课件：核酸的提取.pptVIP

,核酸的提取,第一节 基因组DNA的提取,制备基因组DNA是研究基因结构和功能的重要步骤 Southern分析 基因文库 大分子量DNA通常要求达到片段的分子量100-200 kb,高纯度且完整的RNA用途： Northern分析 mRNA纯化 cDNA合成 体外转录 研究基因在转录水平上的调控的重要环节,1.核酸的含量,一、基本原理,RNA在组织重含量：,2.核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时， 常用此法分离这两种核蛋白。,3、核酸制备的一般原则 分离纯化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。,核酸制备的关键: 1保持低温（04），缩短提取过程 2防止化学（过酸、过碱），避免机械（剧烈搅拌）降解。 3防止核酸酶的作用。,4.核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,5.核酸提取的一般过程,破碎细胞,提取,纯化,I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,1）材料的选择 动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、质粒DNA） 动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA RNA来源：新鲜组织或细胞,2）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可 使细胞壁破碎。 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制,3）破碎抽提核酸除去杂质 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白、与其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离 3除去脂类 4多糖的除去,4）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,5）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 水,6.基因组DNA的常用提取方法 CTAB法 SDS法 其他,一、基因组DNA-CTAB法,（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液（ Nacl 0.7mol/L ）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,CTAB提取缓冲液的经典配方,（2）试剂的作用 Tris-Hcl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； Nacl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中 -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离,氯仿还可加速有机相与水相的分层。 异戊醇：抑制界面泡沫的形成。 交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。 标准程序：酚酚-氯仿氯仿。,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效地去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,（3）CTAB法流程图,二、基因组DNA-SDS法,（1）原理 SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55 -65）条件下能裂解细胞细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。,提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。 上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。 然后用RNase酶除去RNA即可得到较纯的DNA.,1）防止和抑制内源Dnase对DNA的降解；只需加入一定浓度的螯合剂如EDTA，因为几乎所有Dnase 都需要Mg2+或Mn2+为辅助因子。,DNA提取方法很多，实验采用酚抽提法。其基本原理是超低温粉碎，通过蛋白酶K和SDS消化，破碎细胞，再用酚/氯仿去除蛋白质。,2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在操作过程中尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔，进行DNA溶液转移时用大口吸管。,SDS法DNA提取缓冲液,（2）SDS法流程图（以动物组织为例）,三、基因组DNA-其他方法,根据细胞裂解方式的不同有： 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法。 生物方式：酶法。,根据核酸分离纯化方式的不同有：,吸附材料结合法： 硅质材料 高盐低PH值结合膜，低盐高PH值洗脱。快速高效。 阴离子交换树脂 低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,浓盐法 利用RNP和DNP在盐溶液（1M 氯化纳中溶解度不同，将二者分离。 有机溶剂抽提法： 有机溶剂（苯酚）作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 密度梯度离心法 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,DNP在NaCl中的溶解度,质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法,细胞器DNA-差速离心法 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，他们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离出来。,举例（提取细菌的DNA）,一、试验的实验试剂及仪器,1.试剂 溶液I（50mm/L，glucose，25mmol/L，tris0HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA） 溶菌酶（100mg/ml），蛋白酶K（10mg/ml） 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）3M醋酸钠 无水乙醇 含RNaseA（10mg/ml）的TE， LB培养基， 70%乙醇 2.仪器 超净工作台，微量取液器， 高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅，冰箱，制冰机，恒温摇床，漩涡震荡仪，烘箱，电泳仪,二、材料、设备及试剂 菌种 ：DBT降解菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A 、无水乙醇,三、操作步骤 1、1.5ml菌液（每组两管）4 12000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37 水浴30min。 3、每管加入132l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。,5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀后13000rpm离心3min，除去苯酚。 6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置20冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400l 70乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50lTE （含20g/ml的Rnase）溶解DNA，20冰箱放置备用。,电泳 琼脂糖电泳，采用0.8%的琼脂糖，0.5TBE缓冲液，100V电泳10min，观察电泳谱带。,四、实验的结果,7.