课件：方药设计毒理研究.ppt

药物毒理研究,周玖瑶 2010,12,近半个世纪国外发生的重大要害事件 年代 药物 毒性表现 受害人数 53 非那西丁 肾损害、溶血 2000人，死亡500人 56 三苯乙醇 白内障、阳痿、 1000人，死亡占% 56 反应停 海豹样畸胎 1万人，死亡5千人 67 氨苯唑啉 肺动脉高压 70%用药者 60 异丙肾气雾剂 心律失常、心衰 死亡3500人 63 氯碘喹啉 脊髓变性、失明 7856人，死5% 33 已烯雌酚 下代阴道腺癌 300人 68 心得宁 角膜、心包、腹膜损害 2257人,药物不良反应的发展史,国家药品不良反应监测中心 发布药品不良反应信息通报,乙双吗啉白血病 壮骨关节炎肝损害 清开灵注射液过敏反应 双黄连注射液过敏反应 苯甲醇儿童臂挛缩症,近期从美国市场上撤出的处方药（1）,近期从美国市场上撤出的处方药（2）,中药需进行系统毒理学研究, 长期用药安全性了解较少 长期用药之安全性了解较少 “无毒”中药长期给药可致器质性损害 新生儿溶血症/禁用黄连事件；小 柴胡汤/间质性肺炎,“替代”用中药 木通/关木通；粉防己/广防己；马兜铃酸、马兜铃酰胺所致急性肾衰. 德国联邦药品和医疗用品局96年6月限制使用番泻、鼠李皮、大黄、芦荟等含蒽醌类中药. 一、二类中药/有效成份、部位、活性成分浓缩/药效、毒性增强.,1. 临床前毒理学研究 药品临床前毒理学研究的重要性 通过受试药的毒理学试验，确定受试药的剂量与毒性作用的相关性以及药物的安全剂量范围；,安全性研究的重要性和局限性, 认识药物毒性作用的靶器官和靶组织，以确定药物毒性作用的选择性； 观察药物毒性作用的发生、临床特征及发展过程是否可逆，以判断药物毒性的性质。 这些研究结果是预测药品临床应用安全性的重要依据。,例: 50年代中期，法国上市外用药二碘二乙基锡，因动物毒性研究不充分，缺乏初期临床安全性评价，药品仓促上市应用造成207例中毒，110人死亡，再次提醒人们认识新药研究中临床前毒理学研究的重要性。,药品临床前毒理学研究的局限性 人体临床用药的不良反应和药品动物毒性研究的相关率不及25%。,实施GLP是提高药品毒理学研究质量的重要保证。, 实验动物缺乏人所具有的对药物毒性作用的主觉反应； 毒理试验动物数量有限，发生率低的毒性反应，难以经小样本实验得以发现； 所用动物均系实验室培养品系，且多为健康动物，对药物的反应性多较单一。 人体的疾病因素，可能影响人体对药物的反应性，以致产生在临床前毒性试验中难以观察到的毒性现象。 人与实验动物在药物代谢动力学方面的差异，亦会造成人与实验动物对药物毒性反应的差异。,药品临床前毒理学研究局限性的原因：,2.上市前药品临床安全性评价存在局限性的原因,2) 上市前临床试验疗程一般较短，观察期亦较短。一些需经较长时间应用才能发生的反应，或停药后的滞后不良反应，难以在临床试验期间被观察到；,1) 上市前药品临床试验病例数相对较少，一些低频度不良反应，很难在此期间被发现；,3) II期和III期临床试验，受入选条件的限制（入选病例年龄、合并症均有限制） ，不可能观察到受试药品对特殊人群的毒性作用；,4) 对照性临床试验的观测指标只限于实验设计规定的内容，观察临床反应，可能被疏漏，导致临床评价的片面性。,5) 不可能认识偶见不良反应（0.1-1%） 和罕见不良反应（0.01%）,我国1979年颁布“药政管理法” 1985年颁布“新药审批法” 1999年SDA颁布GLP及GCP 2001.12 颁布“药品管理法”,加强药政管理,药物急性毒性研究,概述,急性毒性是指动物一次或24小时内多次接受一定剂量的受试物，动物在短期内出现的毒性反应。 急性毒性目的:为新药的研发提供参考信息。,二、急性毒性试验的基本原则：,（一）试验管理 急性毒性试验必须执行“药物非临床研究质量管理规范（GLP）”。 （二）试验设计 试验设计应符合随机、对照、重复的基本原则。,三、急性毒性试验的基本内容,（一）受试物 急性毒性研究的受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品，因此建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。 溶媒或赋形剂：选择合适的溶媒或赋形剂。,（二）实验动物 一般应采用哺乳动物，雌雄各半。如临床为单性别用药，则可采用相对应的单一性别的动物。大、小鼠为常用的实验动物，其他动物也可使用，当采用非啮齿类动物更适合进行研究时，尽可能采用非啮齿类动物。啮齿类动物应符合国家实验动物标准级及其以上等级要求，非啮齿类动物应符合国家实验动物标准级及其以上等级要求。 通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童，建议考虑采用幼年动物。动物初始剂量不应超过或低于平均体重的20,（三）试验分组 除设受试物合适的剂量组外，还应设空白（和或阴性）对照组。 （四）给药途径 给药途径不同，受试物的吸收率、吸收速度和暴露量会有所不同，为了尽可能观察到动物的急性毒性反应，可采用多种给药途径进行急性毒性试验研究。给药途径一般采用两种给药途径，其中一种应与拟临床给药途径一致，如不采用拟临床途径给药，必须充分说明理由。灌胃给药时应空腹。,（五）给药容量： 灌胃给药，大鼠给药容积每次一般不超过20ml/kg，小鼠每次一般不超过40ml/kg；其他动物及给药途径的给药容量可参考相关文献及根据实际情况决定。 （六）观察期限： 一般为714天，如果毒性反应出现较慢应适当延长观察时间，如观察时间不足7天，应充分说明理由。 一般应详细观察给药后4小时内动物的反应情况，然后每天上、下午各观察一次。,（七）观察指标： 包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等。 记录所有动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。 对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。,（八）结果处理和分析 1、根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的量效关系及随时间的变化。 2、判断出现的各种反应可能涉及的器官、组织或系统等。 3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签字的报告及有病变组织的病理照片。,4、根据不同剂量组各种反应的发生率、动物死亡情况等，判断动物对受试物的耐受性、最大无反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量、最小致死剂量等，初步判断药物的安全范围。 5、说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。 6、应根据急性毒性试验结果，提示在其他安全性试验、临床试验、质量控制方面应注意的问题，同时，结合其他安全性试验、有效性试验及质量可控性试验结果，权衡利弊，分析受试物的开发前景。,急毒试验的一般研究方法,致死量法： 药物毒性的大小，可用动物的致死量（Lethal dose）来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。在测定致死量的同时，还应仔细观察动物死亡前的中毒反应情况。 致死量的测定主要包括最小致死量（LD5）、半数致死量（LD50）和最大致死量（LD95）。由于LD50的测定较简便，故致死量的测定一般采用LD50。,最大耐受量试验： 最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）是指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。从获取安全性信息的角度考虑，有时对实验动物的异常反应和病理过程的观察、分析，较以死亡为观察指标更有毒理学意义。,最大给药量试验： 最大给药量指单次或24小时内多次（2-3次）给药所采用的最大给药剂量。最大给药量试验是在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量给予实验动物，观察动物出现的反应。有许多中药、天然药物毒性较低，如单次给药量远远大于药效学试验等效剂量时，可不必进行更大剂量的观察。,其他方法 固定剂量法（Fixed-dose procedure） 剂量累积试验法 近似致死剂量法 (Approximate Lethal Dose ALD) 扩展试验法 剂量探测试验法,固定剂量法（Fixed-dose procedure）：1984年由英国毒理学会提出，不以死亡而是以明显的毒性体征作为观察终点进行评价。 试验选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量进行实验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。,固定剂量法（Fixed-dose procedure）,1) 首先用雌性动物进行预试。,（有毒性）,（有毒性）,每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。,2）正式试验 动物：每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。 剂量：根据预试的结果，选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验。 周期：给药后至少应观察2周，根据具体特点可适当延长。 观察指标：观察记录内容包括：体重、皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。毒性反应出现和消失的时间，准确的动物死亡时间。所有动物（死亡或处死的动物）均应进行尸检，尸检异常的器官应作病理组织学检查。仔细观察和详细记录。 给药当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。试验结果参考下表标准进行评价。,固定剂量法试验结果的评价,剂量累积法（金字塔法，Pyramiding dosage design） 动物：8只非啮齿类动物，对照和给药组各4只，雌雄各2。 剂量：剂量的设计通常是1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，或10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时止。 