课件：食品发酵培养基的修订后.ppt

食品发酵培养基的制备,背景资料,培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用配养料。 培养基的共性： （1）单位数量的培养基应能以最高产率生产出所需产物； （2）能最高速率地、稳定地合成出所需产物； （3）培养基的成分应价格便宜，且易于就近取材； （4）培养基应便于通风、搅拌、提取、纯化和进行废物处理等。,食品发酵培养基的成分及来源,1、碳源主要有糖类、油脂、有机酸、正烷烃等 2、氮源：:(1)有机氮源主要有铵盐、硝酸盐和氨水； （2）无机氮源主要来自一些廉价的原料比如花生饼粉等 3、无机盐与微量元素：C、H、O、N、P、S、K、Mn等,4、生长因子、前体和产物促进剂 （1）生长因子：从广义上讲凡是微生物生长不可缺少 的微量的有机物质，氨基酸、嘌呤嘧啶等； （2）前体：能直接被微生物合成到产物分子中去，自身结构并没有发生多大变化，但产量却有大的提高的化合物 （3）产物促进剂：非生长因子也非前体但加如后能提高产量的添加剂 5、水，对于发酵工厂来说恒定的水源很重要需考虑它的PH值、溶解氧等,培养基的类型,微生物培养基的种类据统计常用的在1700种以上 1、根据营养物质的来源 （1）用营养丰富的天然有机物质配制而成的天然培养基 （2）用已知其化学成分的各类营养物质定量配制而成的合成培养基 （3）在天然培养基中添加一些已知成分的营养物质的半合成培养基,2、根据营养机质的物理性状分类,液体培养基：将食用菌生长发育所需的营养物质按一定比列配制的营养液 固体培养基：一类是在液体培养基中加入凝固剂，一类是利用天然纤维物质或固形物制成的培养基 半固体培养基,3、根据培养基的用途分类 选择培养基、增值培养基、鉴别培养基 4、根据表面形状分类 斜面培养基、平面培养基、高层培养基,培养基的配置原则,总体原则：既能满足微生物的营养能获得优质高产的产 品，同时也符合增产节约、因地制宜的原则。 发酵培养基的主要作用是为了获得预期的产物,一、根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基（目的明确）,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基； 根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己的微生物学知识来配制最佳的培养基。,二、营养成分恰当配比（营养协调）,微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参据。微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。 在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律： 要素：H2OC源+能源 N 源 P、SK、Mg生长因子 含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6),营养配比应注意：,1、选择适宜的营养物质 实验室的常用培养基例如： 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 实验室一般培养：普通常用培养基； 遗传研究：成分清楚的合成培养基； 生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；,2、营养物质浓度及配比合适 营养物质的浓度适宜, 营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起 到抑制或杀菌作用。 培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（CN）的影响较大。 它不仅会影响微生物菌体的生长，也会影响发酵的代谢途径。,三、理化适宜,指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。 1、渗透压 渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。 它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（water potentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。 与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长； 高渗溶液会使细胞发生质壁分离； 低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。,2、pH值 各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。 通常培养条件：（初始pH ） 细菌： pH 7.08.0 放线菌：pH 7.58.5 酵母菌： pH 3.86.0 霉菌：pH 4.05.8 藻类： pH 6.07.0 原生动物： pH 6.08.0 嗜极菌（extremophiles） 在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。 3、氧化还原电位 又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。 不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同: 好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵。,四、配制顺序及其他,缓冲化合物主要元素微量元素维生素、氨基酸等生长素类的物质,二、固体培养基的配制过程,称量、溶解配制固体培养基调节pH值分装加棉塞制作斜面培养基和平板培养基 称量、溶解 根据培养基的配方，计算各种营养成分的用量，进行准确称量; 将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。,配制固体培养基 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。,调节pH值 待溶化的培养基稍冷却后，按配方要求调整pH。 取培养基(10ml)用NaOH调至所需pH值,分装 根据不同需要，可将己配好培养基分装入试管或锥形瓶内（斜面培养基装于试管中，平板、液体、半固体培养基装于锥形瓶内),分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。