注意事项,（1）细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,注意事项,（2）核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,注意事项,（3）核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,8. DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对 策,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：DNA降解,对 策,原因,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,对 策,原因,问题四：DNA断裂为小片段,1.机械张力或高温 2.细胞内源DNA酶的作用 3.化学因素也会降解DNA 如过酸的条件下,1.动作轻缓，避免过多的溶液转移，剧烈的震荡等。同时也应避免过高的温度，所用的枪头口不能太小(孔径有5mm左右)。 2. 在溶液中加入EDTA，SDS以及蛋白酶等。 3. 应避免使用过酸的条件。尽量减少酚/氯仿抽提，,对 策,原因,思考,1简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。 2.沉淀时为什么要用无水乙醇？ 3.为了获得较为完整的基因组在实验中应注意什么问题？ 4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?,一、质粒(Plasmid) 的概念： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 质粒（plasmid）大小在1kb200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。,第二节 质粒的提取,DNA超螺旋结构,质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。,1 共价闭合环行DNA（cccDNA, SC构型) 两条多核苷酸链均保持着完整环形结构,呈现超螺旋的； 2 开环DNA（ocDNA,OC构型） 两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口； 3 线性分子（LDNA, 通称L构型) 双链断裂，在体内，质粒DNA是以超螺旋构型存在的。,二、质粒的构型：,L构型 松弛线性的 DNA,OC构型 松弛开环的 DNA,SC构型 共价闭合环形的超螺旋DNA (cccDNA),在电场中，在中性pH值下，带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率与其分子大小、构型、电压、胶浓度有关。,OC构型,SC构型,L构型,质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图,质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。,1. 提纯的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 杂质： 蛋白：加蛋白质变性剂（酚、氯仿）沉淀蛋白 基因组DNA：碱变性+酸复性，分子量差异导致复性差异 脂类及小分子杂质 RNA ：pH和Rnase,三、提取质粒的原理,2.细菌裂解的方法： 碱裂解法0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求,3.碱裂解法 质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋闭合环状的特点。 碱变性条件下，染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开，双链不会完全分离。 pH调至中性，变性的质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。,染色体双链完全分开,质粒DNA为拓扑缠绕态不能分开,线状染色体DNA难复性,迅速准确配对，恢复天然超螺旋分子,染色体、变性蛋白质、RNA分子一起沉淀,上清中,SDS、加溶液II (氢氧化钠) 破坏碱基配对,加溶液 (醋酸) 中和碱性NaOH,离心,染色体,试剂,质粒,4.煮沸法 染色体DNA比质粒DNA大得多。当加热时 ，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，质粒DNA虽也变性但在冷却时即恢复其天然构象。 变性长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,四、碱裂解法,包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需),剧烈振荡,新鲜配制,1.实验流程,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,（一） 细菌培养与质粒扩增,1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37振荡培养3-4小时（OD6001.0）,（二） 质粒提取,取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4，30sec 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，剧烈振荡 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上,5.加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50L TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20保存）,2.各种溶液成分和作用,溶液I（溶菌液） 50 mM葡萄糖 25 mM Tris-Cl 10 mM EDTA，pH 8.0； 水浴 pH 8.0 剧烈震荡 10分钟 溶液粘稠浑浊,溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解细胞壁肽聚糖中的-1,4糖苷键。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合金属离子，抑制Dnase的活性（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,溶液II（NaOHSDS液） 0.2 N NaOH 1% SDS； 现配现用 切勿振荡！颠倒混匀 T5分钟 SDS包被,NaOH：当5pH9时，核酸是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，pH=12.6，DNA与质粒DNA的变性。 SDS：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制Rnase，必须把它去除干净，,溶液III， （3molL NaAc（pH4.8）溶液） 3 M 醋酸钠 2 M 醋酸,溶液III 用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使质粒DNA能够复性，并能稳定存在。 而高盐的3molL NaAc有利于变性染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀。Na+中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。,五、注意事项 1.材料准备,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）菌不能太老，因为衰老期的菌体其内源性DNase的释入，使得不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）,2.细胞裂解,菌体量适当。 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。 G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。,3.核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,4.核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解,菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,六、质粒DNA提取常见问题,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对 策,混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA,不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。