判断标准：没有动物死亡时，最高剂量或限制剂量小于MLD和LD50；某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间；当二个剂量均出现部分动物死亡，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间；假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物5-7天，以确定后续的重复给药实验中高剂量的选择。,近似致死剂量法 (Approximate Lethal Dose ALD),1）实验动物：6只健康Beagle犬（4-6月龄）或猴（2-3岁），选用其他物种的动物时应说明理由。,2）试验过程： 估计毒性范围：根据小动物的毒性试验结果和有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。 设计剂量序列表：按50%递增法，设计出数个序列剂量。估计出可能致死剂量范围。 近似致死剂量范围：每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量；然后用二者之间的剂量给一只动物，如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围。如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。,50mg/kg 75mg/kg 113mg/kg 169mg/kg 253mg/kg 380mg/kg,最高非致死量,最低致死量,近似致死 量范围,死亡,存活,死亡,存活,近似致死 量范围,113169mg/kg,169253mg/kg,近似致死剂量范围测定过程,剂量序列,上下法（阶梯法，序贯法，Up and Down Method）,Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce改进， OECD和EPA推荐方法之一。特点：节省动物；可观察毒性表现和估算LD50及其可信限；适合动物快速死亡药物。,1）限度实验 用于受试物可能没有毒性的情况。试验剂量为2000 mg/kg，特殊情况下也可使用5000 mg/kg。,2000mg/kg （1只）,存活,主试验,死亡,2000mg/kg （4只）,3或3只以 上死亡,LD50 2000mg/kg,3或3只以 上存活,LD50 2000mg/kg,主试验,观察 14天,结束试验,5000mg/kg （1只）,存活,主试验,死亡,3或3只以 上死亡,LD50 5000mg/kg,3或3只以 上存活,LD50 5000mg/kg,主试验,5000mg/kg （2只）,存活,LD50 5000mg/kg,有死亡,5000mg/kg （1只）,5000mg/kg （1只）,结束试验,结束试验,观察 14天,观察 14天,2）主试验:,每次给药1只动物，间隔至少48小时。剂量序列选择： 1.75、5.5、17.5、55.3、175、553、1750 mg/kg（R3.16) 在得到致死量范围后，以R=1.2剂量序列进行试验，如： 52.5175 则 50、60、72、86.4、104、124、149、179,低于LD50估 计值（1只）,存活,死亡,高1级剂量,低1级剂量,死亡,存活,低1级剂量,死亡,结束试验,存活,高1级剂量,结束试验,序贯法软件下载：/oppfead1/harmonization /,不同注册类别新药急性毒性试验的一般要求,1中药、天然药物 1）中药1-5类：其物质基础较传统中药发生了明显改变或较少应用经验，一般采用两种途径和两种动物（啮齿类和非啮齿类）给药。 2）临床为非静脉给药：则增加用静脉给药方式，以便全面暴露受试物的毒性反应。如果因为制剂（口服）等原因不能采用静脉给药，应充分说明理由，此时可采用另一种给药途径或仅采用一种拟临床给药途径进行毒性反应的观察。 3）中药6类（复方制剂）：如处方组成符合中医药理论，有一定的临床应用经验，可仅采用一种动物，按拟临床给药途径进行；如复方制剂为天然药物复方制剂，应采用两种实验动物（啮齿类和非啮类），按拟临床给药途径进行给药；如处方中含有天然药物、有效成份或化学药品，则应对上述药用物质进行急性毒性的相互作用研究。 4）中药7类（改变上市药品给药途径，不包括非注射剂改为注射剂）：可用一种动物，比较改变前后两种不同给药途径的毒性反应。 5）中药8类（改变上市药品剂型或工艺但不改变给药途径）：如制备工艺有质的改变，建议采用一种动物，按拟临床给药途径进行急性毒性的观察。 6）中药9类（增加新适应症或功能主治的品种）： 一般不需进行急性毒性研究。,2化学药品 1）西药1-2类（国内外未上市的药品和新给药途径制剂）：一般采用两种途径和两种动物（啮齿类和非啮齿类）给药。如只有静脉注射制剂，只需一种静脉给药途径。复方药物需进行急性毒性拆方分析。 2）西药3类（尚未在国内上市药品）：提供资料。 3）西药4类（改变酸根、碱基，不改变其药理作用的原料药及其制剂）：如已在国外内上市，只需提供资料。,药物长期毒性研究,概述,长期毒性研究（重复给药毒性研究） 是反复多次给药的毒性试验的总称，描述动物重复给予受试物后的毒性特征，它是非临床安全性评价的重要内容。,长期毒性研究的主要目的,发现受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、可逆性等； 推测受试物重复给药的临床毒性靶器官或靶组织； 预测临床试验的起始剂量和重复用药的安全范围； 提示临床试验中需重点监测的安全性指标； 对毒性作用强、毒性症状发生迅速、安全范围小的受试物，长期毒性研究还可以为临床试验中的解毒或解救措施提供参考信息。