分装时，一只手轻放弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几只试管或锥形瓶，依次接取培养基。,分装量,斜面：装量为管长的1/4到1/3; 液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3; 三角瓶：装载量不超过容积的1/2.,加棉塞 1试管棉塞的制作 制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞(图513).,制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的23在试管内，13在试管外(图514)。 最后，用牛皮纸或报纸包住棉塞，在瓶颈或试管上方用绳扎紧，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉塞或使棉塞脱落。,制作斜面培养基和平板培养基 培养基灭菌后，液体培养基冷却后可直接根据需要接入菌种。如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。 1斜面的制作 将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图515)。斜面长度不超过试管长度12为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。 2平板的制作 将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多，温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板的制作应采用无菌操作，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左于同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，月左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12m1的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿、使培养基均匀分布于整个平皿中、冷凝后即成平板(图516)。,三、固体曲料的配置,曲料直接用固体原料加水拌成的固体培养基,曲料的原料选用 曲料的加水量 曲料pH值的调整,淀粉水解糖的制备方法,酸解法 酶解法 酸酶结合水解法,水解糖：在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过程为淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。 淀粉水解制糖的意义:大多数微生物不能直接利用淀粉，（如所有的氨基酸生产菌都不能直接利用淀粉）；有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行过程缓慢，发酵周期延长；若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。因此将淀粉水解为葡萄糖更便于微生物直接利用。,酸解法 酸解法又称算糖化法。它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温、高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。 酸水解法的优点:生产方便、设备要求简单、水解时间短、设备生产能力大。 对设备的要求：因为是在高温、高压及一定酸度条件下进行，所以设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压。 缺点：除水解反应外，有副反应发生，造成葡萄糖的损失而使淀粉转化率降低。对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。, 酶解法 酶解法是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。 酶解法分为两步： 液化：利用-淀粉酶将淀粉液化，转化为糊精或低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。 糖化：利用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精及低聚糖进一步水解，转化为葡萄糖，这个过程在生产中称为糖化。 酶解法的优点： 酶解反应条件温和，因此，不许耐高温、耐高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易运作。 微生物酶作用的专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率高。 可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。 制得的糖液颜色浅，较纯净，无异味，质量高，有利于糖液的充分利用。, 酸酶结合水解法,酸酶结合水解法是集中酸解法和酶解法制糖的优点而采用的结合的生产工艺。酸酶结合水解法又分为酸酶水解法和酶酸水解法,酸酶水解法： 是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。 其优点是： 酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高。,酶酸水解法： 是将淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。 其优点是： 可采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸解法要高，生产易控制，时间短，糖液色浅。 （注：酶酸水解法酸水解时pH值可稍高些，以减轻淀粉水解副反应的发生。）,液化：一般采用耐高温淀粉（8590），使液化速度加快 淀粉的糊化：指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。 淀粉老化：指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程, 酸酶结合水解法 酸酶结合水解法是集中酸解法和酶解法制糖的优点而采用的结合的生产工艺。酸酶结合水解法又分为酸酶水解法和酶酸水解法 酸酶水解法：是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。 