乙肝、HIV、梅毒检测技术2016.9.13.pptx

乙肝、HIV 、梅毒实验室检验技术,甘肃省妇幼保健院 临床检验中心：赵翠生,综合产前检查服务+ 检测,孕产妇参加产前检查服务,检测前信息,HBV 检测,梅毒检测,HIV检测,全血细胞计数和其它检测,取血样,2,梅毒的实验室检测,3,梅毒,病原体为梅毒螺旋体，属于密螺旋体属，苍白密螺旋体苍白亚种(Treponema pallidum subspecies pallidum) 苍白亚种 梅毒 苍白螺旋体 地方亚种 地方性梅毒 极细亚种 雅司病 密螺旋体属 品他螺旋体 品他病,梅毒血清学试验基本实验室设备,5,筛查时间,6,梅毒的实验室检测方法,显微镜检测法（诊断技术）： （1） 暗视野显微镜检查 （2） 镀银染色检查 血清学检测法（筛查技术） 非梅毒螺旋体抗原血清试验：检测非特异性抗体：抗心磷脂抗体、即非特异 性抗体、反应素 梅毒螺旋体抗原血清试验：检测特异性梅毒螺旋体抗体,梅毒早期诊断的依据之一是病原学检测，即在组织或分泌物中检测到苍白螺旋体： 暗视野显微镜 镀银染色镜检,梅毒检测技术,8,非梅毒螺旋体抗原血清学试验 RPR（快速血浆反应素环状卡片试验） TRUST（甲苯胺红不加热血清试验） VDRL（性病研究实验室试验） 梅毒螺旋体抗原血清学试验 TPPA（梅毒螺旋体颗粒凝集试验） ELISA（酶联免疫吸附试验） POCT（胶体金技术，快速检测、一站式检测）,梅毒检测技术,9,围产期梅毒检测方法特点,用于诊断产检、临产及分娩的孕产妇是否感染梅毒 梅毒血清学检测筛查试验应具有的特点 具有较高的灵敏度和特异度 操作简单、容易获得、便宜 尽可能在“当日”获得结果,10,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,梅毒螺旋体感染可产生非特异性抗体（非梅毒螺旋体抗体） 非梅毒螺旋体抗体 又称之为反应素，是抗心磷脂等抗原的抗体 随菌体和宿主细胞的类脂质抗原量升高 除梅毒外，其他医学情况会造成非梅毒螺旋体抗原血清学试验假阳性结果，包括结核、疟疾、妊娠和风湿关节炎、狼疮及硬皮病等自体免疫性疾病,11,非梅毒螺旋体抗原血清学试验的特点,非梅毒螺旋体抗原血清学试验： 快速、简便、便宜 敏感性和特异性较高 硬下疳后1-2周变为阳性 可用于 筛查样本 评估对治疗的反应 鉴别复燃还是再次感染,12,确保非梅毒螺旋体抗原血清学试验 质量的关键点,按照标准操作程序（SOPs）进行操作 推荐使用评价特性较好的试剂* 按照统一的标准报告结果 开展实验室质控（QC）和参加室间能力验证（PT）,* 由中国疾病预防控制中心性病中心国家参比实验室提供,13,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,抗体滴度通常与疾病活动度有关 治疗后（可能几个月）非梅毒螺旋体抗原血清学试验通常转变为不反应 如果用同一种实验，相同试验滴度4倍变化（如从1:16下降到1:4或从1:8上升到1:32）为临床显著变化 有些病人，抗体滴度可始终处于较低水平，有时可持续终生（血清固定） 注意：病人血清学监测应在同一个实验室使用同一种检测方法（RPR、TRUST）进行连续多次检测；RPR和TRUST方法均有效，但检测的滴度结果不能直接进行比较,14,治疗后非梅毒螺旋体抗原血清学试验 抗体滴度变化的临床意义,一期梅毒和二期梅毒： 成功治疗，抗体滴度应 3个月后下降2倍 6个月后下降4倍 一期梅毒：1年后抗体滴度转阴 二期梅毒：2年后抗体滴度转阴 晚期梅毒： 治疗后抗体滴度缓慢下降 50%的病人2年后抗体滴度仍为阳性,15,梅毒螺旋体抗原血清学试验,梅毒螺旋体抗原血清学试验 检测梅毒螺旋体抗原特异性抗体 可用于确认非梅毒螺旋体抗原血清学试验的阳性结果，排除其假阳性 阳性结果可持续存在，即使治疗后仍可为阳性。