,中药在我国已有几千年的应用历史，有丰富的临床应用经验，相对化学药而言多数中药具有毒性低的特点。 但是，中药的低毒和无毒是相对的。当前，各种新技术、新工艺不断应用于中药新药的开发，而且从中药、天然药物中提取的有效成分、有效部位及其制剂日益增多，实际上很多中药、天然药物新药已不同于传统意义上的中药，因此对其临床前安全性评价应给予足够的重视。,长期毒性研究试验周期长，耗资高，工作量大，若因试验设计不合理，或所进行的试验未充分揭示中药的毒性特征，则会造成人力、物力、财力的浪费，也会影响新药的研究速度。 充分认识长期毒性研究的重要性，合理、科学地进行长期毒性研究试验设计，对试验结果进行科学的分析，是新药非临床安全性评价的基本要求。,指导原则是根据中药、天然药物的特点，结合国际上药物安全性评价的要求和我国药物安全性评价研究现状而制订的。 技术指导原则适用于中药、天然药物新药长期毒性研究。 指导原则为长期毒性研究的一般性原则，仅代表目前对长期毒性研究的基本认识。,中药、天然药物的新药研究情况复杂，本指导原则尚不能涵盖中药、天然药物长期毒性研究的全部内容，在进行长期毒性研究时，应遵循“具体问题具体分析”的原则。,二、长期毒性研究的一般原则,(1)长性毒性研究应遵循“具体问题具体分析”的原则。 (2)长期毒性研究的试验设计应符合随机、对照、重复的原则。 药物的开发是一个连续的、渐进的系统工程，长期毒性研究是药物开发的一个有机组成部分。长期毒性研究不能与其它药理学、药代动力学和其它毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其它药理毒理研究的试验设计和研究结果。 长期毒性研究的结果应该力求与其它药理毒理研究结果互为印证、说明和补充。,三、长期毒性研究的基本内容,（一）试验管理 长期毒性研究必须执行药物非临床研究质量管理规范（GLP）。,（二）受试物 长期毒性研究的受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品 因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。 如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。试验中所用溶媒或赋形剂应标明批号、规格及生产厂家。,（三）试验动物 长期毒性研究一般需采用两种动物进行 一种为啮齿类，常用大鼠:大鼠应符合国家实验动物标准II级及其以上等级要求 一种为非啮齿类，常用Beagle犬或猴: 非啮齿类动物应符合国家实验动物标准I级及其以上等级要求。,长期毒性研究一般选择健康、体重均一的动物，雌性应未孕。 所选用的动物种属应尽可能与药效学研究所用的动物相一致。必要时，也可选用疾病模型动物进行试验。 原则上，动物应雌雄各半。当临床拟用于单性别时，可采用相应性别的动物。,应根据研究期限的长短和受试物的使用人群范围确定动物的年龄。一般情况下，大鼠为4-9周龄；Beagle犬为6-9月龄，不宜超过12月龄。 每组动物的数量应能够满足试验结果的分析和评价的需要。 一般大鼠可为雌、雄各10-30只 犬或者猴可为雌、雄各3-6只。若试验中期要处死动物，应相应地增加动物数。,（四）给药途径 原则上应与临床拟用药途径相同。 口服给药者一般采用灌胃给药 临床用药为静脉注射时，若由于给药周期长，大鼠静脉注射有困难时，可用其它适宜的注射途径代替。 如选择其它的给药途径，应说明理由。,（五）给药频率 原则上应每天给药，每天给药时间应相同。 试验周期长（3个月或以上）者，也可采取每周给药6天。 特殊类型的受试物由于其毒性特点和临床给药方案等原因，应根据具体药物的特点设计给药频率。,（六）给药期限 长期毒性研究给药期限的长短，通常与拟定的临床疗程长短、临床适应症、用药人群相关，应充分考虑预期临床的实际疗程。 给药期限为1个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程不超过2周的药物进行临床试验。,临床疗程超过2周的药物，可以在临床前一次性进行支持药物进行III期临床试验（生产）的长期毒性研究。 在这种情况下，如长期毒性研究拟定给药期限在三个月以上，可先对三个月完整的阶段性研究资料进行评价。但在进行III期临床试验前，必须完成全程长期毒性试验研究资料。,临床疗程超过2周的药物，也可以根据具体情况，以不同给药期限的长期毒性研究来分别支持药物进入I期、II期或III期临床试验（生产）。 通过给药期限较短的毒性研究获得的信息，可以为给药期限较长的毒性研究设计提供给药剂量、给药频率、检测指标等方面的参考； 临床试验中获得的信息有助于给药期限较长的动物毒性研究方案的设计，有利于降低药物开发的风险。,一般药物的长期毒性研究给药期限参考,注：表中长期毒性研究给药期限不包括恢复期。应根据具体情况设计不同的恢复期。*此处是指临床疗程超过2周的药物，可用一个月的长期毒性试验来支持药物进行I期临床试验。,以不同给药期限的长期毒性研究来分别支持药物进入I期、II期或III期临床试验（生产）时，不同给药期限的长期毒性研究的内容不应简化。 无论采用何种模式，长期毒性研究的内容应完整、规范，对结果的分析评价应科学、合理。 