve of Lactobacillus casei 07-211 LgCFU 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 LgCFU 0246810121416 图2瑞士乳杆菌05-29纯豆乳中生长曲线 Fig.2The growth curve of Lactobacillus helveticus 05-29 生长时间/h 118 第13卷 第6期 由图1、图2可知，干酪乳杆菌07-211在37 6 h达到对数末期，最大活菌数3.9108；瑞士乳 杆菌05-29在37 6 h达到对数末期，最大活菌 数1.6103。 后续试验中以6 h作为培养时间。 3.2绿豆乳发酵培养基的调配 3.2.1牛乳对两株益生菌生长与发酵性能的影响 采用2.1节方法活化菌种，将发酵剂菌液按2 （活菌数约106cfu/mL） 接种到不同牛乳添加量的 绿豆乳培养基中， 测定6 h的活菌数与pH值，结 果见表1。 分析表1可知，牛乳添加量不同时，两株菌的 pH值差异不显著（p0.05）。 干酪乳杆菌07-211 在添加不同量牛乳时活菌数差异不显著， 而与纯 豆乳差异显著（p0.05）。 虽然活菌数差异性不显著， 但添加大豆乳对两株菌有促生长作用， 这可能与 大豆中氨基酸种类丰富有关。 为了获得最大活菌 数，选择5的大豆乳添加量。 3.2.3蔗糖对两株益生菌生长与发酵性能及风味 的影响采用2.1节方法活化菌种， 将发酵剂菌 液接种到含23.75牛乳和5豆乳的不同蔗糖添 加量的豆乳培养基中， 测定6 h时活菌数与pH 值，结果见表3。 分析表3可知， 不同蔗糖添加量对两株菌的 活菌数与pH值的影响均不显著（p0.05），说明添 加蔗糖对2株菌既无促进也无抑制生长作用。 瑞 士乳杆菌不利用蔗糖，干酪乳杆菌可利用蔗糖，但 活菌数无差异，说明培养基中碳源充分，加入蔗糖 不促进生长。 蔗糖主要的作用是用来调节酸甜风 味。 两株菌发酵时加入不同量的蔗糖，发酵6 h，4 放置24 h，对其培养基进行感官评价，结果见 表4。 瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌纯种发酵绿豆乳培养基的研究119 中 国 食 品 学 报 2013年第6期 06.01084.704.31084.50 活菌数pH活菌数pH 蔗糖添加量 干酪乳杆菌07-211瑞士乳杆菌05-29 86.21084.684.51084.57 46.31084.694.41084.54 65.91084.624.61084.55 表3添加不同量蔗糖6 h时发酵活菌数与pH值（cfu/mL） Table 3Viable count and pH of 6 h fermented mungbean milk with different count of suger（cfu/mL） 蔗糖添加量/干酪乳杆菌07-211瑞士乳杆菌05-29 0豆香和奶香，均一凝乳，酸味较重豆香和奶香，均一凝乳，酸味较重 4豆香和奶香，均一凝乳，酸甜适中豆香和奶香，均一凝乳，酸甜适中 6豆香和奶香，均一凝乳，甜味明显豆香和奶香，均一凝乳，甜味明显 8豆香和奶香，均一凝乳，甜味明显豆香和奶香，均一凝乳，甜味明显 表4添加不同量蔗糖6 h时发酵感官评价 Table 4Sensory evaluation of 6 h fermented mungbean milk with different count of suger 由表4可知，干酪乳杆菌07-211与瑞士乳杆 菌5-29发酵绿豆乳有良好的豆香和奶香。干酪乳 杆菌07-211与瑞士乳杆菌05-29添加4蔗糖的 酸甜度适合，最终确定蔗糖添加量为4%。 3.3绿豆乳发酵培养基制备工艺对色泽的影响 及护色与调色 3.3.1均质压力对色泽的影响按2.2节方法制 作培养基， 采用不同的均质压力， 观察最终的颜 色，见表5。 由表6可知， 均质压力15 MPa和20 MPa对 绿豆乳颜色的影响差异不明显，为灰绿色；25 MPa 的均质豆乳颜色为较深的灰绿色。 均质压力高，使 绿豆乳颜色加深。 在保证均质效果的条件下，选用 均质压力20 MPa，可保持绿豆乳的色泽。 3.3.2灭菌温度的优化按2.2节方法制作培养 基，采用3种灭菌方法灭菌，观察最终的颜色，见 表6。 由表6可知，灭菌温度62 和100 对豆乳 色泽的影响无明显的差别。 采用121 灭菌，豆乳 颜色较前两者深。 灭菌温度过高会加深豆乳的褐 变， 失去绿豆的本色。 最终选择62 30 min和 95 10 min灭菌。 在相同的灭菌效果下，热处理 时间越短营养物质的损失越少，因此，定为95 10 min灭菌。 3.3.3护色剂添加量对绿豆乳色泽的影响采用 2.2节方法制作绿豆乳培养基， 分别加入0， 1，2，3，4，5护色剂，抗氧化及金属螯合 的复合护色剂，观察最终的颜色，见表7。 均质压力15MPa20MPa25MPa 颜色灰绿灰绿深灰绿 表5均质压力对色泽的影响 Table 5Effect of Homogeneous pressure to colour of mungbean milk 温度62 30min95 10min121 15min 颜色浅灰绿浅灰绿灰绿 表6灭菌温度对色泽的影响 Table 6Effect of sterilization temperature to colour of mungbean milk 护色剂添加量0123 颜色灰绿色灰绿色灰绿色浅灰绿色 表7护色剂添加量对绿豆乳色泽的影响 Table 7Effect of colour fixative to colour of mungbean milk 120 第13卷 第6期 添加1和2的护色剂，绿豆乳色泽差异不 明显，均为灰绿色；添加35护色剂，绿豆乳 色泽差异不明显，均为浅灰绿色。 添加护色剂会增 加绿豆乳培养基成本， 最终采用护色剂添加量 3。 通过护色剂的添加，减轻了高温杀菌造成的 褐变影响，但依然无法达到天然绿豆的颜色。 色泽 是食品重要的感官指标之一， 因此考虑添加食用 色素改善绿豆乳培养基感官性质。 3.3.4色素添加量的优化按2.2节方法制作培 养基，分别加入不同比例的果绿色素，观察颜色， 见表8。 