,六、质粒DNA提取常见问题,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原 因,对 策,1. 简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 2. 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？,七、问题与讨论,第三节 RNA的提取,RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%,1.RNA不稳定的原因：,RNA分子可自发水解: 特别在碱性条件下很容易通过2-OH形成2、3磷酸二酯（环），即使无Rnase存在，RNA在溶液中的稳定性也很低。,Rnase 对RNA的降解作用: 2-OH，且不需要二价金属离子的参与。 Rnase为较小的单链蛋白（约220AA），尤其是含有较多的二硫键（4对），10020min不会失活，高压灭菌也不能使之变性。,一、去除Rnase方法,组织（样品） 灰尘 实验器皿 试剂 人体汗液 皮肤 手指 唾液 ,Rnase分布广泛：,2.消除Rnase的活性方法：,（1）对于外源Rnase：,器皿和材料,塑料器皿（如离心管、Tip头、eppendorf管） 其它不能用高温烤的材料。,玻璃器皿： 200干烤6-12 h,器皿和材料,加入DEPC至 0.1%浓度 然后剧烈振荡20min或室温过夜 煮沸15min或高压灭菌以消除残余的DEPC,试 剂 ,否则DEPC与腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 DEPC是Rnase的化学修饰剂，它与Rnase的活性基团组氨酸咪唑环反应而抑制Rnase的活性。,（2）对于内源Rnase：,根据实验特点采用不同方法： 如体外转录等实验中加入Rnase的专一抑制剂(Rnasin)： 对于RNA的分离制备可采用非特异的蛋白变性剂、蛋白酶K、阴离子去污剂。,二、实验原理,细胞内RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。 制备RNA时，必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。 由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和苯酚法。,异硫氰酸胍/苯酚法（Trizol法）原理 裂解细胞：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； b. 沉淀Pro等杂质：有机溶剂抽提，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。,多糖如何去除？,多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用聚乙二醇或异丙醇代替乙醇沉淀DNA。,多酚如何去除,多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除： 70的乙醇洗涤,如何去除DNA？,分离DNA与RNA：释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 在与组织/细胞匀浆后加氯仿分相时， 如果pH5.2，则DNA会部分分配在水相， Trizol的成分主要是异硫氰酸胍，-巯基乙醇等RNase的抑制剂+十二烷基肌氨酸钠等表面活性剂+乙酸饱和酚和pH缓冲成分NaAc，整个试剂的pH在44.5之间,原理关键,氯仿的作用: 一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀,同时也通过变性作用抑制RNase活性； 二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉； 三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,d.沉淀RNA，核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性.多糖，蛋白等不沉淀，(一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留) 有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。,乙醇、异丙醇沉 淀核酸的区别？,异丙醇0.6V1V就够了，乙醇需要至少2V，一般需要2.5倍体积。 异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。这可以最大程度的降低盐的共沉淀降，,多次用75%乙醇 洗涤的目的？,洗涤目的： 去除盐离子 去除残存的有机溶剂和水,超低温下粉碎； 再采用盐酸胍、酚、氯仿等变性试剂，将蛋白质溶解、变性，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，并抑制了Rnase活力； 超速离心后RNA选择性进入无DNA和蛋白质的水相， 再用异丙醇沉淀浓缩。,硅胶膜纯化法 DNA，RNA在高盐低PH的条件下，能吸附到膜表面，低盐和高PH的条件下DNA,RNA可以被洗脱下来。,（四）核酸的洗涤 1）洗涤原理洗涤，首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。,差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。这步，切忌用手甩，这样容易将核酸甩掉。 乙醇浓度的选择也非常重要，一般情况，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。,（五）核酸的溶解和保存 1）核酸溶解：纯化后的核酸，其中 RNA 以水溶解为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。,）核酸保存：基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般的我们选择，-20 或70 保存的稳定。 如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适)。,检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。 紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，,RNA的提取步骤,取50-100mg样品于研钵中 加液氮浸泡并磨成粉末 转入1.5ml ep管中，加1 ml Trizol，剧烈振荡，放置5分钟 加0.2 ml氯仿，剧烈振荡15秒，12000 rpm 30秒 吸水相于一新1.5ml eppendorf中，加0.5ml 异丙醇，于-20放置30min 12000 rpm 10分钟 弃上清液，加1ml 75%乙醇，混合，12000 rpm 2min 弃上清液，室温干燥沉淀，加20100ul水，于-20下贮存。,三、影响RNA提取的因素,RNA的分布,(1)材料：（样品的收集/保存 ） 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，70短期保存,（2）样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,四、RNA的提取试剂作用 Trizol 异硫氰酸胍：蛋白质强变性剂使细胞结构迅速被破坏，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 苯酚:主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 -巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。,氯仿：蛋白质变性剂；除去苯酚； 异 丙 醇： 沉淀RNA，脱去RNA/DNA分子结合水；不易挥发，可用75%乙醇洗脱； 75%乙醇： 除去盐份及异丙醇和水； 酸性条件： RNA游离，DNA和蛋白质沉淀；,五、RNA的提取质量,RNA纯度和完整性： OD260/OD280=1.7-2.0； 甲醛变性电泳。 OD260=1，RNA样品浓度=40ug/ml,RNA的保存： 在去离子甲酰氨（100%），-70可放置6个月，用时加入4倍体积乙醇沉淀。,23s最亮，并且亮度是18s的约倍，5s最暗,理论上，完整的 RNA 拥有 28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分资料则强调 28S:18S = 2:1 的比例,为避免RNA酶污染，提取RNA所有的试剂和用具物品必须是专用的，实验环境要清洁； 带手套进行操作，并勤