当某一药物预期长期使用，或用于复发性疾病而需经常反复给药时，应进行最长试验期限的长期毒性研究。 当功能主治有若干项的，应按照临床最长疗程的功能主治来确定长期毒性研究的给药期限。,如临床给药需采用多个疗程，疗程之间间隔时间不足以使受试物可能对机体组织器官造成的损害恢复，则需按多个疗程的时间之和作为参照的临床疗程； 如疗程间隔时间基本可判断足以使受试物可能对机体组织器官造成的损害恢复，则可按单个疗程的时间作为参照的临床疗程。,（七）给药剂量-设计的一般原则 一般情况下，至少应设3个剂量组和对照组（赋形剂或和空白对照组）。 低剂量组原则上应高于同种动物药效学试验的有效剂量或预期的临床治疗剂量的等效剂量。 高剂量组原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至可引起少量动物死亡（对于毒性较小的中药，可尽量采用最大给药量）。 在高、低剂量之间至少应再设一个中剂量组。,应根据实际情况进行合理的剂量设计，如出现未预期的毒性反应或不出现毒性反应时，可在设计更长时间的长期毒性研究时适当调整剂量。 若受试物在饮食或饮水中给予时，应能充分保证受试物的均一性、稳定性和定量摄入，提供相关的检测报告，并应根据动物生长和体重的变化情况而调整在饮食或水中的剂量。 局部给药时，应尽可能保证给药剂量的准确性及与局部充分接触的时间。,（八）观察指标 原则上，除常规观察指标外，还应根据受试物的特点、在其他试验中已观察到的某些改变，或其他的相关信息（如方中组成成分有关毒性的文献），增加相应的观测指标。,常规需观察的指标 1、一般状况观察 在试验期间，应观察动物外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便、摄食量、体重、给药局部反应。,2、血液学指标 一般血液学检测指标。至少应观察红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板、凝血时间等。当发现对造血系统有影响时，应进一步进行网织红细胞计数、骨髓的检查。,3、血液生化学指标 一般血液生化学检测指标 4、体温、眼科检查、尿液检查、心电图检查 非啮齿类动物还应进行体温、眼科检查、尿液检查、心电图检查等。尿液检查指标,5、系统尸解和组织病理学检查 51 系统尸解 应对所有动物进行尸解，尸解应全面细致，为组织病理学检查提供参考。 52 脏器系数 应对脏器进行称重，并计算脏器系数。,53组织病理学检查 当所用动物为非啮齿类动物时，因动物数较少，应对所有剂量组、所有动物的器官和组织进行病理组织学检查。 当所用动物为啮齿类动物时，应对高剂量组和对照组的器官和组织进行病理学检查，如果高剂量组出现组织病理学变化时，更低剂量组也应进行病理组织学检查以确定剂量-毒性关系。 若在尸检时发现器官和组织有肉眼可见的病理变化时，应对此脏器或组织进行详细的病理组织学检查。 有效成分或有效部位制成的制剂所需检查的脏器和组织参考。,若为一般的中药复方制剂，所检查的脏器和组织可减少为： 心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、十二指肠、回肠、结肠、脑垂体、脊髓、胸骨（骨和骨髓）、淋巴结、膀胱、视神经、睾丸（含附睾）、子宫、卵巢、胸腺、肾上腺、甲状腺、前列腺及给药局部组织等。,应注意脏器和组织的取材保存，如在高剂量组发现有异常病变时，则可对取材保存的更低剂量组的脏器、组织时进行检查。 必要时还应增加其他器官组织的检查。 另外，根据所含中药的性、味、功效、主治等不同情况，可能需增加相应的病理组织学检查； 根据受试物特性和初步试验结果，可能需要进行更进一步的组织病理学检查，这均遵循具体情况具体分析的原则。,（九）观察指标的时间和次数 应根据试验期限的长短和受试物的特点而确定试验期间观察指标的时间和次数，原则上应尽早、及时发现出现的毒性反应。,试验前，啮齿类动物至少应进行适应性观察3-5天，非啮齿类至少应驯养观察1-2周，应对试验动物进行外观体征、行为活动、摄食量和体重检查，非啮齿类动物还至少应进行2次体温、心电图、有关血液学和血液生化学指标的检测。 试验动物相关指标的历史数据在长期毒性研究中也具有非常重要的意义。,试验期间，一般状况和症状的观察，应每天观察一次，饲料消耗和体重应每周记录一次。 大鼠体重应雌雄分开进行计算。 试验结束时应进行一次全面的检测。 当给药期限较长时，应根据受试物的特点选择合适的时间进行中期阶段性的检测。,长期毒性研究应在给药结束留存部分动物进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。 应根据受试物的代谢动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和恢复期确定恢复期的长短。 恢复期观察期间除不给受试物外，其他观察内容与给药期间相同。 在试验期间，对濒死或死亡动物应及时检查并分析原因。,（十）结果及分析 试验报告应全面客观反映整个试验过程收集的原始资料和信息，应详细描述毒性的主要表现、大体解剖检查和/或病理组织学检查结果等，并说明数据处理的统计学方法，如用计算机处理数据，应指出所用程序名称。结果应以清楚、准确的方式来表示。,长期毒性研究的最终目的在于预测人体可能出现的毒性反应。 只有通过对研究结果的科学分析和评价才能够清楚描述动物的毒性反应，并推测其与人体的相关性，因此长期毒性研究结果的分析和评价是长期毒性研究的必要组成部分。 