野生赭鳞蘑菇的鉴定与栽培研究初探.pdf_第1页
野生赭鳞蘑菇的鉴定与栽培研究初探.pdf_第2页
野生赭鳞蘑菇的鉴定与栽培研究初探.pdf_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

试验研究 丽水农业科技 2 0 1 1年第 4期 野生赭鳞蘑菇的鉴定与栽培研究初探 宋小亚 刘德云 李 阳 顾新伟 吴春玲 1 一水市农业科学研究院食用菌研 究所3 2 3 0 0 0 2 丽水市农业局3 2 3 0 0 0 摘要: 对采集到的野生蘑菇进行了研究, 依据形态学特征、 R _A P D和 r D N A I T S 分析, 将其鉴定为赭鳞蘑 -( A g a r i c u s s u b r u f e s c e n s P e c k ) , 并对其命名原N4 5 - 7讨论; 出菇试验表明, 该菇可作为驯化育种材料, 具有潜 在的应用价值。 关键词 : 赭鳞蘑菇; 巴西蘑菇 ; 育种材料 P r e l i mi n a r y s t u d y o n i d e n t i fi c a t i o n a n d c u l t i v a t i o n o f wi l d Ag a r i c u s s u b r u f e s c e n s S ONG Xi a oYa LI U De Yu n L I Ya n g GU Xi nW e i W U Ch u nLi n g ( 1 L i s h u i Ac a d e my o f Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s L i s h u i Z h e j i a n g 3 2 3 0 0 0 2 L i s h u i Ag r i c u l t u r e Bu r e a u L i s h u i 3 2 3 0 0 0 ) Ab s t r a c t : A w i l d mu s h r o o m w a s c o l l e c t e d a n d s t u d i e d , B y mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e ris t i c s , RAP D a n d r DN A- I T S a n a l y s i s , i t w a s i d e n t i fi e d a s Ag a r i c u s u b r u f e s c e n s P e c k , n o me n c l a t u r e r e a s o n o f wh i c h w a s d i s c u s s e d ; me a n w h i l e , t h e r e s u l t o f f r u i t i n g t e s t s h o we d t h a t i t h a d p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n v a l u e a s b r e e d i n g ma t e ri a l s i n t h e f u t u r e Ke y wor d s : Ag a r i c u s u b r u f e s e e n s P e c k ; A b r a s i l i e n s i s ; b r e e d i n g ma t e ria l 蘑菇属( ( A g a r i c u s L e x F r ) 在分类学上隶属于担 子菌门( B a s i d i o m y c o t a ) , 伞菌 目( A g a r ic a le s ) , 蘑菇科 ( A g a r i c a c e a e ) 。 该属种类众多, 分布范围广, 大多数种 可食用、 药用, 其中不乏美味名贵之品种, 目前已被驯 化并广泛栽培的有双孢蘑菇( Ab i s p o r u s ) 、 大肥菇( A b i t o r q u i s ) 、 姬松茸( A b r a s i l i e n s i s ) 等。赭鳞蘑菇( A g 一 C U S s u b r u e s c e n s P e c k )最早由美国植物学家 C h a r l e s H o r t o n P e c k 于 1 8 9 3 年发现并命名1 , 到 1 9 世纪末 2 O 世纪初, 该菌在美国东部地区广泛栽培和食用, 其味 鲜美,富含 B 一 葡聚糖, 具有提高人体免疫机能的作 用; 在 日 本, 该菌提取物作为抗肿瘤的辅助药物和非 传统药物被广泛应用于癌症病人的疾病治疗21 。