*,梅毒螺旋体抗原血清学试验与疾病的活动度无关，不能用于鉴别现症感染还是既往感染，也不能用于判断疗效,* 一期梅毒治疗病人中，15%-25%可在2-3年后转为血清学阴性,16,妊娠期梅毒检测,所有孕产妇应进行梅毒筛查检测： 孕期尽早（如果可能，在孕早期时）以及 如果在分娩前/临产时没有筛查检测结果，在分娩时检测 筛查检测可应用以下任何一类方法： 非梅毒螺旋体抗原血清学试验（滴度）或 梅毒螺旋体抗原血清学试验 所有筛查检测结果阳性的孕产妇都应用另一类检测方法进行复检确认是否为现症 梅毒 所有产妇及所生婴儿出院前，产妇梅毒检测结果都应记录在病历中，以确保需要时给予治疗,17,孕产妇梅毒检测流程,阴性反应,阳性反应,阴性反应,阳性反应,HIV感染病人的梅毒血清学试验,一些HIV感染病人，其梅毒血清学试验结果不典型，包括 滴度超常高或超常低 滴度不断变动 如果临床表现提示早期梅毒，而血清学试验结果与此不一致，考虑 病灶活检 或 暗视野显微镜检查,注意：对于大多数HIV感染病人而言，梅毒血清学试验是诊断梅毒感染、随访观察疗效准确、可靠的检测方法,19,梅毒血清学检测结果的解释,*包括结核、疟疾、风湿性关节炎或妊娠。,20,暴露婴儿的梅毒检测,21,梅毒暴露婴儿先天梅毒检测,母体非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体IgG抗体可通过胎盘，所以应谨慎地对婴儿梅毒血清学试验结果进行解释 婴儿需要接受预防性治疗还是规范的抗梅毒治疗应根据： 母亲确诊梅毒感染 母亲治疗情况 婴儿梅毒感染的临床表现、实验室或放射线检查结果 母亲及婴儿非梅毒螺旋体抗原血清学试验滴度水平的比较（尽可能在同一个实验室使用相同的试验方法）,22,先天梅毒的诊断,先天梅毒的诊断标准： 梅毒暴露婴儿具有以下条件之一： 任何先天梅毒临床表现 暗视野显微镜检梅毒螺旋体阳性（+） 梅毒螺旋体IgM抗体阳性* RPR/TRUST检测阳性，滴度比母亲分娩前最近一次滴度高4倍及以上 RPR/TRUST监测随访中，任何一次滴度不下降或反而上升 满18月龄后，TPPA检测阳性,* IgM抗体反映近期感染，可帮助鉴别婴儿先天梅毒，但我国尚不能广泛开展,23,梅毒暴露婴儿的评估,梅毒暴露婴儿： 婴儿RPR检测 婴儿RPR检测不能使用脐带血，因其易被母体血液 污染，从而出现假阳性结果 检查先天梅毒临床表现： 非免疫性水肿、黄疸、肝脾大、鼻炎、皮疹、末端肢体假性麻痹 对可疑病灶或体液进行暗视野显微镜检查,24,先天梅毒检测流程,25,梅毒检测小结,早期梅毒诊断可根据在组织或分泌物样本中通过显微检测到苍白螺旋体而诊断 应用梅毒血清学试验进行梅毒筛查 非梅毒螺旋体抗原血清学试验检测梅毒感染过程中产生的非特异抗体。滴度通常与疾病的活动度有关，因此可用于监测对治疗的反应 梅毒螺旋体抗原血清学试验检测对抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体，可用于确认临床诊断或非梅毒螺旋体抗原血清学试验的阳性结果，可反映任何阶段的梅毒暴露 先天梅毒的诊断复杂，应根据： 母亲梅毒感染状态 母亲梅毒治疗情况 婴儿梅毒感染的临床表现、实验室或X线检查结果 母亲、婴儿非梅毒螺旋体抗原血清学试验滴度水平的比较 随访,26,HIV和HBV的实验室检测,HIV和HBV筛查检测,筛查检测 用于诊断产检、临产及分娩的孕产妇是否感染HIV和HBV HIV抗体检测 乙肝表面抗原（HBsAg）检测 筛查检测应 具有较高的灵敏度和特异度 操作简单、容易获得、便宜 尽可能在“当日”获得结果,28,何时使用何种检测？