其优点是：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高。 酶酸水解法：是将淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。 其优点是：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸解法要高，生产易控制，时间短，糖液色浅。 （注：酶酸水解法酸水解时pH值可稍高些，以减轻淀粉水解副反应的发生。）,淀粉糖水解过程中涉及的术语,DE值：及葡萄糖当量值，指还原糖（以葡萄糖计）占糖浆干物质的百分比，或淀粉的含量。 计算式： DE=还原糖的含量（）干物质的含量（）100 （） DE值越高葡萄糖浆级别越高 工业也表示淀粉水解程度跟糖化程度,三、淀粉水解糖的制备原理,（一）酸解法制备原理 1、水解过程 总反应式：（C6H10O5）n + nH2o n C6H10O6 过程：（C6H10O5）n （C6H10O5）x C12H22O11 C6H10O6 淀 粉 糊 精 麦芽糖 葡萄糖 H+对作用点无选择性，-1，4糖苷键和-1，6糖苷键均被切断。,2、葡萄糖的复合反应和分解反应,影响：降低了葡萄糖的收率； 使产物的提取和糖化液的精制变得 困难。,（二）酶解法制备原理,1、液化程度的控制 思考：-淀粉酶将淀粉液化，转化为糊精及低聚糖，可以继续液化得到最终产物葡萄糖和麦芽糖而不进行糖化？,答：不可以，如果让液化继续持续下去，虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖，但可能出现： 由于-淀粉酶不能水解-1，6糖苷键，从而使糖液的DE值较低； 液化在较高温度下进行，液化时间加长，一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态，产生老化，使糖化酶难以作用。,液化的目的：为了给糖化酶的作用创造条件，糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时，需先与底物分子生成络合结构，然后发生水解，这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围，才有利于糖化酶生成络合结构，底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。,DE值：20%30% 液化终点：碘液判断，呈棕色。 灭酶处理： 升温到100，保持10min，然后降温，供糖化使用。,2、糖化,糖化酶从非还原性末端水解-1，4糖苷键和-1，6糖苷键。 终点：由DE值确定，当DE值达最高时（即DE值不再上升时），停止酶反应。 糖化的温度（5060）和pH值（4.05.0）取决于所用糖化剂的性质。,（三）酸酶结合水解法制备原理,1、酸酶水解法 酸水解 糖化酶水解 （C6H10O5）n （C6H10O5）x C6H10O6 淀 粉 糊精或低聚糖 葡萄糖 适用于淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料。,2、酶酸水解法,先用-淀粉酶液化，再用酸水解。 适用于颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料,四、淀粉水解糖的制备工艺,酸法工艺 酸酶法工艺 双酶法工艺,（一）酸法工艺 该工艺是以酸作为水解淀粉的催化剂，使得淀粉在酸的作用下逐渐生成葡萄糖、麦芽糖和各种相对分子质量较低的葡萄糖多聚物。 1、酸法工艺流程 淀粉调浆糖化中和第一次脱色过滤离子交换第一次浓缩第二次脱色过滤 第二次浓缩成品,2、操作要点 淀粉原料要求 常用纯度较高的玉米淀粉，次之为马铃薯淀粉和甘薯淀粉。 调浆 在调浆罐中，先加部分的水，在搅拌的条件下，加入粉碎的干淀粉或湿淀粉，投料完毕，继续加入80左右的水，使淀粉乳的浓度达到2224 B,然后加入盐酸或硫酸调 Phz值为1.8。调浆需用软水，以免产生较多的磷酸盐使糖液混浊。 糖化 将已经配好的调浆液经泵送入耐酸加压糖化罐。边加料边开蒸汽，进料完毕后升压至（2.72.8）Pa( 温度142144).在升压过程中每升压0.98Pa，开排气阀约0.5min,排除冷空气，待排除白烟时关闭，并借此使糖化醪翻腾，受热均匀。待升压至要求压力时保持35min后，及时取样测定其DE值，达到38%40%时糖化终止。,中和 在中和桶中进行，用10%碳酸钠中和。分别以盐酸、硫酸水解者，所生成的氯化钙溶于糖液，硫酸钙可以过滤除去。调节pH值到蛋白质的凝固点，使蛋白质凝固过滤除去，保持糖液清晰。 第一次脱色过滤 待中和糖液冷却到70 75，调节pH值至4.5，加入0.25%干物质量的粉末活性炭，搅拌约5min，压入板框压滤机或卧式密闭圆桶形过滤机过滤。 离子交换 通过阳阴阳阴四个离子交换柱进行脱盐提纯。 第一次浓缩 将已经提纯的糖液的pH值调至3.84.2，用泵送入蒸发罐，保持真空度在66.661Pa以上，加热，蒸汽压不超过0.98Pa，浓缩到2831B，出料。 第二次脱色过滤 与第一次一样，但第二次脱色必须反复回流过滤至无活性炭为止，再调pH值调至3.84.2。 第二次浓缩 在浓缩前加入，使得糖液中的含量为0.0015%0.004%，以起护色及漂白作用。蒸发至3638 B，出料，即成品。,（二）酸酶法工艺,在酸法液化时，控制水解反应，使得DE值在20%25%时即停止水解，迅速进行中和。调节 pH 值在4.5左右，温度为5560后加入葡萄糖淀粉酶进行糖化，直至所需的DE值，然后升温、灭酶、脱色、离子交换、浓缩。,（三）双酶法工艺,工艺流程 淀粉调浆液化糖化脱色离子交换真空浓缩 缺点： 设备腐蚀严重 反应生成的副产物较多 使用原料局限在淀粉,五、淀粉水解糖的质量要求,水解糖液的质量指标 色泽：浅黄、杏黄色、透明液 糊精反应：无 还原糖含量：18左右 DE值：90 透光率：60以上 PH：4.6至4.8,淀粉水解糖质量对发酵的影响,1、若淀粉水解不完全，有糊精存在，不仅造成浪费，而且会产生大量气泡，影响发酵正常进行； 2、淀粉水解过度，葡萄糖会发生复合反应，生成的龙胆二糖等物质非发酵性糖；葡萄糖还会发生反应生成羟甲基糠醛，并与氨基酸进一步反应生成类黑素。这些都会造成浪费，而且还会抑制菌体生长。 3、若原料中蛋白质含量多，当糖液中和、过滤时去除蛋白质不彻底，培养基中含有蛋白质及其水解产物时，会使发酵液产生大量气泡，造成逃液和染菌。,拓展,中文名称：龙胆二糖 英文名称：gentiobiose 定义：两个D-吡喃葡萄糖通过-1,6-糖苷键相连而形成的二糖。龙胆三糖经转化酶水解切去果糖，即成为龙胆二糖。 结构式：,中文名称：异麦芽糖 英文名称：Isomaltose 定义：两个葡萄糖分子以-1，6糖苷键连接起来的双糖。 结构式：,麦芽糖和异麦芽糖的