该菇 在我国的江苏、 福建、 山西、 四川、 云南、 吉林、 黑龙江、 1 0 西藏、 河南等省都有分布刚 , 但在浙江省还鲜见报道 , 国内对其分离、 鉴定和栽培等方面的研究也较少。作 者于 2 0 0 7年 9 月在浙江省丽水市一竹林内采集到一 种野生蘑菇, 依据形态学特征观察,辅助于 R A P D 、 r D N A I T S分析和出菇试验,确定其为赭鳞蘑菇( A s u b r u e s c e n s ) ,并对其栽培过程中子实体形态学特征 进行了详细描述。现将研究内容报道如下。 1 材料与方法 1 1 子实体采集及菌株分离 野生蘑菇于 2 0 0 7年 9月 2 7日采集于浙江省丽 水市莲都区碧湖镇一竹林内腐叶堆上。以C Y M为培 养基质 , 采用组织分离法获得其疑似纯培养物, 转接 至试管斜面于4 cC 条件下保存备用。 丽水农业科技 2 0 1 1年第 4期 1 2 分离菌株的真实性鉴定 1 2 1 子 实体与 菌丝体基 因组 DNA的提取 与浓度 测 定 选取野生菇子实体菌盖部分提取基因组 D N A; 分离菌株采用振荡培养法( C M培养基) 收集菌丝体。 采用 S D S ( 十二烷基硫酸钠 ) 裂解法分别提取子实体 和菌丝体 D N A, D N A浓度与纯度用 B i o p h o t o m e t e r 核 酸检测仪( E p p e n d o r f ) 测定。D N A浓度稀释至 5 0 n g tx L 备用。 1 2 2 RAP D P C R分析 以子实体 D N A作为模板,采用 R A P D技术进行 P C R扩增 ( P C R仪 : M a s t e r c y c l e r e p g r a d i e n t , E p p e n - d o r f 公司) , 在供试的 8 5个随机引物( 购自上海英骏 生物技术有限公司)中共筛选出 1 9个对供试材料 D N A能进行 有效扩增且稳定性较好 的随机引物用 于进一步分析。P C R反应体系 ( 2 0 p L )为: T a q D N A P o l y me r a s e 1 U, 1 x P C RB u f f e r , M g 2 + 2 5 mmo 1 L, d NT P 1 5 0 1x m o l L , P r i m e r 0 5 ,m o l L , 模板 D N A 5 0 n g 。P C R反 应条件为 : 9 4 o C 3 m i n , 9 4 l m i n , 3 7 m i n , 7 2 c c 2 m i n ( 4 0 C y c l e s ) , 7 2 5 m i n ( P C R试剂购自天根生化科技有 限公司 , 下 同) 。P C R产物用 1 5 琼脂糖凝胶 电泳检 测 , 电压 5 V c m, 电极缓冲液为 1 x T AE , 在含有 0 5 g , m L E B中染色 3 0 m i n , 凝胶成像系统( B I O B E S T , 美 国 S I M公司) 拍照记录。 1 3 野生蘑菇分类 1 3 1 形态学鉴定 连续三年进行出菇试验, 将野生蘑菇子实体与栽 培子实体形态进行 比较 , 并进行性状描述 , 查阅相关 资料进行种属鉴定。 1 3 2 r DNA I T S鉴 定 利用通用引物 I T S 1 和I T S 4( 购自 上海英骏生物 技术有限公司) 对野生蘑菇子实体 D N A进行 P C R扩 增 。 反应体系( 2 5 L ) : T a q D N A P o l y m e r a s e l U , 1 x P C R B u ff e r , M + 2 5 mmo l L, d NT P 2 0 0imo l h, I T S1 I T S 4 P ri me r 0 8t z mo l L, 模板 D N A 5 0 n g 。 扩增程序为 9 4 C 3 m i n ; 9 4 1 m i n , 6 1 o C 1 m i n , 7 2 1 m i n ( 3 5 C y c l e s ) ; 7 2 C 2 m i n ; 4 C 保存。P C R产 物经电泳、 染色、 拍照记录, 回收 P C R产物, 交由上海 英骏生物技术有限公司进行克隆、 测序。将测得序列 与 G e n B a n k核酸序列数据库进行 比对 , 通过 B L A S T n 搜索具有最大相似性 的种类。 2 结果与分析 2 1 分离菌株的真实性鉴定 试验研究 用筛选出的 1 9 个随机引物对野生蘑菇子实体及 其菌株的基因组 D N A进行 R A P D多态性分析。由图 l 的扩增结果可以看出,不同的引物扩增的 D N A片 段数目介于 3 - 9 条之间, 存在明显的差异。