,29,HIV试验和检测,30,HIV检测：抗体检测,一个人感染了HIV病毒后，体内将产生特异性抗体 对抗HIV病毒* HIV抗体通常在感染后4 6周出现，但也有时也会 在感染后3个月才出现 从感染HIV病毒到出现特异的HIV抗体的一段时期 称为“窗口期”,标准的HIV诊断检测是识别HIV抗体* *,注意： *与其他大多数疾病不同，HIV抗体没有保护性作用。,31,HIV抗体检测类型,32,HIV检测：病毒核酸检测,这些检测 检测HIV感染者血液或血浆中的病毒 必须由经过专门培训的实验室人员操作 实验室需有资质，并配备专门设备 昂贵，不是针对所有人进行的常规检测方法 PCR（多聚酶连反应法）检测 HIV DNA定性检测血液中是否含有病毒，用于诊断18月龄内婴儿是否感染HIV HIV RNA定量检测病毒载量，用于监测对抗病毒治疗的反应,33,HIV筛查检测结果的含义,HIV筛查检测结果“阴性(-)”： 受检者没有 感染HIV 或者受检者已经感染了HIV，但处于窗口期：3个月后再次进行检测 HIV筛查检测结果“阳性(+)”： 病人可能已经感染HIV, 但应再次重复检测、另一种方法复检或确诊检测,34,HIV确认试验结果的含义,如果筛查检测结果阳性，两次重复检测中1次或2次检测结果为阳性，需要进行确认试验 免疫印迹法（WB）确认试验结果： -阳性，病人确认感染HIV 阴性，受检者没有感染HIV 不确定，结果为“不确定”，受检者必须在4周后再次采血，重复前述所有步骤进行检测,35,中国预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播HIV检测流程,在产前检查服务中开展整合的检测咨询所采用的HIV检测流程,36,产时HIV抗体检测流程,中国预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播HIV检测流程,37,儿童HIV 检测,38,HIV暴露婴儿和儿童的HIV抗体检测,不是所有HIV感染母亲所生儿童都会感染HIV，但是如果对12-18个月以内的婴儿进行HIV抗体检测，所有HIV感染母亲所生婴儿都有可能是HIV检测结果阳性。 即使婴儿并没有感染HIV 由于母体自身抗体可通过胎盘进入胎儿体内,母体传入的抗体可在婴儿体内持续18个月，所以12-18月龄以内的婴儿不能应用抗体检测方法进行诊断。,39,婴儿感染早期诊断（EID） HIV病毒检测（DNA-PCR）,HIV病毒检测（DNA-PCR） 检测细胞内的HIV病毒， 能够检测低至110 拷贝前病毒DNA，以及 可在HIV暴露婴儿出生后6周内诊断HIV感染 用于HIV暴露婴儿HIV感染早期诊断（EID）,40,应用DNA-PCR方法进行 婴儿感染早期诊断（EID）（1）,如果可以开展HIV DNA-PCR检测，应用干血斑（DBS）在婴儿6周龄时进行PCR检测 如果PCR检测结果阳性尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测 如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV 如果PCR检测结果阴性婴儿出生后3个月再次进行PCR检测,41,应用DNA-PCR方法进行 婴儿感染早期诊断（EID）（2）,出生后3个月再次进行HIV DNA-PCR检测 如果PCR检测结果阳性尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测 如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV 如果PCR检测结果阴性，婴儿视为未感染HIV 考虑在婴儿满12月龄时进行HIV抗体检测（如有必要，在18月龄时再次进行检测）,检测结果阴性的婴儿接受母乳喂养，必须在停止母乳喂养后6周再次进行PCR检测，以确保婴儿没有在母乳喂养期间感染HIV。