分析长期毒性研究结果的目的是判断动物是否发生毒性反应，描述毒性反应的性质和程度（包括毒性发作时间、程度、持续时间以及可逆性等）和靶器官，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。,应重视对动物中毒或死亡原因的分析，注意观察毒性反应出现的时间和恢复的时间及动物的死亡时间。 应对所获取的数据进行全面和科学的分析，对在正常范围以外的各实测值应在试验结果中详细列出，对异常数据予以合理的分析。 在分析长期毒性研究结果时，应正确理解均值数据和单个数据的意义，综合考虑数据的统计学意义和生物学意义。,正确利用统计学假设检验的结果有助于确定试验结果的生物学意义，但具有统计学意义并不一定代表具有生物学意义。 在判断生物学意义时应考虑与该实验室的历史数据相比较。 根据长期毒性研究结果，分析讨论需在临床、质量可控性研究中注意的问题。 长期毒性研究结果还应结合其他相关安全性试验及药/毒代动力学的结果进行分析。,（十一）综合评价 1应结合其他安全性试验的毒性反应情况，判断毒性反应是否存在种属差异，是否需进行进一步的研究。 2应结合临床前药效学试验结果和拟临床适应症，判断有效性与毒性反应的关系，判断药物对正常动物和模型动物的生理生化指标的改变是否相同或相似，并注意提示临床研究应注意的问题。 对受试物引起的严重的毒性反应，应尽可能查找产生毒性的原因，根据相关文献资料或试验资料，推测可能的毒性成分，提出是否对处方工艺及处方中的某些药材或某些成分需进行特别的控制等。 3结合临床主治（适应症），权衡利弊，考虑其开发前景。,（十二）其它考虑 某些其他安全性试验项目，如一般药理学研究中的心血管系统等指标的观察、注射给药的局部刺激性的观察、免疫毒理研究、有依赖倾向的受试物的依赖性观察、毒代动力学研究等均可结合长期毒性研究同时进行。,在所进行的试验中，尽量获取更多的和所需要的信息。 鼓励创新药进行毒代动力学研究。 因有些中药已有一定的临床应用经验，对受试物的长期毒性研究可结合以往的临床应用和文献情况及其它试验结果进行综合评价。,四、不同情况的中药、天然药物长期毒性研究的一般要求,考虑到中药、天然药物各类药物处方来源、立题依据等的不同，在具体进行试验时可参照以下要求进行。 但这些要求仅是一般要求，研制者应遵循新药开发的客观规律，具体试验时应根据受试物自身特点、具体情况来进行设计，考虑需进行哪些研究。,1未在国内上市销售的从中药、天然药物中提取的有效成分及其制剂，未在国内上市销售的来源于植物、动物、矿物等药用物质制成的制剂，未在国内上市销售的中药材新的药用部位制成的制剂，未在国内上市销售的从中药、天然药物中提取的有效部位制成的制剂，未在国内上市销售的由中药、天然药物制成的注射剂 以上情况，由于其物质基础较传统中药发生了明显改变，或应用经验较少，为全面考察受试物的长期毒性反应情况，应采用两种动物进行长期毒性研究（建议为啮齿类和非啮齿类），并仔细分析产生毒性反应的原因。,2未在国内上市销售的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂 若处方中各味药材均符合法定标准，无毒性药材，无十八反、十九畏等配伍禁忌，又未经化学处理（水、乙醇粗提除外），急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应，临床实际用药期为1周以内者，可免做长期毒性试验。,临床用药超过一周，未在国内上市销售的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂，可先进行一种动物（啮齿类）的长期毒性试验，当发现明显毒性时，为进一步研究毒性情况，再采用第二种动物（非啮齿类）进行研究。 若该类处方中含有毒性药材（见附录IV）、无法定标准药材或有十八反、十九畏等配伍禁忌时，则应进行两种动物（啮齿类和非啮齿类）的长期毒性试验。,毒性药材,指导原则中所称毒性药材，系指入国务院 医疗用毒性药品管理办法 的中药品种。即：砒石、砒霜、水银、生马钱子、生川乌、生草乌、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘虫、红娘虫、生甘遂、生狼毒、生藤黄、生千金子、生天仙子、闹羊花、雪上一枝蒿、红升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、红粉、轻粉、雄黄。另外，凡在近年来发现的有毒性作用药材（原料）或在复方中含有明显有毒组份的均按毒性药材处理。,3改变国内已上市销售药品给药途径（不包括由非注射剂改为注射剂）的制剂、不改变给药途径的非注射给药改剂型制剂和改工艺制剂 若处方中各味药材均符合法定标准，无毒性药材，无十八反、十九畏等配伍禁忌，又未经化学处理（水、乙醇粗提除外），急毒试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应，临床实际用药期为1周以内者，可免做长期毒性试验。,临床用药超过一周，建议采用高剂量增设一个原给药途径、原剂型或原工艺对照组，先进行一种动物（啮齿类）的长期毒性试验。如发现与原给药途径、原剂型或原工艺制剂不同的明显毒性反应或更严重的毒性反应，应进行另一种动物（非啮齿类）的长期毒性试验研究,4增加新的适应症或者功能主治的品种 如需延长用药周期或增加剂量者，应结合原品种的申报资料及处方组成的情况确定是否需进行长期毒性试验研究及长期毒性试验研究的内容。