但同一引 物的扩增谱带基本一致, 除个别条带外, 绝大多数条 带无多态性 。从基因组 D N A水平初步说明所分离菌 株为该野生蘑菇 的纯培养物。 图 1不 同引物对野 生蘑菇子实体 及其分离菌 株 的 R A P D P C R图谱( 两两一组, 每一组为同-7 1 物对子实体及菌 株基因组 D N A的扩增结果1 F i g 1 RA PD a mp l i c a t i o n p r D me o f t h e f r u i t b o d y a n d i s o l a t e o f Ag a fi c u s s p 同时,出菇试验表明, 栽培出的子实体形态、 大 小, 孢子印颜色, 孢子形态及大小等均与所采集的野 生菇基本一致。但由于环境因素的影响, 部分子实体 形态 、颜色等性状与野生状态相比出现了一定 的差 异; 然而三次传代出菇试验表明, 该菇在人工栽培时 具有稳定的遗传性状, 未表现出变异。由此确定该分 离菌株忠实于所采集野生蘑菇 。 2 2 野生蘑菇的分类 2 2 1 子实体 、 分 离菌株茵落形态特征 观察发现, 该菇菌盖初期半球形, 钢盔状, 渐平展 呈凸状,后期近平展,中央略凹陷,直径大小为 4 1 0 c m, 表面均匀覆有丝状鳞片, 初期棕色、 棕褐色, 后 期深褐色, 成熟时, 边缘开裂, 残留有少量菌幕; 菌肉 白色, 薄或稍厚, 受伤不变色; 菌褶离生, 较密 , 不等 长, 初期灰白色、 淡粉色, 后变红色、 褐色、 棕褐色, 最 后呈黑褐色, 受伤变深红色或棕色; 菌柄白色, 长 5 1 2 c m, 直径 0 8 1 8 c m, 由上而下渐变粗, 基部膨大 ( 1 1 - 2 5 c m ) , 初期中实, 后略中空, 菌环以上光滑, 以 下具有近絮状或粉状鳞片, 伤不变色; 菌环由菌盖下 薄膜脱落而成 , 较大 , 下垂 , 白色 , 上表面光滑 , 下表面 具鳞片。 孢子印深褐色。 孢子椭圆形 , 表面光滑 , 成熟 孢子深紫褐色, 一端有乳突或孔口, 多为单核或双核, 少数多核 , 大小 6 - 7 p mx 4 5 t x m( 图 2 ) 。 通过查阅比对 相关资料, 根据形态学特征, 初步确定该野生蘑菇为 赭鳞蘑菇( A s u b r u f e s c e n s ) o 该菌在 C Y M培养基上生长速率偏慢,平板接菌 后置 2 5 C 条件下培养 1 0 d , 菌落平均直径为4 0 m m 。 菌 落白色, 圆形, 边缘波浪状, 有缺刻, 菌丝粗壮, 易扭结 成索状, 试管培养时, 表现出很强的爬壁能力。 试验研究 2 2 2 r DNA-I TS鉴 定 利用 I T S I I T S 4 对野生菇子实体基因组 D N A的 I T S 1 5 8 S r D N A I T S 2区域进行 P C R扩增 , 经测序及 修正分析 ,得到一条约 7 1 0 b p的有效碱基序列, 经 G e n B a n k 核酸序列数据库进行 B L A S T n 搜索发现, 与 其同源性最高的为赭鳞蘑菇( A s u b r u f e s c e n s ) , 同源性 为 9 9 , 其次为巴西蘑菇( A b l a z e i ) 和 A r u f o te g u l i s , 同源性为 9 8 。 结合形态学特征和 I T S 序列比较结果, 将该野生 蘑菇鉴定为赭鳞蘑菇( A s u b r u f e s c e n s P e c k ) 。 图 2赭鳞蘑菇子实体和担孢子形态: a - b野生子实体 , c 一 - e 人工栽培不同阶段子实体, f 担孢子 Hg 2 Mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s ti c s o f Ag a r i c u s s u b mf e s c e n s f r u i t b o d i e s a n d b a s i d i o s p o r e s : a - b w i l d mu s h r o o m, c e f r u i t b o d i e s a t d i ff e r e n t s t a g e s i n c u l ti v a t i o n , f b a s i d i o s p o r e s 3 讨论 尽管 1 9 世纪时赭鳞蘑菇在北美洲的东北地区被 广泛栽培和市场化, 但国内对其研究较少, 多停留在 资源调查阶段,只对其形态特征和分布进行了描述。 自 然界野生赭鳞蘑菇较为少见, 且从菇蕾出现到子实 体成熟、 枯萎时间短暂, 很难采集到各个时期的野生 子实体嘲 。本研究采集到的野生蘑菇经鉴定为赭鳞蘑 菇 ( A g a r i c u s s u b r u f e s c e n s P e c k ) , 国 内多数大 型真菌 资源著作 中多有记载 , 但在浙江鲜见相关报道。 