,42,婴儿HIV感染早期诊断流程,43,HIV暴露婴儿/儿童的HIV抗体检测,所有HIV感染母亲所生儿童，在出生后6周或3个月未接受早期感染检测者，应进行HIV抗体检测。检测时间： 满12月龄 和 满18月龄（必要时，见HIV抗体检测流程） 出生后3个月（接受早期感染检测者）检测结果为阴性的儿童也应接受HIV抗体检测,满18月龄HIV抗体检测阳性，可确认儿童HIV感染。,44,HIV暴露儿童HIV抗体检测流程,45,HIV感染的实验室监测,46,HIV感染的实验室监测,实验室监测主要用于： 决定开始抗病毒治疗还是预防性应用抗病毒药物 是否有抗病毒治疗指征？ 效果监测 抗病毒治疗有效吗？ 毒性监测 抗病毒药物是否引起了其他问题？,47,CD4+ T淋巴细胞是HIV病毒攻击的靶细胞 CD4+ T淋巴细胞检测用于： 决定开始抗病毒治疗还是预防性应用抗病毒药物 为判断抗病毒治疗成功或失败提供定量依据 对调整抗病毒治疗方案提供指导 孕期每3个月及产后4 6周应进行CD4+ T淋巴细胞检测 急性感染时可适当推迟检测，(因为在急性感染期， CD4+ T淋巴细胞通常会下降）,CD4+ T淋巴细胞检测,48,病毒载量测量血浆中的病毒数量 病毒载量检测可用于： 是抗病毒治疗失败早期、最可靠的标记物 监测对抗病毒治疗的反应 诊断HIV感染后和孕晚期各进行一次病毒载量检测,病毒载量（RNA-PCR）检测,49,HIV感染孕产妇常规实验室监测（1）,50,HIV感染孕产妇常规实验室监测（2）,51,HBV感染的检测,52,妊娠期HBV感染筛查,所有孕产妇均应在孕期尽早接受HBsAg检测筛查是否感染HBV 如果分娩前尚未有检测结果，应在分娩前尽快进行检测 如果HBsAg检测阳性，有条件可考虑进行其他HBV标记物检测。 注意，暴露婴儿的处置不受母亲其他HBV标记物检测结果的影响,53,乙肝标记物列表,54,HBV暴露婴儿的实验室检测,HBsAg阳性母亲所生婴儿，出生时高效免疫球蛋白应用以及接受乙肝疫苗接种，并在完成全部3剂乙肝疫苗接种后的 6个月接受HBsAg和抗HBs抗体检测（即出生后12个月时） 结果解释： 如果HBsAg阳性并持续6个月，婴儿慢性感染 如果抗Hbs抗体阳性（1000IU/ml），婴儿有免疫保护 如果HBsAg阴性和抗HBs抗体 1000IU/ml，婴儿应再次接受3剂乙肝疫苗接种,55,要点-HIV,使用快速筛查试验诊断HIV感染。筛查检测结果阳性进行确认试验以保证结果的准确性。 HIV感染抗病毒治疗应根据： CD4+ T淋巴细胞计数检测结果，反映HIV对免疫系统的影响 HIV病毒载量检测结果，反映血液中HIV病毒的数量 如果有条件，应用 PCR方法检测HIV-DNA诊断婴儿是否HIV感染 儿童满12-18月龄，HIV抗体检测方可确认儿童是否感染,56,要点-HBV,通过筛查HBsAg诊断HBV感染 如有条件，筛查HBsAg结果阳性，可进一步检测其他 HBV标记物 HBsAg阳性母亲所生婴儿，出生时接受乙肝疫苗接种，应在出生后12个月接受HBsAg和抗HBs抗体检测,57,婴儿艾滋病感染早期诊断检测 标本采集、运输及保存的要求,临床检验中心：赵翠生,内 容,干血斑标本的采集 干血斑标本的制作 干血斑标本的保存 干血斑标本的运输 合格和不合格的干血斑 注意事项 送样单的规范填写,什么是干血斑（DBS）？