课件：大肠杆菌基因工程 (2).ppt

基因工程 Genetic Engineering,主讲教师：李黄金 /jpkc/2012/jygc/ Email: 任课教师：张文峰、陈伟 生命科学与生物制药学院 13,第三章 大肠杆菌基因工程,Escherichia coli （SEM，14000）,四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化,三、工程菌构建策略,二、大肠杆菌表达系统高效表达原理,一、 大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点,五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例,第三章 大肠杆菌基因工程,工程菌构建 发酵工艺研究 分离纯化工艺研究,四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化,工程菌构建研究内容与技术路线,目的蛋白分析,表达载体与宿主菌株选择,目的基因的获得与优化,表达载体构建与分析,转化与表达筛选,工程菌稳定性分析,表达产物确证,工程菌菌种保存,1、目的蛋白分析： 糖基化？难表达？难复性？药用？ 1)理化特性() *分子大小：5KD、100KD难表达（融合表达、截短表达） *氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达（用真核系统） *疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统） 2)生物学特性：膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）,工程菌构建主要研究内容,3)用途 药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达） 工业用：产量、成本（包涵体、独立表达） 研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）,工程菌构建主要研究内容,2、选择表达载体与宿主菌株： 1）表达载体选择 启动子、标签、标记基因、拷贝数等。 需要可溶表达时采用弱启动子，T7启动子最强，PL/PR热激诱导不宜工业化。 从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。 药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。 4）宿主菌：符合表达要求（T7 RNA酶溶源？可溶？稀有密码tRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。,工程菌构建主要研究内容,3、目的基因获得、分析与优化 克隆、合成、索要？,工程菌构建主要研究内容,翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断 GC含量：70%时表达水平低 二级结构 ： mRNA 二级结构抑制翻译的起始或终止。 基因或者蛋白的大小：一般说来小于 5kD 或者大于 100kD 的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。 疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。 N端和C端稳定性 ：人为突变末端残基。,4、表达载体构建与分析 1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建 PCR扩增目的基因： *引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。 *是否需要目的基因带入ATG和TAA？是否要对框？ 2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析 3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析,工程菌构建主要研究内容,pET21a质粒物理图谱,pET21a质粒多克隆位点与表达盒,pET32a质粒物理图谱,pET32a质粒多克隆位点与表达盒,M 1 2 3 4,目的基因： VL-, 表达载体：pET32a M：Maker，1kb lader 1：PCR产物，引物含NcoI、HindIII 2：HindIII单酶切pET32a质粒 3：NcoI-HindIII双酶切重组子 4：HindIII单酶切重组子,pET32a-VL-酶切鉴定,5、转化与表达筛选 1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！） 2）表达筛选：以表达水平（%）为指标。 表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百 分数 测定方法：SDS-PAGE+凝胶扫描分析,工程菌构建主要研究内容,6、表达产物确证 1）基本要求：SDS-PAGE + Western-Blot 2）特殊要求（如基因工程药物）： A、结构：末端顺序（N-端15个/C端3个）、氨基 酸组成、肽图等 B、理化特性：分子量（SDS-PAGE、质谱）、等电点、 紫外特征吸收峰等 C、生物学活性,工程菌构建主要内容,基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,改善工程菌不稳定性的策略,大肠杆菌工程菌的不稳定性,工程菌遗传稳定性分析,7、工程菌遗传稳定性分析,工程菌遗传不稳定性的表现形式,结构不稳定性,重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、产物结构改变）,分配不稳定性（主要）,整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。导致表达水平下降。,重组质粒的逃逸：,工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。 重组质粒的宏观逃逸率： 工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。 宏观逃逸率（%）=,非选择性平板菌落数-选择性平板菌落数,非选择性平板菌落数,100,关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序,重组质粒逃逸的原因,环境因素诱导的重组质粒渗漏 高温、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）,目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应,目的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。,目的基因本底表达产物引起的毒性反应,抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。,重组质粒结构不稳定性的产生原因,宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNA分子的破坏,环境因素诱导的突变,宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,改善基因工程菌不稳定性的策略,1、改进载体-宿主系统,选择性地杀死无质粒细胞 如敲除宿主基因组致死性基因（如ssb基因，缺失无法DNA复制），并将其改由表达载体提供,正确设置载体上的多克隆位点，避免DNA片段插在稳定区内,选择特定质粒最适宿主菌株,使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步),改善基因工程菌不稳定性的策略,2、施加选择压力,根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素,药物和食品生产时不宜使用抗生素,采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基不含该营,养组份,改善基因工程菌不稳定性的策略,3、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定,4、优化工程菌的培养工艺,培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定,培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析： A、存在状况：宏观逃逸率 B、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析 C、功能完整性： 表达产物免疫特异性（western blotting) 表达水平（%）,工程菌遗传稳定性分析,1、原始菌种保存： 实验室构建而来。冻干、-70保存。表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。 2、主细胞库（master cell bank,MCB）： 由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。 冻干、-70保存。 3、工作细胞库（working cell bank, WCB）: 由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生产用。甘油种，-70保存。,8、工程菌菌种保存（三级种子库）,工程菌生长与表达主要影响因素 工程菌摇瓶水平生长与表达试验 工程菌工业发酵工艺研究,工程菌发酵工艺研究,1、培养基 2、菌龄与接种量 3、pH值、温度与溶解氧 4、诱导时机与收菌时机,工程菌生长与表达主要影响因素,工程菌生长曲线与表达曲线分析,生长曲线 纵坐标：生物量（细胞密度OD600、干重/体积、湿重/体积） 横坐标：培养时间（小时） 时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期 表达曲线 纵坐标：表达水平（%）、活性单位/体积 横坐标：培养时间（小时）,1、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。 氮源： 有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆 无机氮： 氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等,工程菌生长与表达主要影响因素,2、菌龄与接种量 菌龄：自接种起培养的时间（小时） 影响停滞期、质粒宏观逃逸率 接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比 接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高 接种量过大：菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后 期菌体的生长，降低表达水平。,3、pH值、温度与溶解氧 pH值：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。 生长最适pH范围在6.8-7.4，表达最适pH为6.0-6.5 温度：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。 生长最适37，较低温度利于可溶性表达。 溶解氧：影响生长速度和表达水平,4、诱导时机与收菌时机 诱导时机：过早影响生物量、过晚影响表达水平 一般在生长曲线对数中期或对数后期进行诱导 收菌时机：过早影响表达水平、过晚影响产物稳定 性、可溶性、并造成浪费。 一般在表达曲线平台期（诱导后3-4小时）收菌,主要研究参数： 培养基、接种量、pH值、温度、诱导与收菌时机等 主要观察指标 表达水平（%）、生物量、表达产物积累（包涵体形成）情况、质粒宏观逃逸率等 结果：生长曲线与表达曲线,工程菌摇瓶水平生长与表达试验,基本要求： 高表达、高生物量、便于放大、低成本 重点问题： 1）质粒稳定性问题 2）表达与生长的矛盾问题 3）发酵方式问题： 分批式or流加式发酵？常规发酵or高密度发酵？,工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：,工程菌工业发酵工