果绿添加量0.0100.0150.0200.025 颜色浅绿色，较符合绿豆的本色浅绿色，比绿豆色深鲜绿色鲜绿色 表8果绿的添加量对绿豆乳颜色的影响（g/kg） Table 8Effect of fruit green to colour of mungbean milk（g/kg） 由表8可知，添加0.010g/kg果绿的绿豆乳颜 色最符合绿豆的本色豆绿。 上述结果表明， 绿豆乳在加工过程中需严格 控制工艺条件，使用少量的色素调色，以保持绿豆 的本色。 4讨论 实验菌株为本实验室工作人员从保健品、乳 制品中分离选育。 经生理生化测定、毒理实验，其 不含质粒，不产毒素，发酵活力高，是安全可靠的 益生菌菌株。 刘爱萍5等研究了嗜热链球菌和植物乳杆菌 混菌发酵绿豆乳。 袁仲6对嗜热链球菌和保加利亚 乳杆菌混菌发酵绿豆乳进行研究。 保加利亚乳杆 菌与嗜热链球菌是发酵酸奶常用菌种， 无法在人 体中定植并发挥益生功效。 采用第2代益生菌（包 括干酪乳杆菌、 鼠李糖乳杆菌和瑞士乳杆菌等）， 可与人共生， 在人体消化道上皮形成1道生物屏 障而发挥保健功效。 第2代益生菌无论是生长特 性、发酵特性及对不良环境耐受性，均优于第1代 益生菌（双歧杆菌、嗜酸乳杆菌）。Klaver等人研制 的双歧杆菌大豆酸乳的总活菌数在106107cfu/ mL6。 利用本研究调配培养基发酵，益生菌活菌数 均达到108cfu/mL。 本试验调配的发酵培养基， 以绿豆乳为主要 原料，添加大豆、牛乳作为促生长因子，物美价廉， 具有增菌效果。 大豆所含大豆多肽能促进微生物 生长发育和代谢，被广泛应用于发酵工业。 牛乳中 含有促生长因子烟酸、泛酸等，可以完全满足益生 菌生长过程中对营养的需求。 朱玉昌等人8采用短 乳杆菌和嗜酸乳杆菌混菌发酵豆乳，凝乳发酵24 h。 本试验用干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌纯种发酵绿 豆乳凝乳仅需6 h，发酵时间短，可缩短发酵周期， 提高设备利用率。 褐变是绿豆乳加工的一大难题。 邢黎明等9研 究了绿豆乳的生产工艺， 最终得到的绿豆乳呈乳 白色。 色、香、味是评价产品质量优劣的基本标准。 为保留豆皮中的营养成分和产品外观质量， 本文 采用保留豆皮的加工工艺， 通过护色和调色方法 使绿豆乳保留了令人愉悦的豆绿色。 本研究通过层层筛选的方法确定绿豆乳培养 基的配方，研究绿豆乳的护色调色，使发酵产品具 有绿豆清香和奶香，活菌数在108cfu/mL以上。 为 开发质优价廉的益生菌发酵绿豆乳奠定了基础。 参考文献 1Golden BR. Health benefits of probioticJ. British Journal of Nutrition，1998，80：203-207. 2肖平， 吕嘉枥， 沈文.益生菌的保健功能及其在食品中的应用概述J.食品科技，2009，34（10）：23-26. 3凌代文， 东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法M.北京：中国轻工业出版社，1999：85-120 瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌纯种发酵绿豆乳培养基的研究121 中 国 食 品 学 报 2013年第6期 4王佳， 田洪涛， 韩璞， 等.干酪乳杆菌纯种大豆乳工艺研究J.中国粮油学报，2010，（5）：85-89. 5刘爱萍， 陈尚武， 苗颖， 等.绿豆酸奶发酵工艺的研究J.食品科学，2007，2：108-111. 6Klaver FAMF Kingma，AH Weerkamp Growth and survival of bifidobacteria in milkJ Netherland Milk and Dairy Journal，1993，47：151164 7李雅乾， 田洪涛， 苏旭东， 等.双歧杆菌发酵胡萝卜汁酸乳贮藏稳定性研究J.食品与机械，2006，22（4）：94-96. 8朱玉昌， 周大寨.多菌种混合乳酸菌发酵酸豆奶工艺研制J.食品工艺，2005，5：81-83. 9邢黎明， 刘丽君.绿豆乳饮料生产工艺的研究J.内蒙古农业大学学报，2005，4：58-60. Optimization of Mungbean Milk Medium for Lactobacillus Helveticus and Lactobacillus Casei He Zhihua1Gu Xinxi1Tian Jingjing2Yang Jie1Tian Hongtao1*Luo Yunbo3 （1Food Science and Technology College，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei 2College of Life Science， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei 3College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University，Beijing 100083） AbstractLactobacillus helveticus 05-29 and Lactobacillus casei 05-211 were isolated from probiotic dairy products as the experiment strain. The prescription of mungbean milk was examined by layers of screening including the effect of the amount of pour milk，soybean milk and suger to the viable count and pH；Besides the protectivecoloration and ton- ing are included in this research. The research results shows that the additive amount are pure milk 23.75；soybean milk 5；suger