,干血斑是 直接用滤纸收集一滴全血进行干燥 用于血样本的长时间储存 DBS是用HIV DNA-PCR方法进行婴儿HIV感染早期诊断检测的最佳采血方法 HIV DNA和HIV抗体可稳定地保存在干血斑中 转运方便：无需冷藏,60,干血斑（Dried Blood Spot DBS）,使用Whatman903滤纸片，患者的全血制备 末梢血直接用于DBS的制作 采集用EDTA抗凝的静脉血混匀滴在滤纸片上制备DBS；,采集样本所需要的设备,末梢采血针或静脉采血 酒精棉 血样本采集卡片(滤纸片 可密封的塑料袋 湿度指示卡 干燥剂（1-2g/袋）,采集末梢血DBS,采集部位：足弓（幼儿采血点）,采集末梢血DBS,成人或1岁以上儿童手指采血点 中指或无名指 手掌面，非指尖或侧面,采集末梢血DBS,用70 乙醇或酒精棉消毒采血部位 用消过毒的针头小心刺破皮肤,采集末梢血DBS,弃去第一滴 末梢血,采集末梢血DBS,将第二滴血直接点在滤纸片中央的圆圈 而不是用毛细管转移血液,采集末梢血DBS,大约每孔需要60-80ul全血 保证圆圈滴满 每个样品应点满一张滤纸片的每个孔,采集抗凝静脉血DBS,静脉血充分与EDTA混合 采集后立即制备DB 血浆与血细胞分层的全血在制备干血斑前，应轻柔地上下颠倒采血管（避免血细胞破裂），血液混匀后制备,用移液枪加代滤芯枪头移取50-80ul血液 枪头对准印圈的中心缓慢将血液滴于滤纸上 避免有气泡 应滴满一张滤纸片的每个孔,采集抗凝静脉血DBS,制作及干燥DBS,避免触摸或涂抹血斑 室温空气中水平干燥至少4个小时，（在潮湿 气候下至少24小时） 避免阳光直晒 在干燥过程中不允许加热、叠加或将DBS接触其他物体表面 DBS上标记受检者编号、姓名和收集日期,制作及干燥DBS,DBS的保存方法,最好一个样本一个包装，多个样本一个包装时，样本间用称量纸隔开 放入可密封塑料袋中 加2包干燥剂 加1片湿度指示卡 标记包装中的内容物并密封,DBS的保存方法,避免阳关暴晒和加热 完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周 2周后的DBS样品必须存放在-20 或以下,NBS的包装及运输,第一层包装好的DBS放入结实的纸袋中 放入对应的送样单 将上述两样放入邮寄信封中并密封,NBS的包装及运输,包装运输时避免折压滤纸片干血斑样品 如果DBS样品收集后存放在室温并在2周内运送，可常温下用特快专递运送 已经保存在-20 或以下的样品，应在冷冻条件下运送,血液充分吸收透过滤纸，填满印圈，不要在一个圈上重复采血，避免触摸或涂抹血斑,合格的DBS,合格的DBS,原因： 1. 血液未渗透滤纸或未填满圆圈前将滤纸移走 用毛细管转移血液 在取样前或后用戴手套或不戴手套的手触摸滤纸，滤纸上粘有洗手液,原因：毛细管或其他锐器移取血液,不合格DBS,样本在干燥小于4小时前即寄出,吸附血液过多 双面贴,用力挤压针刺点周围 采血前或后滤纸面沾染洗手液、滑石粉、酒精、化学试剂、杀毒剂、水等 将血斑直接加热,在针刺之前未将采血处酒精擦干 4. 用毛细管转移血液 滤纸沾染酒精，洗手液 5. 过分挤压采血处 不正确地干燥滤纸,同一采血圈多次滴血 双面贴,不合格DBS,注意事项,仅在滤纸的一面采血 在一个印圈上不可追加滴血 采末梢血时不要将滤纸片压迫针刺部位采血 2个充分吸附的血液的印圈要比5个不完全吸附的印圈要好,早期诊断检测标本送样单,此处由标本采集机构填写 标本采集机构名称： 省(直辖市、自治区) 地(市、州) 县(市、区) 婴儿编号：（同个案登记卡编号） 婴儿母亲姓名： 婴儿姓名： 性别： 出生日期：年月日 采样情况：第 次采血 采血时月龄 采血日期：年月采血人： 标本制备人： 送样人联系电话： 送样人签字 标本送出日期（指标本送至辖区妇幼保健机构的日期）：年月日,送样单的填写,标本采集机构：婴儿编号共计17位（个案登记卡编号）,A,B,C,D,E,A：地区行政编码，共6位 B：单位机构代码，共3位 C：年份，共4位 D: 个人编码，共3位 E：婴儿单双胎，1位（单胎为1，双胎为2）,早期诊断检测标本送样单,此处由送检妇幼保健机构填写 标本送检机构名称： 省(直辖市、自治区) 地(市