,新药特殊毒性研究,（突变、生殖、致癌、药物依赖试验）,新药临床前特殊毒理学评价包括致突变试验、生殖毒性试验（致畸试验）、致癌试验和药物依赖性试验。,1. 突变试验 基本试验方法有三种： 1）微生物回复突变试验 即Ames试验，试验用菌株为组胺酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium），以TA97、TA98、TA100和TA102作为标准测试菌株。受试药物至少要设5个剂量组，应设空白、溶媒、阳性对照和代谢活化（S9）对照，实验至少重复一次。结果依据加入被测新药平皿中回变生长的菌落数并与空白对照平皿中的菌落数据相比较得出受试药物有无诱变性来判断。,2）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 用中国仓鼠肺细胞（CHL）在体外培养进行。观察染色体断裂后导致的结构和数目的异常称为染色体畸变。结果要求受试药物诱发的染色体畸变率与对照组比较有统计学意义并与剂量有相关性。 3）体内试验 啮齿动物微核（有丝分裂后期）试验，我国新药审批办法中要求做小鼠骨髓微核试验。 上述三项致突变试验结果全部阴性时，则不必往下进行。,2生殖毒性试验 1）一般生殖毒性试验（）试验在交配前给药，目的是评价生殖细胞接触药物（化合物）后对受胎能力。实验结果分析和评价包括：受孕率、死胎数、活胎数、活胎重量、性别、外观及内部器官的形态学观察和骨骼的检查。 2）致畸敏感期毒性试验（） 试验在器官发生期给药，旨在揭示药物可能的胚胎毒性和致畸性。大、小鼠孕后615天，家兔618天连续给药，。妊娠末期剖检。 3）围产期毒性试验（） 试验在围产期和哺乳期给药，于妊娠后期及整个泌乳期给药，即：大、小鼠于妊娠第15天开始，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）；家兔于妊娠第22天开始，至分娩后31天。所有雌性动物自然分娩，观察子代直至成年。,3. 致癌试验 致癌试验是一项复杂、细致的长期过程，应设空白对照，阳性对照药组（结构相近的已知致癌物），受试药物至少设3个剂量。,4、药物依赖性试验 包括身体依赖性与精神依赖性试验。 1）身体依赖性试验 自然戒断试验 需用小鼠、大鼠和猴3种动物，连续给予动物一段时间的受试药后突然停药，观察动物出现的戒断症状。 替代试验 给予动物代表药（如吗啡、巴比妥钠或苯巴比妥钠），使之产生身体依赖性后，停止给予代表药，以同样方式给予不同剂量受试药，观察替代期间动物的戒断症状。 催促试验 短时间内给予动物大剂量受试药，然后注射受体拮抗剂（钠洛酮）以催瘾，观察是否出现戒断症状及其程度。 诱导试验 诱发惊厥，包括：听源性发作（Audiogenic seizures）；戊四氮惊厥（Pentylenetetrazole）。对镇静催眠药产生身体依赖性的动物，在断药期间出现反跳性兴奋，用阈下刺激强度诱发惊厥。,2）精神依赖性试验 采用“自身给药”（觅药行为） 操作式条件行为试验，测定静脉注射药物对动物的强化效应，是当前国际上通用的评价药物精神依赖性潜力实验方法。,新药制剂安全性试验,（过敏、刺激、溶血试验）,制剂安全性（刺激性、过敏性和溶血性） 药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。是临床前安全性评价的组成部分。 毒性来源：药物的活性成分及其代谢物、辅料、杂质等及制剂理化性质（如pH值、渗透压等）。, 刺激性试验 1、定义 刺激性：非口服药物制剂对给药部位产生的可逆性炎症改变，给药部位不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。 2、刺激性试验设计 1）实验动物 一般每个试验选择一种动物进行评价。 2）给药的频率与期限 依据拟定临床应用情况决定。 重复给药 每天给药一次，给药期限最长不超过4周； 偶尔给药 单次给药试验。 3）可逆性 停药后恢复期观察（局部及相关部位）。 4）受试药和对照物 受试物与用于人体制剂一致。以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照。必要时采用阳性对照或已上市制剂。 5）剂量（浓度和总剂量） 设一个与临床制剂相同浓度剂量组，通过给药频率进行剂量调整。,6）给药方式 给药方案、途径和部位 应尽量与临床用药方案一致。 给药容积、速率和频率 根据剂量和动物给药部位的解剖和生理特点。 可在同一动物身上进行不同给药途径的刺激性试验，并可在对侧进行对照试验。条件：耐受性许可和无相互影响。 3、皮肤刺激性试验 1）经皮给药及可能接触皮肤的非口服给药制剂（直肠、阴道给药）应考虑进行皮肤刺激性试验。 2）在急性毒性验、长期毒性或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性，可不必进行单独的皮肤刺激性试验。,3）试验方法 动物 首选家兔48只，雌、雄各半，应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比。试验前24小时给药区（背部）进行左、右各3cm3cm脱毛（剪、剃或脱毛剂）。损伤皮肤不宜进行试验。在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度考察破损皮肤的刺激性。 