野生大型真菌的菌株分离易受环境、 样本自身特 性和操作者等因素的影响, 现实工作中常通过出菇试 验来确定所分离菌株的真伪, 但该方法所需时间过程 较长, 工作量大, 且有些品种还不能进行人工栽培, 致 使野生菇的开发利用受到一定的阻碍。本文利用 R A P D分子生物学方法对赭鳞蘑菇子实体和所分离 的疑似菌株基因组 D N A进行 P C R扩增, 根据扩增图 谱多态性位点的一致性进行同源性判断, 能够快速验 证所分离菌株的真实性。 该方法是野生大型真菌菌株 “ 真伪” 鉴定的有效方法, 出菇试验也进一步证实了该 方法的正确性和可行性 。 在野生大型真菌分类过程中, 传统的形态学标记 是常用且重要的方法之一, 但形态学标记易受环境条 1 2 丽水农业科技 2 0 1 1年第 4期 件、 地理位置和人为因素等的影响, 很容易出现偏差。 物种基因组 D N A中 I T S区域多为物种进化过程中的 高度保守片段,利用 I TS 序列数据进行系统发育分 析, 能清楚了解物种的同源性和遗传变异。本研究将 形态学和分子生物学方法相结合, 对采集的野生蘑菇 进行分类鉴定 , 两者相互补充 , 进一步确保 了分类结 果的正确性。 巴西蘑菇因其最初发现于巴西而得名, 1 9 8 1 年 被定 名 为 A b l a z e i6 ,后 被广 泛引种 到世界 各地 。 Wa s s e r 研究认为 ,巴西蘑菇应为 A b r a s i l i e n s i s 而非 A b l a z e i ,并对其进行了更名 同 。K e r r i g a n 通过对 A s u b r u f e s c e n s 、 A b l a z e i 、 A b r a s i l i e n s i s 和 A r u f o t e g u l i s 系 统发育、 基因序列、 单孢互交可育及杂交后代遗传学 等进行了分析研究, 认为四者在种的水平上是单一的 谱系单元, 即为同一物种, 属于同物异名, 由于地理位 置、 环境和基因型的影响, 子实体形态及颜色上存在 着差异 6 1 。为此 , Wa s s e r v 8 与 K e r r i g a n t5 , 6 3 进行 了争论 , 但争论的焦点过分强调了干标本形态特征上的区别。 本研究结果显示 ,赭鳞蘑菇 ( A s u b r u f e s c e n s )与 A b l a z e i 、 A b r a s i l i e n s i s 、 A r u f o t e g u l i s在 I T S序列上 高度 同源, 与 K e r r i g a n 的研究结果相吻合。 参考文献 【 I 】 P e c k C H Re p o r t o f t h e B o t a n i s t ( 1 8 9 2 ) 卟 A r 1 u a l Re p o r t o n t he N e w Yor k S tat e M u s e u m o f Na tur al Hi s t or y ,1 8 93 ,4 6: 8 5-1 4 9 2 Hy o d o I , A I T l a n o N, E g u c h i K, e t a 1 Na t i o n w i d e s u r v e y o n c ompl e me n tary an d a l t e rn a t i ve me c ine i n c a nc e r p a t i e nt s in J a p a n 】 J C l i n On c o l , 2 0 0 5 , 2 3( 1 2 ) : 2 6 4 5 2 6 5 4 3 卯晓岚 中国经济真菌 M 北京: 科学出版社, 1 9 9 8 : 2 0 1 - 2 0 5 f 4 卯晓岚 中国大型真菌 M】 郑州: 河南科学技术 出版社, 20 00 :2 0 8-22 3 5 Ke r r i g a n Rw I n c l u s i v e a n d E x c l u s i v e C o n c e p t s o f Ag a r i c u s s u b r u f e s c e n s P e c k : A l e p l y t o Wa s s e r e t al 】 I n t J Me d M u s h r oo r D s ,2 0 0 7, 9: 7 98 4 6 K e r r i g a n w a g a r i c u s s u b r u f e s c e n s , a c u l

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论