给药 不宜通过增加涂敷厚度或加大涂布面积来提高给药剂量。取受试物0.5 ml直接涂于一侧去毛皮肤，用二层纱布（2.5 cm2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用胶布和绷带固定；另一侧涂赋型剂对照。贴敷时间至少4小时。贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。多次给药应连续同时辰，在同一部位给药，贴敷期限一般不超过4周。 观察 观察皮肤反应，按评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。 单次给药：去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察记录涂敷部位红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，延长观察期限，观察恢复情况和时间，但延长期不超过14天。出现皮肤刺激性中度以上的动物应对给药局部进行病理学检查。 多次给药：每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑、水肿、色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。持久性和中度以上损伤的观察同单次给药。,结果评价：单次给药计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分平均分值。将受试侧皮肤反应平均分值减去赋形剂皮肤平均分值得到原发性刺激指数，按表进行刺激强度评价。多次给药首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺激指数，进行刺激强度评价。,皮肤刺激反应评分标准,皮肤刺激强度评价标准,4） 试验报告 符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的皮肤反应积分；具体描述其它毒性反应；试验结论等。 5） 试验结果的解释 该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。,4. 注射给药部位刺激性试验 炎症、组织变性和坏死等不良反应。 1）试验方法 试验动物：家兔，每组（单次给药、多次给药）不少于3只。设生理盐水对照，用同体左右侧自身对比。 给药方法：途径与临床使用情况一致，可选用耳缘静脉，耳中心动脉、股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织等。给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过7天。 动物观察：单次给药，在给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药，每天给药前以及最后一次给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行病理学检查。留下的动物继续观察1421天再进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。 2）结果评价：根据肉眼观察和病理检查结果，对受试物进行安全性评价。 3）试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的刺激反应情况；具体描述其它毒性反应；试验结论等。, 眼刺激性试验 眼前部表面可逆性组织改变（炎症、变性和坏死等）。 1）试验方法 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时内对动物进行双眼检查（包括荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤动物弃用。 给药方法：每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受试物，然后合眼睑约10s。不需冲洗眼睛。用药周期根据拟临床情况决定，多次给药一般不超过4周。 眼部观察：单次给药，在给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查；多次给药，每天给药前以及最后一次给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查。如果在72小时未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限。但一般不超过21天。可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他器械进行眼刺激反应检查。在记录了24h的观察后，可进一步用荧光素染色检查。记录每次检查眼部反应的分值（见表）。观察部位：结膜、角膜、虹膜及其他。,2）结果评价：将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。,眼刺激反应分值标准,眼 刺 激 性 评 价 标 准,3）试验报告 内容包括：同上，每只动物在每一观察时间点的眼睛反应分值；具体描述毒性反应；试验结